佐匹克隆中基因毒性杂质4-二甲氨基吡啶残留含量的检测方法与流程

1.本发明属于药物技术领域，涉及药物杂质检测领域，特别涉及佐匹克隆中基因毒性杂质 4-二甲氨基吡啶残留含量的检测方法。


背景技术：

2.佐匹克隆(zopiclone，zop)，化学名为6-(5-氯-2-吡啶基)-7-[(4-甲基哌嗪-1-基)羧基氧]-5，6-二氢吡咯并[3，4-b]吡嗪-5-酮，属于吡咯环酮类化合物，作为一种已用于临床的新型非苯二氮卓类镇静催眠药，能有效地用于失眠症的短期治疗。消旋佐匹克隆自80年代中期由法国罗纳普朗克.乐安(rhone-poulenc rorer)公司以商品名imovane及amoban在欧洲等80多个国家上市，用于治疗睡眠紊乱。1999年忆梦返(imovane)的销售额大约为1亿6千万美元，为美国市场外治疗睡眠紊乱的先导药物，未向fda递交申请。sepracor公司认为外消旋的短效催眠作用可能由于其( )异构体所致，因此从1998年开始开发右佐匹克隆，至今已成功完成iii期临床试验，2004年12月美国fda已批准该药在美国上市。
[0003]
右佐匹克隆是佐匹克隆的(s)-构型对映体，其制备工艺为：佐匹克隆经d-( )-苹果酸拆分，得到中间体右佐匹克隆d-( )-苹果酸盐，再经碱化脱除d-( )-苹果酸得到右佐匹克隆粗品，最后精制得右佐匹克隆成品。右佐匹克隆的制备过程只是对佐匹克隆进行拆分，不涉及分子结构的改变，除手性异构体(r-佐匹克隆)、d-( )-苹果酸、乙酸乙酯外，无特殊有机杂质引入。工艺中使用的无机试剂，均可被有效去除。
[0004]
除立体构型不同外，佐匹克隆与右佐匹克隆的化学结构一致，佐匹克隆含有的杂质可能会引入右佐匹克隆中，佐匹克隆的合成工艺路线如下：
[0005][0006]
根据佐匹克隆生产工艺，佐匹克隆中可能含有的基因毒性杂质即4-二甲氨基吡啶，其也存在被引入右佐匹克隆的可能，因此对其残留情况的研究对于佐匹克隆以及右佐匹克隆的质量控制都具有重要意义。
[0007]
然而，现有的佐匹克隆的法定标准中，尚未收载4-二甲氨基吡啶残留含量的检查
方法，标准缺失，国内外均无相关文献报道，无法评价药品质量，存在安全隐患。


技术实现要素：

[0008]
针对现有技术的不足，本发明提供一种佐匹克隆中基因毒性杂质4-二甲氨基吡啶残留含量的检测方法，本发明采用液质联用检测，运用外标法对样品进行测定，分析其中的4-二甲氨基吡啶残留含量，该方法能够保证测试结果的准确性与可靠性。
[0009]
本发明是通过以下技术方案实现的：
[0010]
佐匹克隆中基因毒性杂质4-二甲氨基吡啶残留含量的检测方法，包括如下步骤：对照品溶液：取4-二甲氨基吡啶对照品适量，精密称定，置于棕色容量瓶中，用稀释剂溶解，依次稀释，制成对照品溶液；
[0011]
供试品溶液：取佐匹克隆供试品适量，精密称定，置于容量瓶中，用稀释剂溶解定容制成供试品溶液；
[0012]
测定法：分别取供试品溶液与对照品溶液，精密量取进样，采用液质联用的方法，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得佐匹克隆中基因毒性杂质4-二甲氨基吡啶残留含量；
[0013]
其中，稀释剂为乙腈:水＝1:9(v:v)。
[0014]
本发明的进一步改进方案为：
[0015]
所述对照品溶液的配制过程为：
[0016]
精密称取4-二甲氨基吡啶0.01005g于10ml容量瓶，加稀释剂溶解稀释至刻度，得对照品储备液ⅰ。
[0017]
用0.5ml移液管移取对照品储备液ⅰ0.5ml于10ml容量瓶中，加稀释剂定容，摇匀, 标记为对照品储备溶液ⅱ。
