清肺排毒颗粒的质控方法与流程

1.本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种中成药中麻黄有效成分的定量方法。


背景技术：

2.清肺排毒汤，是经过临床验证、由经方演化而来，由麻杏石甘汤、小柴胡汤、五苓散和射干麻黄汤4个经典名方组成。药物组方有宣、有清、有健脾、有和胃，方子涵盖面广，考虑到了寒、热、燥以及胃肠问题，经过临床验证疗效确切后加以推广，可用于治疗新型冠状病毒感染的肺炎轻型、普通型、重型患者，在危重症患者救治中也可结合患者实际情况合理使用，该方也可用于普通感冒和流感患者。
3.清肺排毒颗粒，是一种在清肺排毒汤中药复方的基础上改良而成的颗粒剂，解决了汤剂存放、使用和携带不便的问题，利于所述中药复方的推广应用。
4.在清肺排毒颗粒的制备过程中，需用到麻黄、炙甘草、燀苦杏仁、石膏、桂枝、泽泻、猪苓、白术、茯苓、柴胡、黄芩、姜半夏、生姜、紫苑、款冬花、射干、细辛、山药、枳实、陈皮、广藿香等二十一味药材。
5.为了实现对清肺排毒颗粒的质量控制，急需针对所使用的药材以及对发挥药效起主要作用的有效成分建立一种检测与质控方法。


技术实现要素：

6.为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种清肺排毒颗粒的质控方法。
7.为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
8.本发明提供一种清肺排毒颗粒的质控方法，所述质控方法包括如下第(1)～(3)项：
9.(1)对清肺排毒颗粒中麻黄、黄芩、燀苦杏仁和枳实4味药材有效成分的含量进行测定；
10.(2)对清肺排毒颗粒中是否含有石膏成分进行理化鉴定，并对其中是否含有射干、细辛、广藿香、柴胡、甘草、款冬花、桂枝、白术8味药材的成分进行薄层鉴别；
11.(3)对清肺排毒颗粒中马兜铃酸i的含量进行检测与限量。
12.进一步地，第(1)项中，麻黄的含量测定方法如下：
13.采用高效液相色谱法，对供试品和对照品制备的供试品溶液和对照品溶液进行色谱测定，根据测定结果计算供试品中麻黄有效成分的含量；
14.色谱条件与系统适用性试验：以极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相a，以含有0.2％v/v三乙胺的0.2％v/v磷酸溶液为流动相b，按以下规定进行梯度洗脱；检测波长为210nm；流速为0.8ml/min；柱温为40℃；理论板数按盐酸麻黄碱峰计算应不低于10000；
15.所述梯度洗脱过程为：
[0016]0‑
20min内，流动相a和流动相b的体积比为1:99；
[0017]
20
‑
20.1min内，流动相a和流动相b的体积比从1：99匀速渐变至50：50；
[0018]
20.1
‑
25min内，流动相a和流动相b的体积比为50：50；
[0019]
对照品溶液的制备：取盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱适量，精密称定，加30
‑
50％甲醇或乙醇制成每1ml各含30μg的混合溶液，即得；
[0020]
供试品溶液的制备：取本品，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入含0.5
‑
2.0％氢氧化铵的甲醇溶液20ml，密塞，称定重量，超声处理15～45分钟，取出，放冷，再称定重量，用含0.5
‑
2.0％氢氧化铵的甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；
[0021]
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5
‑
20μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
[0022]
本品每袋含麻黄以盐酸麻黄碱(c
10
h
15
no
·
hcl)和盐酸伪麻黄碱(c
10
h
15
no
·
hcl)的总量计，应为6.88～26.01mg。
[0023]
进一步地，第(1)项中，黄芩的含量测定方法如下：
[0024]
采用高效液相色谱法，对供试品和对照品制备的供试品溶液和对照品溶液进行色谱测定，根据测定结果计算供试品中黄芩有效成分的含量；
[0025]
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇
‑
0.2％磷酸溶液(45：55)为流动相；检测波长为280nm；柱温为30℃，理论板数按黄芩苷峰计算应不低于3000；
[0026]
对照品溶液的制备：取黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇或乙醇制成每1ml含60μg的溶液，即得；
[0027]
供试品溶液的制备：取本品适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30
‑
100％乙醇或甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，取出，放冷，再称定重量，用30
‑
100％乙醇或甲醇补足减失的重量，摇匀，微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；
[0028]
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2
‑
20μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
[0029]
本品每袋含黄芩以黄芩苷(c
