一种牛源抗金黄色葡萄球菌LukD毒力因子的单链抗体及其制备和应用的制作方法

一种牛源抗金黄色葡萄球菌lukd毒力因子的单链抗体及其制备和应用
技术领域
1.本发明属于牛源抗体药物领域，尤其是涉及一种一种牛源抗金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)lukd毒力因子的单链抗体及其制备和应用。本发明具体涉及牛源抗金黄色葡萄球菌lukd毒力因子的单链抗体、筛选该单链抗体的载体和宿主细胞、该单链抗体的制备方法以及该单链抗体的用途。


背景技术：

2.单链抗体是一种基因工程抗体，通过dna重组技术将抗体轻链可变区vl和重链可变区vh通过一段连接短肽linker首尾连接而成，是保留完整抗原结合部位的最小功能片段。单链抗体的表达形式主要有融合表达，胞内表达和分泌表达三种形式。和完整抗体相比，单链抗体具有以下优点：1)分子量小，大小仅为完整抗体的六分之一，免疫原性较低；2)组织穿透力强，容易进入实体瘤周围的微循环；3)血液清除快，肾脏蓄积很少；4)无fc段，非特异结合低；5)易于通过基因工程大量生产；6)易于基因操作，更易构建重组免疫毒素。
3.奶牛乳腺炎是影响奶牛业发展，给乳品生产造成巨大损失的一种常见多发病。引起奶牛乳腺炎的致病菌很多，其中金黄色葡萄球菌是最重要的致病菌之一，流行率达到了50％，导致严重的经济损失。因为金黄色葡萄球菌具有传染性，且治疗用的抗生素易产生耐药性，所以很难彻底治愈。目前针对金黄色葡萄球菌全菌和多种毒力因子的疫苗也用于奶牛乳腺炎的预防，但是效果均不理想。单链抗体等基因工程抗体，以其独特的抗病毒和抗细菌作用及其能够大规模工程化制备的优势，显示了巨大的研发抗细菌药物的潜力，受到该领域高度重视。但是目前并没有抗金黄色葡萄球菌的基因工程单链抗体。


技术实现要素：

4.为了克服上述现有技术存在的缺陷，本发明提供一种牛源抗金黄色葡萄球菌lukd毒力因子的单链抗体及其制备方法与用途。
5.本发明具体提供牛源抗金黄色葡萄球菌lukd毒力因子的单链抗体、筛选该单链抗体的载体和宿主细胞、该单链抗体的制备方法以及该单链抗体的用途。
6.本发明提供的单链抗体能与金黄色葡萄球菌双组分杀白细胞素luked的f组分(lukd)特异性结合，并具有一定的抑菌活性，能够用于制备抗金黄色葡萄球菌引起的奶牛乳腺炎的相关药物中。
7.本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
8.本发明首先提供一种牛源抗金黄色葡萄球菌lukd毒力因子的单链抗体，其至少具有如seq id no.1所示氨基酸序列的轻链可变区(vl)、如seq id no.2所示氨基酸序列的重链可变区(vh)和位于轻链可变区与重链可变区之间的中间连接肽(linker)。
9.在本发明的一个实施方式中，所述牛源抗金黄色葡萄球菌lukd毒力因子的单链抗体的结构为vl
‑
linker
‑
vh。
10.在本发明的一个实施方式中，所述中间连接肽的氨基酸序列如seq id no.3所示。
11.在本发明的一个实施方式中，所述牛源抗金黄色葡萄球菌lukd毒力因子的单链抗体具有如seq id no.4所示的氨基酸序列。
12.在本发明的一个实施方式中，所述牛源抗金黄色葡萄球菌lukd毒力因子的单链抗体为牛源性抗金黄色葡萄球菌双组分杀白细胞素luked的f组分(lukd)的单链抗体。
13.所述牛源抗金黄色葡萄球菌lukd毒力因子的单链抗体能够与金葡菌双组分杀白细胞素luked的f组分(lukd)特异性结合，且具有一定的抑制金葡菌致病活性。
14.将该单链抗体与金黄色葡萄球菌混合后，作用于牛乳腺上皮细胞，可抑制金黄色葡萄球菌对牛乳腺上皮细胞的细胞毒性作用。