[0018]
用1ml移液管移取对照品储备液ⅱ1.0ml于10ml容量瓶中，加稀释剂定容摇匀，得对照品储备溶液ⅲ。
[0019]
用1ml移液管移取对照品储备溶液ⅲ1.0ml于100ml容量瓶中，加稀释剂定容摇匀，得50ng/ml的对照品溶液。
[0020]
进一步的，所述供试品溶液的配制过程为：精密称定佐匹克隆供试品10mg，置于100ml 容量瓶中，用稀释剂溶解定容制成浓度为0.1mg/ml的供试品溶液。
[0021]
进一步的，所述液质联用的质谱条件为
[0022]
喷雾类型esi源扫描类型simfragmentor70v雾化气压力35psi干燥气温度350℃干燥气流速12l/minpolaritypositive毛细管电压3000vsimion123.00
[0023]
。
[0024]
进一步的，所述液质联用的质谱条件为
[0025][0026]
进一步的，根据ich三方协调指导原则对新原料药中杂质的要求，供试品中如含4-二甲氨基吡啶，均不得过500ppm。
[0027]
供试品溶液中4-二甲氨基吡啶含量的计算公式：
[0028][0029]
其中：
[0030]
a
spl
指供试品溶液中4-二甲氨基吡啶的峰面积
[0031]
w
spl
指供试品的称样量(mg)
[0032]
v
spl
指供试品溶液的体积(ml)
[0033]
a
std
指对照品溶液中4-二甲氨基吡啶的峰面积
[0034]
w
std
指对照品溶液中4-二甲氨基吡啶的称样量(mg)
[0035]
v
std
指对照品溶液的体积(ml)。
[0036]
本发明的有益效果为：
[0037]
本发明所提供的方法，采用液质联用的方法进行分离与检测，设备普及率高，使用成本低廉，从而可以有效地扩大本方法的适用场合及使用范围。
[0038]
本发明所提供的检测方法中，所用试剂均无污染，对照品和供试品的处理过程简单，且对照品和供试品的使用量小，可以方便、快速地配制成对照品溶液、供试品溶液以及自身对照溶液。
[0039]
在本发明所提供的色谱条件下，杂质与主成分之间分离度良好，系统稳定性、重复性良好，准确度高，出峰时间快，分析时间短，节约实验成本。
[0040]
本发明所提供的方法，可快速、有效、简便对佐匹克隆中可能含有的基因毒性杂质即4
-ꢀ
二甲氨基吡啶杂质量进行测定，既可以用于对药品成分进行评价或评估，避免存在安
全隐患，又可以为该原料药的质量安全提供可靠的数据监测。
[0041]
利用试验对本发明所提供的检测方法进行了验证，结果表明，本方法的专属性强、精密度好，准确度高，能快速地测定佐匹克隆中4-二甲氨基吡啶的量。
附图说明
[0042]
图1空白溶剂的谱图；
[0043]
图2为实施例1中对照品的谱图；
[0044]
图3为实施例1中供试品851411009的谱图；
[0045]
图4为实施例2中对照品的谱图；
[0046]
图5为实施例2中供试品18000491的谱图；
[0047]
图6为实施例3中对照品的谱图；
[0048]
图7为实施例3中供试品851409007的谱图；
[0049]
图8为4-二甲氨基吡啶的标准曲线图。
[0050]
由于篇幅有限，方法验证部分的谱图没有在说明书中记载。
具体实施方式
[0051]
仪器设备、色谱柱、试剂与对照品仪器设备
[0052][0053]
色谱柱
[0054][0055]
试剂与对照品
[0056][0057]
实施例1-3
[0058]
稀释剂
[0059]
乙腈:水＝1:9(v:v)
[0060]
空白溶剂
[0061]
乙腈:水＝1:9(v:v)
[0062]