21
h
18
o
11
)计，应为38.29～144.95mg。
[0030]
进一步地，第(1)项中，燀苦杏仁的含量测定方法如下：
[0031]
采用高效液相色谱法，对供试品和对照品制备的供试品溶液和对照品溶液进行色谱测定，根据测定结果计算供试品中燀苦杏仁有效成分的含量；
[0032]
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇
‑
水(14：86)为流动相；检测波长为210nm，理论板数按苦杏仁苷峰计算应不低于2000；
[0033]
对照品溶液的制备：取苦杏仁苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每lml含50μg的溶液，即得；
[0034]
供试品溶液的制备：取本品适量，研细，取约0.5g，精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，精密加入50％
‑
100％甲醇或乙醇25ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，取出，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；
[0035]
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5
‑
20μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
[0036]
本品每袋含燀苦杏仁以苦杏仁苷(c
20
h
27
no
11
)计，应为21.53～62.99mg。
[0037]
进一步地，第(1)项中，枳实的含量测定方法如下：
[0038]
采用高效液相色谱法，对供试品和对照品制备的供试品溶液和对照品溶液进行色谱测定，根据测定结果计算供试品中枳实有效成分的含量；
[0039]
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相a，以0.1％
‑
0.2％v/v磷酸或相应浓度的甲酸溶液溶液为流动相b，按以下规定进行梯度洗脱；检测波长为284nm；流速为1.0ml/min；柱温为30℃；理论板数按柚皮苷峰计算应不低于6000；
[0040]
所述梯度洗脱过程为：
[0041]
0～30min内，流动相a和流动相b的体积比从16:84匀速渐变至18:82；
[0042]
30～40min内，流动相a和流动相b的体积比从18:82匀速渐变至20:80；
[0043]
对照品溶液的制备：取柚皮苷对照品和新橙皮苷对照品适量，精密称定，加70％
‑
100％甲醇或乙醇制成每lml各含0.1mg柚皮苷与新橙皮苷的混合溶液，即得；
[0044]
供试品溶液的制备：取本品，研细，取约1.0g，精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，精密加入70％
‑
100％甲醇或乙醇25ml，密塞，称定重量，超声处理15分钟，取出，放冷，再称定重量，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
[0045]
测定法：分别精密吸取供试品溶液2～5μl、对照品溶液5μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
[0046]
本品每袋含枳实以柚皮苷(c
27
h
32
o
14
)计，应为21.60～101.79mg；以新橙皮苷(c
28
h
34
o
15
)计，应为15.26～132.02mg。
[0047]
进一步地，第(2)项中，鉴定步骤如下：
[0048]
1)取本品2g，研细，加稀盐酸10ml，加热使溶解，3000r/min离心8min，取上清液作为供试品溶液；取供试品溶液1ml，加甲基红指示液2滴，用氨试液中和，再滴加盐酸至恰呈酸性，加草酸铵试液5～10滴，生成白色沉淀，摇匀，3000r/min离心8min，分离，沉淀不溶于醋酸，但溶于稀盐酸；
[0049]
2)取本品6g，研细，加甲醇100ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水25ml使溶解，60～90℃温度下用石油醚提取2次，每次25ml，合并水液，石油醚液备用；水液用体积比为1:3的正丁醇
‑
乙酸乙酯混合溶液提取2次，每次25ml，合并提取液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；
[0050]
另取射干对照药材1.5g，加甲醇10ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为对照药材溶液；
[0051]
照薄层色谱法(中国药典2020年版通则0502)试验，吸取上述两种溶液各1μl，分别点于同一硅胶gf254薄层板上，以三氯甲烷
‑
甲醇
‑
冰醋酸(20：3：0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，在紫外光(254nm)下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，应显相同颜色的荧光淬灭斑点；
[0052]
3)取步骤2)中的石油醚液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；
[0053]
再取细辛脂素对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；
[0054]