15.在本发明的一个实施方式中，为了方便地对单链抗体进行检测纯化和进一步的操作，可以在上述序列的基础上进一步设计酶切位点和识别序列，与pcantab5e载体连接时，优选的切酶位点为sfi i和not i，其中sfi i：ggcccagccggcc，not i：gcggccgc。与pgex
‑
4t
‑
1载体连接时，优选的酶切位点为ecor i和xho i，其中ecor i：gaattc，xho i：ctcgag。
16.本发明的再一目的是提供一种核酸片段，所述核酸片段编码所述牛源抗金黄色葡萄球菌lukd毒力因子的单链抗体。
17.本发明的再一目的是提供用于扩增获得所述牛源抗金黄色葡萄球菌lukd毒力因子的单链抗体的引物组，包括用于扩增单链抗体轻链可变区的引物，和用于扩增单链抗体重链可变区的引物，其中引物vh f和vh r用于扩增重链可变区；引物vl f和vl r用于扩增轻链可变区，
18.其中，vlf、vh r分别含有sfi i和not i酶切位点；vh f、vl r含互补的linker序列，
19.其中，引物vh f的序列为：
[0020]5′‑
ggcggtggtggatccggtggcggcggatctcaggtgcagctgcg
‑3′
[0021]
引物vh r的序列为：
[0022]5′‑
ttgcggccgcactagtggaggagacggtgaccag
‑3′
[0023]
引物vl f的序列为：
[0024]5′‑
gtggcccagccggccatggcccaggctgtgctgactcag
‑3′
[0025]
引物vl r的序列为：
[0026]
5'
‑
agatccgccgccaccggatccaccaccgcccgagccaccgccacctaggacggtcagtgtggt
‑3′
。
[0027]
在本发明的一个实施方式中，vh和vl基因的扩增方法为：以cdna为模版，vh f、vh r为引物扩增vh基因；vl f、vl r为引物扩增vl基因。
[0028]
在本发明的一个实施方式中，vh和vl基因的扩增的pcr反应体系为25μl：2
×
pcr mix 12.5μl，模版cdna 2μl，上下游引物(25μm)各1μl，ddh2o 8.5μl。扩增程序如下：95℃预变性3min；94℃变性40s，64℃退火40s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min。
[0029]
本发明的再一目的是提供一种含有编码上述单链抗体基因的载体，上述载体为噬菌粒载体，优选为pcantab5e载体。
[0030]
本发明的再一目的是提供一种由上述噬菌粒载体转化的宿主细胞：tg1细胞。
[0031]
本发明的再一目的是提供一种制备所述牛源抗金黄色葡萄球菌lukd毒力因子的
单链抗体的方法，包括以下步骤：
[0032]
(1)采用rt
‑
pcr直接从患奶牛乳腺炎的外周血单个核细胞rna中扩增出牛抗体编码基因的重链可变区基因和轻链可变区基因；
[0033]
(2)利用soe
‑
pcr法将中间连接肽linker与重链可变区vh基因和轻链可变区vl基因相连构建牛源性单链抗体基因，其重组连接顺序是vl
‑
linker
‑
vh；
[0034]
(3)将步骤(2)的牛源性单链抗体基因克隆到噬菌粒载体pcantab5e中，构建重组质粒；
[0035]
(4)将步骤(3)的重组质粒转化入大肠杆菌，培养并用辅助噬菌体扩增建立初级单链抗体文库；
[0036]
(5)用金黄色葡萄球菌双组分杀白细胞素luked的f组分lukd作为包被抗原，富集淘选3