对照品溶液(50ng/ml4-二甲氨基吡啶溶液)
[0063]
精密称取4-二甲氨基吡啶0.01005g于10ml容量瓶，加稀释剂溶解稀释至刻度，得对照品储备液ⅰ。
[0064]
用0.5ml移液管移取对照品储备液ⅰ0.5ml于10ml容量瓶中，加稀释剂定容，摇匀，得对照品储备溶液ⅱ。
[0065]
用1ml移液管移取对照品储备液ⅱ1.0ml于10ml容量瓶中，加稀释剂定容摇匀，得对照品储备溶液ⅲ。
[0066]
用1ml移液管移取对照品储备溶液ⅲ1.0ml于100ml容量瓶中，加稀释剂定容摇匀，作为对照品溶液。
[0067]
供试品溶液(0.1mg/ml佐匹克隆)
[0068]
分别精密称定不同批号的样品约10mg，转移至100ml容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为佐匹克隆的供试品溶液。
[0069]
分别取供试品溶液与对照溶液，精密量取2μl进样，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得供试品溶液中4-二甲氨基吡啶的含量。
[0070]
质谱条件为
[0071]
喷雾类型esi源扫描类型simfragmentor70v雾化气压力35psi干燥气温度350℃干燥气流速12l/minpolaritypositive毛细管电压3000v
simion123.00
[0072]
质谱条件为
[0073][0074][0075]
计算公式：
[0076][0077]
其中：
[0078]
a
spl
指供试品溶液中4-二甲氨基吡啶的峰面积
[0079]
w
spl
指供试品的称样量(mg)
[0080]
v
spl
指供试品溶液的体积(ml)
[0081]
a
std
指对照品溶液中4-二甲氨基吡啶的峰面积
[0082]
w
std
指对照品溶液中4-二甲氨基吡啶的称样量(mg)
[0083]
v
std
指对照品溶液的体积(ml)。
[0084]
方法的定量限(loq)为50pmm，检出限(lod)为15ppm；供试品中如含4-二甲氨基吡啶，均不得过500ppm。
[0085]
色谱图如图1至图7所示，检测结果如表1所示。
[0086]
表1检测结果
[0087][0088][0089]
实验结果表明，三个批次样品中均未检出4-二甲氨基吡啶。
[0090]
分析方法验证
[0091]
1、系统适应性
[0092]
稀释剂
[0093]
乙腈:水＝1:9(v:v)
[0094]
定位溶液(50ng/ml 4-二甲氨基吡啶溶液)
[0095]
精密称取4-二甲氨基吡啶0.01011g于10ml容量瓶，加稀释剂溶解稀释至刻度，得对照品储备液ⅰ。
[0096]
用0.5ml移液管移取对照品储备液ⅰ0.5ml于10ml容量瓶中，加稀释剂定容，摇匀，得对照品储备溶液ⅱ。
[0097]
用1ml移液管移取对照品储备液ⅱ1.0ml于10ml容量瓶中，加稀释剂定容摇匀，得对照品储备溶液ⅲ。
[0098]
用1ml移液管移取对照品储备溶液ⅲ1.0ml于100ml容量瓶中，加稀释剂定容摇匀，标示为std-1。
[0099]
按照上述相同的配制过程配制另一份对照溶液，标示为std-2(4-二甲氨基吡啶质量为 0.01000g)。
[0100]
供试品溶液(0.1mg/ml佐匹克隆)
[0101]
精密称取佐匹克隆0.01003g，转移至100ml容量瓶中，用稀释剂定容，摇匀，标示为 spl，作为佐匹克隆的供试品溶液。
[0102]
供试品加标溶液
[0103]
精密称取佐匹克隆0.01001g，转移至100ml容量瓶中，加入1ml对照品储备溶液ⅲ，