照薄层色谱法(中国药典2020年版通则0502)试验，吸取上述三种溶液各5～10μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以环己烷
‑
乙酸乙酯
‑
无水甲酸(8：2：0.1)为展开剂，展开，取
出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，热风吹至斑点显色清晰，在日光下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，应显相同颜色的斑点；
[0055]
4)取本品3g，研细，加热水30ml溶解，放冷，用正丁醇萃取2次，每次25ml，合并正丁醇液，依次用氢氧化钠试液15ml、氨试液20ml分别洗涤1次，弃去洗液，取正丁醇液蒸干，残渣加甲醇2ml溶解，即得供试品溶液；
[0056]
另取柴胡对照药材0.5g，加甲醇20ml，超声处理10min，滤过，滤液浓缩至5ml，作为对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2020年版四部通则0502)试验，吸取上述溶液各5～10μl，分别点于同一硅胶gf254板上，以三氯甲烷
‑
甲醇
‑
水(30:10:1)为展开剂，展开9cm，取出，晾干，喷以2％对二甲氨基苯甲醛的40％硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，分别置日光下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的一个斑点或荧光斑点；
[0057]
5)取广藿香对照药材0.5g，加乙酸乙酯3ml，超声处理15分钟，滤过，滤液作为对照药材溶液；
[0058]
照薄层色谱法(中国药典2020年版通则0502)试验，吸取步骤2)中的供试品溶液5～10μl及广藿香对照药材溶液5μl，分别点于同一硅胶gf254薄层板上，以环己烷
‑
二氯甲烷
‑
乙酸乙酯
‑
无水甲酸(7：1：1：0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，在紫外光(365nm)下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，应显相同颜色的荧光斑点；
[0059]
6)取本品2g，研细，加甲醇30ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水40ml使溶解，用正丁醇振摇提取2次，每次20ml，合并正丁醇液，用水洗涤3次，每次20ml，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；
[0060]
另取甘草对照药材1g，加水30ml，回流1小时，放置室温，滤过，用正丁醇振摇提取2次，每次20ml，合并正丁醇液，用水洗涤3次，每次20ml，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，制成对照药材溶液；
[0061]
再取甘草苷对照品，加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液；
[0062]
照薄层色谱法(中国药典2020年版通则0502)试验，分别吸取供试品溶液和对照药材溶液各2μl、对照品溶液1μl，分别点于同一用1％氢氧化钠溶液制备的硅胶g薄层板上，以乙酸乙酯
‑
甲酸
‑
冰醋酸
‑
水(20：1：1：2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，分别在日光和紫外光(365nm)下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，应显相同颜色的斑点或荧光斑点；
[0063]
7)取本品5g，研细，加4mol/l盐酸溶液5ml及乙醚30ml，加热回流1.5小时，分取乙醚液，蒸干，残渣加乙酸乙酯2ml使溶解，作为供试品溶液；
[0064]
取款冬花对照药材1g，加水50ml，煮沸30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加4mol/l盐酸溶液5ml及乙醚30ml，同法制成对照药材溶液；
[0065]
照薄层色谱法(中国药典2020年版通则0502)试验，吸取供试品溶液5μl、对照药材溶液2μl，分别点于同一硅胶gf254薄层板上，以甲苯
‑
乙酸乙酯
‑
无水甲酸
‑
水(13：10：4：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％三氯化铝乙醇溶液，热风吹至斑点显色清晰，在紫外光(365nm)下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上(rf值：0.3
‑
0.6)，应显相同颜色的荧光斑点；
[0066]
8)取本品10g，研细，加入乙酸乙酯50ml，超声处理15分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml溶解作为供试品溶液；
[0067]
另取桂枝对照药材0.5g，加乙酸乙酯3ml，超声处理15分钟，滤过，滤液作为对照药材溶液；
[0068]
照薄层色谱法(《中国药典》2020年版四部附录0502)试验，分别吸取供试品溶液20μl、对照药材溶液3μl，点于同一张硅胶gf254薄层板上，以甲苯
‑
甲酸乙酯
‑
冰乙酸(9:1:0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
[0069]