‑
5轮，得到克隆；
[0037]
(6)采用phage elisa，用金黄色葡萄球菌双组分杀白细胞素luked的f组分lukd作为包被抗原，筛选阳性克隆；
[0038]
(7)将步骤(6)筛选得到的阳性克隆酶切，此时的酶切位点是ecori和xhoi，所用引物为：vl
‑
ecori
‑
f：ccggaattcatggcccaggctgtgctgactcag，vh
‑
xhoi
‑
r：ccgctcgagactagtggaggagacggtgac，这个过程是先连接在pcantab5e载体，再连接在pgex
‑
4t
‑
1，14
‑
16℃连接过夜；连接产物转化dh5α感受态细胞后，挑取第一单克隆，对第一单克隆的菌落pcr扩增和提取第一质粒；第一单克隆的菌落pcr扩增产物和第一质粒分别经双酶切验证，对于经验证连接正确的第一单克隆进行测序，得到测序正确的第一单克隆；
[0039]
(8)将步骤(7)得到的测序正确的第一单克隆的重组质粒进行提取，获得第一重组质粒，将第一重组质粒转化到bl21感受态细胞后，挑取第二单克隆，对第二单克隆的菌落pcr扩增和提取第二质粒；第二单克隆的菌落pcr扩增产物和第二质粒分别经双酶切验证，对于经验证正确的第二单克隆进行测序，得到测序正确的第二单克隆；测序正确的第二单克隆中提取的质粒为构建成的单链抗体原核表达质粒pgex
‑
4t
‑1‑
scfv，将第二单克隆菌落pgex
‑
4t
‑1‑
scfv
‑
bl21传代纯化，保存备用；
[0040]
(9)将步骤(8)构建成单链抗体原核表达质粒的菌株pgex
‑
4t
‑1‑
scfv
‑
bl21进行培养，当细菌od值为0.4
‑
0.6时，加入蛋白质诱导剂iptg，进行诱导表达16
‑
20h，之后对单链抗体蛋白进行纯化。
[0041]
需要说明的是，以上各步骤采用的实验材料均为正规公司获得的标准材料，所用方法均为标准试剂盒产品说明书所述方法(见相应的实施例)，各步骤获得的中间产品及最后的终产品均经过多次试验证明可以重复获得，其生物学性质保持稳定一致。说明本发明各试验步骤所涉及的中间产品和终产品均可以按照本发明所陈述的方法准确获得。
[0042]
本发明的再一目的是提供所述牛源抗金黄色葡萄球菌lukd毒力因子的单链抗体的应用，所述牛源抗金黄色葡萄球菌lukd毒力因子的单链抗体在制备治疗抗金黄色葡萄球菌引起的奶牛乳腺炎的药物中的应用。本发明提供的牛源抗金黄色葡萄球菌lukd毒力因子的单链抗体可用于奶牛乳腺炎的研究与治疗。
[0043]
本发明的技术原理是采用rt
‑
pcr直接从患奶牛乳腺炎的外周血单个核细胞rna中扩增出牛抗体编码基因的重链可变区(vh)基因和轻链可变区(vl)基因。利用soe
‑
pcr(重组链延伸反应)法，将linker与vh基因和vl基因相连构建牛源性单链抗体(scfv)基因，该scfv
是按照vl
‑
linker
‑
vh的顺序进行连接的，并将其克隆到噬菌粒载体pcantab5e中构建单链抗体初级文库，辅助噬菌体m13ko7拯救初级文库；用金黄色葡萄球菌双组分杀白细胞素luked的f组分(lukd)作为包被抗原经过四轮的富集淘选后，采用phage elisa方法筛选阳性克隆，证明该单链抗体具有体外抑制或减弱金黄色葡萄球菌对牛乳腺上皮细胞膜的裂解作用。
[0044]
本发明的独特之处，首先是在构建重组牛源单链抗体(scfv)时，按照vl
‑
linker
‑
vh的顺序，将牛抗体轻链可变区(vl)和牛抗体重链可变区(vh)用中间的linker进行连接，构成的单链抗体片段(vl
‑
linker
‑
vh)，这样连接被本发明证明构建重组牛源scfv更为有效。而一般的文献报道都是按照vh