9)取本品3g，研细，用少量水润湿，加乙酸乙酯20ml，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；
[0070]
另取白术对照药材1g，加水100ml，煮沸30分钟，滤过，滤液浓缩至约50ml，加乙酸乙酯50ml，加热回流30分钟，分取乙酸乙酯层，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液；
[0071]
照薄层色谱法(《中国药典》2020年版四部通则0502)试验，分别吸取供试品溶液10μl、对照药材溶液5μl，分别点于同一张硅胶gf254薄层板上，以正己烷
‑
乙酸乙酯
‑
甲酸(5:1:0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至底部斑点清晰，置紫外光灯(365nm)下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
[0072]
进一步地，第(3)项中，对马兜铃酸i的检测与限量方法具体为：
[0073]
取本品适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，取出，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；
[0074]
另取马兜铃酸i对照品适量，精密称定，加70％甲醇制成每1ml含5ng的溶液，作为对照品溶液；
[0075]
照高效液相色谱法
‑
质谱法(中国药典2020年版通则0512和通则0431)试验；以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相a，0.1％甲酸溶液为流动相b，进行梯度洗脱；柱温为35℃；流速为每分钟0.3ml；采用三重四级杆质谱检测器，电喷雾离子化(esi)正离子模式，进行多反应监测(mrm)；选择质荷比(m/z)359.0
→
298.0和359.0
→
296.0离子对进行监测；
[0076]
所述梯度洗脱过程为：0
‑
7min内，流动相a和流动相b的体积比从40:60匀速渐变至60:40；7
‑
8.5min内，流动相a和流动相b的体积比从60:40匀速渐变至95:5；8.5
‑
10min内，流动相a和流动相b的体积比为95:5；10
‑
10.1min内，流动相a和流动相b的体积比从95:5匀速渐变至40:60；10.1
‑
13min内，流动相a和流动相b的体积比为40:60；
[0077]
分别吸取对照品溶液与供试品溶液各2μl，注入液相色谱
‑
质谱仪，测定，以质荷比(m/z)359.0
‑
298.0和359.0
‑
296.0离子对提取的供试品离子流色谱中，应不得同时出现与对照品色谱保留时间一致的色谱峰，若同时出现，则供试品中m/z 359.0
→
298.0的色谱峰应小于对照品浓度的色谱峰。
[0078]
更进一步地，所述质控方法还包括构建清肺排毒颗粒的特征图谱。
[0079]
所述特征图谱的构建方法包括如下步骤：
[0080]
1)参照品溶液的制备：取黄芩苷参照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.1mg黄芩苷的参照品溶液；
[0081]
2)供试品溶液的制备：
[0082]
取本品，研细，取约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水20ml，超声处理20分钟，取出，放冷，离心，取上清液10ml，通过c18固相萃取小柱，以20％甲醇20ml洗脱，弃去20％甲醇液，再以10ml甲醇洗脱，收集洗脱液，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
[0083]
3)测定：分别精密吸取参照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得清肺排毒颗粒的特征图谱；
[0084]
色谱条件：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，以乙腈为流动相a，以0.2％磷酸为流动相b，进行梯度洗脱，洗脱时间及流动相比例为：0
‑
50min内，流动相a和流动相b的体积比从16：84匀速渐变至21：79；50
‑
95min内，流动相a和流动相b的体积比从21：79匀速渐变至50：50；检测波长为265nm，流速为1.0ml/min；柱温35℃，理论塔板数按黄芩苷计，应不低于10000；
[0085]
以黄芩苷为参照峰s，计算各特征峰与s峰的相对保留时间，所述相对保留时间在规定值的
±
7％之内，所述规定值为：0.60
‑
峰1、0.66
‑
峰2、0.68
‑
峰3、0.70
‑
峰4、0.76
‑
峰5、1.00
‑
峰s、1.20
‑
峰7、1.28
‑
峰8、1.33
‑
峰9、1.48
‑
峰10、1.65
‑
峰11、1.68
‑
峰12。
[0086]
本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
[0087]
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。
[0088]
本发明的有益效果在于：
[0089]
本发明首次针对清肺排毒颗粒制定了一套详细可行的质量标准，在质量标准制定过程中，除了对复方中的麻黄、黄芩、燀苦杏仁、枳实4味药材进行了含量测定以外的所有药味进行薄层鉴别的筛选，由于是用水提取药味多，相互干扰较大，经反复试验摸索，最终确立射干、细辛、广藿香、柴胡、甘草、款冬花、桂枝、白术8味药材的薄层鉴别方法以及石膏的理化鉴别方法，并同时引入对马兜铃酸i的限量，以保证制剂的质量。
附图说明
[0090]
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。
[0091]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0092]
图1为清肺排毒颗粒的特征图谱。
具体实施方式
[0093]
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面将对本发明的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
[0094]
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
[0095]
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
[0096]
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0097]
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0098]
实施例1
[0099]
本实施例用于说明对清肺排毒颗粒中麻黄有效成分的定量检测，方法如下：
[0100]
照高效液相色谱法(中国药典2020年版通则0512)测定。
[0101]
色谱条件与系统适用性试验：以极性乙醚连接苯基键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相a，以0.2％磷酸溶液(含0.2％三乙胺)为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为210nm；流速为0.8ml/min；柱温为40℃。理论板数按盐酸麻黄碱峰计算应不低于10000。
[0102]
时间(分钟)流动相a(％)流动相b(％)0～2019920～20.11～5099～5020.1～255050
[0103]
对照品溶液的制备：取盐酸麻黄碱对照品、盐酸伪麻黄碱对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml各含30μg的混合溶液，即得。
[0104]
供试品溶液的制备：取本品适量，研细，取约0.5g，精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，精密加入1％氢氧化铵
‑
甲醇溶液20ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用1％氢氧化铵
‑
甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0105]
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
[0106]
本品每袋含麻黄以盐酸麻黄碱(c
10
h
15
no
·
hcl)、盐酸伪麻黄碱(c
10
h
15
no
·
hcl)的总量计，应为6.88～26.01mg。
[0107]
经试验验证，本方法重复性好，精密度高，在不同的高效液相色谱仪和不同的色谱柱上的测定结果没有显著差异，说明本方法适用性和重现性好，适于普遍推广。
[0108]
实施例2
[0109]
本实施例用于说明对清肺排毒颗粒中黄芩有效成分的定量检测，方法如下：
[0110]
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇
‑
0.2％磷酸溶液(45：55)为流动相；检测波长为280nm；柱温为30℃。理论板数按黄芩苷峰计算应不低于3000。
[0111]
对照品溶液的制备：取黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含60μg的溶液，即得。
[0112]
供试品溶液的制备：取本品适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精
密加入70％乙醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0113]
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
[0114]
本品每袋含黄芩以黄芩苷(c
21
h
18
o
11
)计，应为38.29～144.95mg。
[0115]
经试验验证，本方法重复性好，精密度高，在不同的高效液相色谱仪和不同的色谱柱上的测定结果没有显著差异，说明本方法适用性和重现性好，适于普遍推广。
[0116]
实施例3
[0117]
本实施例用于说明对清肺排毒颗粒中燀苦杏仁有效成分的定量检测，方法如下：
[0118]
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇
‑
水(14：86)为流动相；流速：1.0ml/min；柱温：35℃；检测波长为210nm。理论板数按苦杏仁苷峰计算应不低于2000。
[0119]
对照品溶液的制备：取苦杏仁苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含50μg的溶液，即得。
[0120]
供试品溶液的制备：取的本品适量，研细，取约0.5g，精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0121]
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