‑
linker
‑
vl的顺序连接；其次本发明将筛选到的阳性克隆的单链抗体编码基因(scfv)克隆到原核表达质粒pgex
‑
4t
‑
1，构建成单链抗体原核表达质粒pgex
‑
4t
‑1‑
scfv，将该单链抗体与金黄色葡萄球菌混合后，作用于牛乳腺上皮细胞，可抑制金黄色葡萄球菌对牛乳腺上皮细胞膜的裂解作用。在金黄色葡萄球菌牛乳腺上皮细胞模型保护试验中获得了理想的保护效果，该单链抗体用于金黄色葡萄球菌奶牛乳腺炎的相关研究，具有良好的应用前景。
[0045]
本发明开发了一种抗金葡菌奶牛乳腺炎的单链抗体，该单链抗体能够与金葡菌毒力因子特异性结合，能够抑制金葡菌致病活性，用于治疗金黄色葡萄球菌奶牛乳腺炎。
[0046]
本发明的有益效果是：牛源抗金黄色葡萄球菌lukd毒力因子的单链抗体(scfv)与金黄色葡萄球菌混合后，能与金黄色葡萄球菌双组分杀白细胞素luked的f组分(lukd)特异性结合，能够用于奶牛乳腺炎防控等进一步研究。
附图说明
[0047]
图1是本发明的一个较佳实施例1的噬菌粒载体pcantab5e的结构图；
[0048]
图2是本发明的一个较佳实施例2的phage elisa筛选到的其中一个scfv阳性克隆；
[0049]
图3是本发明的一个较佳实施例3的原核表达筛选到的scfv阳性克隆基因的扩增片段；
[0050]
图4是本发明的一个较佳实施例3的scfv基因表达的蛋白sds
‑
page检测图；
[0051]
图5是本发明的一个较佳实施例3的scfv基因表达的蛋白western bloting检测图；
[0052]
图6是本发明的一个较佳实施例5的特异性抗lukd毒力因子的单链抗体scfv对金葡菌裂解牛乳腺上皮细胞膜的阻断效果。
具体实施方式
[0053]
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
[0054]
实施例1牛源噬菌体单链抗体库的构建
[0055]
1采集患乳腺炎的奶牛血液，elisa法检测血清抗体效价大于1:20000时，继续后续实验。用抗凝血提取牛外周血白细胞，用trizol法(trizol reagent购自takara公司)提取总rna。以提取的总rna为模版，采用oligo primer，根据反转录试剂盒(cdna第1链合成试剂盒购自takara公司)的产品说明操作步骤，合成第1链cdna。
[0056]
2分析已发表文献中的牛抗体编码基因可变区序列，根据其fr区设计扩增抗体轻、重链的引物(表1)，其中vh f和vh r用于扩增vh区；vl f和vl r用于扩增vl区。其中，vlf、vh r分别含有sfi i和not i酶切位点；vh f、vl r含互补的linker序列。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
[0057]
表1扩增抗体可变区的引物及其扩增片段大小
[0058][0059][0060]
3vh和vl基因的扩增。以cdna为模版，vh f、vh r为引物扩增vh基因；vl f、vl r为引物扩增vl基因。pcr反应体系为25μl：2
×
pcr mix 12.5μl，模版cdna 2μl，上下游引物(25μm)各1μl，ddh2o 8.5μl。扩增程序如下：95℃预变性3min；94℃变性40s，64℃退火40s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min。1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定产物并回收目的基因(根据axygen公司提供的胶回收说明书操作)。