[0122]
本品每袋含燀苦杏仁以苦杏仁苷(c
20
h
27
no
11
)计，应为21.53～62.99mg。
[0123]
经试验验证，本方法重复性好，精密度高，在不同的高效液相色谱仪和不同的色谱柱上的测定结果没有显著差异，说明本方法适用性和重现性好，适于普遍推广。
[0124]
实施例4
[0125]
本实施例用于说明对清肺排毒颗粒中枳实有效成分的定量检测，方法如下：
[0126]
照高效液相色谱法(中国药典2020年版通则0512)测定。
[0127]
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相a，以0.2％磷酸溶液为流动相b，按以下规定进行梯度洗脱；检测波长为284nm；流速为1.0ml/min；柱温为30℃；理论板数按柚皮苷峰计算应不低于6000；
[0128][0129]
对照品溶液的制备：取柚皮苷对照品、新橙皮苷对照品适量，精密称定，加85％甲醇制成每lml各含0.1mg的混合溶液，即得。
[0130]
供试品溶液的制备：取本品适量，研细，取约1.0g，精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，精密加入85％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250w，频率40khz)15分钟，取出，放冷，再称定重量，用85％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0131]
测定法：分别精密吸取供试品溶液2～5μl、对照品溶液5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
[0132]
本品每袋含枳实以柚皮苷(c
27
h
32
o
14
)计，应为21.60～101.79mg；以新橙皮苷(c
28
h
34
o
15
)计，应为15.26～132.02mg。
[0133]
经试验验证，本方法重复性好，精密度高，在不同的高效液相色谱仪和不同的色谱柱上的测定结果没有显著差异，说明本方法适用性和重现性好，适于普遍推广。
[0134]
实施例5
[0135]
本实施例用于说明对清肺排毒颗粒中是否含有石膏成分进行理化鉴定，并对其中是否含有射干、细辛、广藿香、柴胡、甘草、款冬花、桂枝、白术8味药材的成分进行薄层鉴定的方法，具体如下：
[0136]
1)取本品2g，研细，加稀盐酸10ml，加热使溶解，3000r/min离心8min，取上清液作为供试品溶液；取供试品溶液1ml，加甲基红指示液2滴，用氨试液中和，再滴加盐酸至恰呈酸性，加草酸铵试液5～10滴，生成白色沉淀，摇匀，3000r/min离心8min，分离，沉淀不溶于醋酸，但溶于稀盐酸；
[0137]
2)取本品6g，研细，加甲醇100ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水25ml使溶解，60～90℃温度下用石油醚提取2次，每次25ml，合并水液，石油醚液备用；水液用体积比为1:3的正丁醇
‑
乙酸乙酯混合溶液提取2次，每次25ml，合并提取液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；
[0138]
另取射干对照药材1.5g，加甲醇10ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为对照药材溶液；
[0139]
照薄层色谱法(中国药典2020年版通则0502)试验，吸取上述两种溶液各1μl，分别点于同一硅胶gf254薄层板上，以三氯甲烷
‑
甲醇
‑
冰醋酸(20：3：0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，在紫外光(254nm)下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，应显相同颜色的荧光淬灭斑点；
[0140]
3)取步骤2)中的石油醚液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；
[0141]
再取细辛脂素对照品，加甲醇制成每lml含lmg的溶液，作为对照品溶液；
[0142]
照薄层色谱法(中国药典2020年版通则0502)试验，吸取上述三种溶液各5～10μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以环己烷
‑
乙酸乙酯
‑
无水甲酸(8：2：0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，热风吹至斑点显色清晰，在日光下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，应显相同颜色的斑点；
[0143]
4)取本品3g，研细，加热水30ml溶解，放冷，用正丁醇萃取2次，每次25ml，合并正丁醇液，依次用氢氧化钠试液15ml、氨试液20ml分别洗涤1次，弃去洗液，取正丁醇液蒸干，残渣加甲醇2ml溶解，即得供试品溶液；
[0144]
另取柴胡对照药材0.5g，加甲醇20ml，超声处理10min，滤过，滤液浓缩至5ml，作为对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2020年版四部通则0502)试验，吸取上述溶液各5～10μl，分别点于同一硅胶gf254板上，以三氯甲烷
‑
甲醇
‑
水(30:10:1)为展开剂，展开9cm，取出，晾干，喷以2％对二甲氨基苯甲醛的40％硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，分别置日光下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的一个斑点或荧光斑点；
[0145]
5)取广藿香对照药材0.5g，加乙酸乙酯3ml，超声处理15分钟，滤过，滤液作为对照药材溶液；
[0146]
照薄层色谱法(中国药典2020年版通则0502)试验，吸取步骤2)中的供试品溶液5～10μl及广藿香对照药材溶液5μl，分别点于同一硅胶gf254薄层板上，以环己烷
‑
二氯甲烷
‑
乙酸乙酯
‑
无水甲酸(7：1：1：0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，在紫外光(365nm)下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，应显相同颜色的荧光斑点；
[0147]
6)取本品2g，研细，加甲醇30ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水40ml使溶解，用正丁醇振摇提取2次，每次20ml，合并正丁醇液，用水洗涤3次，每次20ml，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；
[0148]
另取甘草对照药材1g，加水30ml，回流1小时，放置室温，滤过，用正丁醇振摇提取2次，每次20ml，合并正丁醇液，用水洗涤3次，每次20ml，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，制成对照药材溶液；
[0149]
再取甘草苷对照品，加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液；
[0150]
照薄层色谱法(中国药典2020年版通则0502)试验，分别吸取供试品溶液和对照药材溶液各2μl、对照品溶液1μl，分别点于同一用1％氢氧化钠溶液制备的硅胶g薄层板上，以乙酸乙酯
‑
甲酸
‑
冰醋酸
‑
水(20：1：1：2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，分别在日光和紫外光(365nm)下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，应显相同颜色的斑点或荧光斑点；
[0151]
7)取本品5g，研细，加4mol/l盐酸溶液5ml及乙醚30ml，加热回流1.5小时，分取乙醚液，蒸干，残渣加乙酸乙酯2ml使溶解，作为供试品溶液；
[0152]
取款冬花对照药材1g，加水50ml，煮沸30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加4mol/l盐酸溶液5ml及乙醚30ml，同法制成对照药材溶液；
[0153]
照薄层色谱法(中国药典2020年版通则0502)试验，吸取供试品溶液5μl、对照药材溶液2μl，分别点于同一硅胶gf254薄层板上，以甲苯
‑
乙酸乙酯
‑
无水甲酸
‑
水(13：10：4：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％三氯化铝乙醇溶液，热风吹至斑点显色清晰，在紫外光(365nm)下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上(rf值：0.3
‑
0.6)，应显相同颜色的荧光斑点；
[0154]
8)取本品10g，研细，加入乙酸乙酯50ml，超声处理15分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml溶解作为供试品溶液；
[0155]
另取桂枝对照药材0.5g，加乙酸乙酯3ml，超声处理15分钟，滤过，滤液作为对照药材溶液；
[0156]
照薄层色谱法(《中国药典》2020年版四部附录0502)试验，分别吸取供试品溶液20μl、对照药材溶液3μl，点于同一张硅胶gf254薄层板上，以甲苯
‑
甲酸乙酯
‑
冰乙酸(9:1:0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
[0157]
9)取本品3g，研细，用少量水润湿，加乙酸乙酯20ml，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；
[0158]
另取白术对照药材1g，加水100ml，煮沸30分钟，滤过，滤液浓缩至约50ml，加乙酸乙酯50ml，加热回流30分钟，分取乙酸乙酯层，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液；
[0159]
照薄层色谱法(《中国药典》2020年版四部通则0502)试验，分别吸取供试品溶液10μl、对照药材溶液5μl，分别点于同一张硅胶gf254薄层板上，以正己烷：乙酸乙酯：甲酸(5:1:0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至底部斑点清晰，置紫外光灯(365nm)下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
[0160]
经薄层条件耐用性考察试验结果表明，在不同色谱条件该温度、不同相对湿度条件下，均能够实现较好的分离，本发明具有较高可行性。
[0161]
实施例6
[0162]
本实施例用于说明对清肺排毒颗粒中马兜铃酸i的含量进行检测与限量的方法，具体如下：
[0163]