[0061]
4scfv基因的获得。通过重组链延伸反应(soe
‑
pcr)将含有linker序列的vl和vh基因连接为scfv基因(vl
‑
linker
‑
vh)，并加入sfi i和not i酶切位点。
[0062]
5初级文库的构建。如附图1噬菌粒载体pcantab5e的结构图所示，根据常规分子克隆方法(参照j.萨姆布鲁克等主编的《分子克隆实验指南》)，scfv基因和pcantab5e载体分别经sfi i和not i双酶切后，将scfv基因插入pcantab5e载体，构建重组表达质粒，并将其电转化tg1感受态细胞，转化50次，合并所有电转化培养液，取一小部分系列稀释后涂布于2yt
‑
ag固体培养板，30℃过夜培养计算库容量(挑取克隆进行菌落pcr和质粒双酶切验证，测序验证库的多样性)；通过菌落pcr计算阳性率，得到实际的库容量。将剩余的细菌培养液通过辅助噬菌体m13ko7拯救后建立初级文库。
[0063]
实施例2牛源抗金黄色葡萄球菌毒力因子lukd单链抗体的筛选
[0064]
1富集淘选制备金黄色葡萄球菌(atcc25923)双组分杀白细胞素luked的f组分
(luke)，将其作为抗原，4℃包被过夜；用含4％脱脂奶粉的pbst封闭96孔板，37℃孵育2h；向96孔板中加入上述步骤中制备好的单链抗体噬菌体抗体库，37℃孵育2h，用pbst和pbs各洗10次，洗掉未结合的游离噬菌体；每孔加入100ul 0.2mol/l gly
‑
hcl缓冲液(ph＝2.2)洗脱特异性结合的噬菌体，加入50ul 1mol/l tris
‑
hcl(ph＝9.1)中和洗脱液；将剩余部分洗脱液感染大肠杆菌tg1后，重复上述步骤。如此重复3
‑
5轮，在第一轮过后，要增加洗涤的严谨性：洗脱前用pbst洗脱20次后用pbs洗涤20次。
[0065]
2phage elisa筛选从第四轮中随机挑取96个克隆，用m13k07拯救后制备重组噬菌体。将纯化后的金黄色葡萄球菌双组分杀白细胞素luked的f组分(lukd)蛋白用50mmol/l碳酸氢钠盐溶液(ph9.6)于4℃包被过夜，4％脱脂奶粉溶液封闭1h，用pbst(0.1％tween20，以下同)洗涤3次；加入上述制备好的噬菌体单链抗体，37℃反应2h，pbst和pbs各洗涤6次；加入hrp
‑
antim13抗体100μl(1:4000)，37℃反应1h，pbst和pbs各洗涤6次；tmb显色，2mol/l硫酸终止反应，酶标仪读取od450值，同时设辅助噬菌体m13k07为阴性对照。elisa结果的判定以p/n(p为阳性孔的od450值，n为阴性孔的od450值)表示，p/n≥2.1为阳性；1.5≤p/n＜2.1为可疑；p/n＜1.5为阴性phage elisa筛选到的scfv阳性克隆结果如附图2所示，其中blank control为空白对照，negative control为阴性对照，scfv为阳性克隆，阳性克隆的od450值很高，接近2.5；而阴性对照的od450值小于0.5，两者比值大于2.1。
[0066]
实施例3单链抗体pgex
‑
4t
‑1‑
scfv
‑
22的原核表达及纯化
[0067]
1重组质粒pgex
‑
4t
‑1‑
scfv的构建以22号阳性克隆菌株为模板，用特异性引物(如表2所示)扩增scfv
‑
22目的基因，选择限制性内切酶ecor i和xho i对目的基因和原核表达载体pgex
‑
4t
‑
1进行双酶切，酶切后连接获得重组质粒，将其转化到dh5α感受态，菌落pcr和质粒双酶切验证正确的克隆送至上海铂尚生物技术有限公司测序；
[0068]