取本品适量，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，取出，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；
[0164]
另取马兜铃酸i对照品适量，精密称定，加70％甲醇制成每lml含5ng的溶液，作为对照品溶液；
[0165]
照高效液相色谱法
‑
质谱法(中国药典2020年版通则0512和通则0431)试验；以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相a，0.1％甲酸溶液为流动相b，进行梯度洗脱；柱温为35℃；流速为每分钟0.3ml；采用三重四级杆质谱检测器，电喷雾离子化(esi)正离子模式，进行多反应监测(mrm)；选择质荷比(m/z)359.0
→
298.0和359.0
→
296.0离子对进行监测；
[0166]
所述梯度洗脱过程为：0
‑
7min内，流动相a和流动相b的体积比从40:60匀速渐变至60:40；7
‑
8.5min内，流动相a和流动相b的体积比从60:40匀速渐变至95:5；8.5
‑
10min内，流动相a和流动相b的体积比为95:5；10
‑
10.1min内，流动相a和流动相b的体积比从95:5匀速渐变至40:60；10.1
‑
13min内，流动相a和流动相b的体积比为40:60；
[0167]
分别吸取对照品溶液与供试品溶液各2μl，注入液相色谱
‑
质谱仪，测定，以质荷比(m/z)359.0
‑
298.0和359.0
‑
296.0离子对提取的供试品离子流色谱中，应不得同时出现与对照品色谱保留时间一致的色谱峰，若同时出现，则供试品中m/z 359.0
→
298.0的色谱峰应小于对照品浓度的色谱峰。
[0168]
经过反复试验验证，结果表明，本方法适用清肺排毒颗粒样品中马兜铃酸i的限量检测。该方法前处理简便,专属性强，灵敏度高,重复性好，检测结果可靠。
[0169]
此外，参考《中国药典》对九味羌活丸中马兜铃酸i限量检查的方法针对清肺排毒颗粒进行马兜铃酸i的检测，发现利用该方法时对照品的出峰时间靠后且峰形差，样品中各成分的分离度不好。
[0170]
同时，参考现有文献(陈奕君,王伟,肖红斌.基于液相色谱
‑
质谱联用的清肺排毒汤中痕量马兜铃酸i的监测及定量分析[j].药学学报,2020,55(8):1903
‑
1907)公开的马兜铃酸i定量分析方法对清肺排毒颗粒进行马兜铃酸i的检测，发现利用该方法时马兜铃酸i标品的对称性不好，出现拖尾现象。采用mrm方法后发现色谱峰主要集中在1.5
‑
3min内，分离度不好，且前处理方法繁琐，不利于实际清肺排毒颗粒中马兜铃酸i的限量检测。
[0171]
因此本发明方法比药典基现有文献所记载的方法更加适用于清肺排毒颗粒中马
兜铃酸i的限量检测。
[0172]
实施例7
[0173]
本实施例同于说明清肺排毒颗粒的特征图谱的构建方法，具体如下：
[0174]
1、供试品溶液的制备：
[0175]
浸提操作：取清肺排毒颗粒标准样品，研细，取约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水20ml，超声处理(功率250w，频率40khz)20分钟，取出，放冷，离心，取上清液10ml，通过c18固相萃取小柱(c18:ods，2ml，柱内径1.5cm，高2cm，预先用水20ml洗脱)，以20％甲醇20ml洗脱，弃去20％甲醇液，再以10ml甲醇洗脱，收集洗脱液，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0176]
2、色谱测定操作：取5μl供试品溶液向高效液相色谱仪进行进样，具体操作按高效液相色谱法(中国药典2020年版通则0512)测定，得到清肺排毒颗粒的色谱图。
[0177]
其中，色谱条件包括：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，以乙腈为流动相a，以0.2％磷酸为流动相b，进行梯度洗脱，洗脱时间及流动相比例为：0
‑
50min内，流动相a和流动相b的体积比从16：84匀速渐变至21：79；50
‑
95min内，流动相a和流动相b的体积比从21：79匀速渐变至50：50；检测波长为265nm，流速为1.0ml/min；柱温35℃，理论塔板数按黄芩苷计，应不低于10000。
[0178]
3、特征图谱的获得
[0179]
通过测得的清肺排毒颗粒样品和黄芩苷参照品的色谱图进行比较，确定清肺排毒颗粒色谱图有12个共有特征峰，标号1～12，其中6号色谱峰为黄芩苷的特征峰，设定6号峰的相对保留时间为1，计算其他峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的
±
7％之内。规定值:0.60(峰1)、0.66(峰2)、0.68(峰3)、0.70(峰4)、0.76(峰5)、1.00(峰6s)、1.20(峰7)、1.28(峰8)、1.33(峰9)1.48(峰10)、1.65(峰11)、1.68(峰12)。如图1所示。
[0180]
清肺排毒汤是由21味药材组成的复方。且复方的提取过程为水煎煮，复方药材组成多样，成分繁杂。为了保证制剂在临床上的疗效与质量稳定，除了对复方中的4味药材进行了含量测定，对6味药材进行了鉴别外，还建立了特征图谱，特征图谱的整体性与全面性符合中药质控的要求，由15批数据生成了对照图谱，从而全面地反映本制剂中所含化学成分的种类与数量。弥补了单纯指标性成分在质控方面的不足，更具有科学性与全面性。保证了中药质量的均一性和稳定性，提高了在临床上的整体疗效。
[0181]
以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。