表2扩增单链抗体的引物及其扩增片段大小
[0069][0070][0071]
测序正确的克隆进行质粒的提取，再将重组质粒转化到bl21感受态细胞后，挑取单克隆，菌落pcr和质粒双酶切验证正确的克隆送至上海铂尚生物技术有限公司测序，测序正确的即为构建成功的原核表达重组质粒pgex
‑
4t
‑1‑
scfv，如附图3所示。
[0072]
2单链抗体scfv
‑
22蛋白的纯化重组表达的融合蛋白含有gst
‑
tag，采用gst预装重力柱(采购自上海生工生物工程股份有限公司)对蛋白进行纯化，具体步骤如说明书所示，纯化后再进行蛋白超滤，对收集的洗脱液进行sds
‑
page以及western bloting分析，蛋白大小为54kd，结果如附图4和5所示，采用bradford法对蛋白浓度进行测定，根据标准品绘制的标准曲线和样品所测得的od值，得到单链抗体scfv
‑
22蛋白的浓度约为350μg/ml。
[0073]
实施例4重组scfv序列分析
[0074]
对获得的单链抗体编码基因进行测序，证明其按照正确的阅读框顺序插入到原核表达质粒pgex
‑
4t
‑
1载体中，所述氨基酸序列如seq id no.4所示，其序列顺序是vl
‑
linker
‑
vh。
[0075]
实施例5检测单链抗体scfv
‑
22对金葡菌裂解牛乳腺上皮细胞膜的阻断效果
[0076]
检测单链抗体scfv对金葡菌裂解牛乳腺上皮细胞膜阻断效果包括如下两个步骤，分别为：
[0077]
1、实验方法和步骤
[0078]
本实验所用试剂为北京leagene生物ct0027a2乳酸脱氢酶(ldh)细胞毒性试剂盒。
[0079]
根据细胞的大小和生长速度将适量细胞接种到96培养板中，使待检测时细胞密度不超过90％满。吸去培养液，pbs清洗一次，加新培养液，并根据实验需要设置相应的背景空白对照孔a、样品对照孔b、最大酶活对照孔c、药物处理样品孔d等分组，继续培养。待检测前取出细胞培养板，在“最大酶活对照孔c”加入ldh释放剂(10
×
)，加入量为原有培养液体积的10％，并反复吹打混匀数次，然后继续培养1h左右。将细胞培养板用多孔板离心机400g离心5min，分别抽取各孔上清液30～50μl，加入到一个新的96孔板相应孔中，用于后续的ldh检测。
[0080]
按照说明书顺序依次加入各溶液，并注意避免产生气泡。如果样品中酶活性过高，可减少样品用量或适当稀释后再行测定。
[0081]
按说明书将所需溶液依次加入后，作用相应时间，酶标仪440nm处测定各孔吸光度。
[0082]
细胞毒性或死亡率＝(ad
‑
ab)/(ac
‑
ab)
×
100％。
[0083]
2、数据统计和实验结果
[0084]
用graghpad prism 6和excel 2016软件对试验数据进行统计分析，结果以平均数
±
标准误(mean
±
se)表示。p<0.05(*)为差异显著,p>0.05为差异不显著。
[0085]
如附图6特异性抗lukd毒力因子的单链抗体scfv对金葡菌裂解牛乳腺上皮细胞膜阻断效果所示，本实施例使用金黄色葡萄球菌标准菌株atcc29213，nc为阴性对照，与对照组一(atcc29213 gst)和对照组二(atcc29213)相比，当加入针对金葡菌杀白细胞素lukd毒力因子的单链抗体scfv 22(atcc29213 scfv)时，牛乳腺上皮细胞的死亡率(细胞毒性)明显下降，并具有显著性差异(*：p<0.05；**：p<0.01)。说明该特异性单链抗体具有减弱金葡菌裂解牛乳腺上皮细胞膜的功能。
[0086]
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。