用稀释剂定容，摇匀，标示为spl-std，作为佐匹克隆的供试品加标溶液。
[0104]
按本发明的色谱以及质谱条件，取std-1测定6次，系统适应性结果如表2所示
[0105]
表2系统适应性结果
[0106][0107]
2、专属性
[0108]
按本发明的色谱以及质谱条件，取上述std、spl、spl-std样品分别测定，专属性结果如表3所示。
[0109]
表3专属性结果
[0110][0111]
空白无干扰，4-二甲氨基吡啶与其相邻色谱峰间的分离度大于1.5，专属性符合要求。
[0112]
3、定量限
[0113]
定量限溶液
[0114]
精密称取4-二甲氨基吡啶0.01011g、0.01000g、0.01007g、0.01008g、0.01008 g、0.01004g，分别置于6个10ml容量瓶，加稀释剂溶解稀释至刻度，得对照品储备液
ⅰ-
1～
ⅰ-
6。
[0115]
分别精密移取对照品储备液ⅰ0.5ml于6个10ml容量瓶中，加稀释剂定容，摇匀, 标记为对照品储备溶液
ⅱ-
1～
ⅱ-
6。
[0116]
分别精密移取对照品储备溶液ⅱ1.0ml于6个10ml容量瓶中，加稀释剂定容摇匀，得对照品储备溶液
ⅲ-
1～
ⅲ-
6。
[0117]
分别精密移取对照品储备溶液ⅲ1.0ml于6个10ml容量瓶中，加稀释剂定容摇匀，得对照品储备溶
ⅳ-
1～
ⅳ-
6。
[0118]
分别精密移取对照品储备溶ⅳ1.0ml于6个100ml容量瓶中，加稀释剂定容，摇匀，
分别标记为loq-1～loq-6。
[0119]
供试品溶液
[0120]
精密称取佐匹克隆0.00999g、0.01003g，分别转移至2个100ml容量瓶中，用稀释剂定容，摇匀，分别标示为spl-1、spl-2。
[0121]
定量限回收率溶液
[0122]
精密称取佐匹克隆0.01000g、0.01002g、0.00999g、0.01003g、0.00995g、0.00995 g，分别转移至6个100ml容量瓶中，分别加入对照品储备溶
ⅳ-
1 1.0ml，用稀释剂定容，摇匀，分别标示为spl-loq-1～spl-loq-6。
[0123]
按本发明的色谱以及质谱条件，分别对上述溶液进样检测，分析定量限和定量限回收率溶液，结果如表4和表5所示。
[0124]
表4定量限结果
[0125][0126]
表5定量限的回收率
[0127][0128]
实验结果表明：6份定量浓度下各溶液响应的信噪比均大于10，峰面积响应因子的rsd 小于8％，定量限重复性符合要求。定量限浓度下的回收率均在80％～115％之间，定量限的准确度良好，定量限为50ppm。
[0129]
4、检出限
[0130]
用3ml移液管移取loq重复性项下loq-2溶液3ml置10m容量瓶中，用稀释剂定容，并将该溶液标示为lod，平行配制2份，标记为lod-1和lod-2。
[0131]
以上溶液分别进样分析，计算lod溶液中s/n，结果如表6。
[0132]
表6检出限结果
[0133][0134]
实验结果表明：lod溶液中4-二甲氨基吡啶的信噪比均不小于3，检出限为15ppm。
[0135]
5、线性和范围
[0136]
溶液配制
[0137]
l-200:用2ml移液管移取2.0ml定量限项下对照品储备液
ⅲ-
3至100ml容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，标记为l-200。
[0138]
l-150:用2ml移液管移取1.5ml定量限项下对照品储备液
ⅲ-
3至100ml容量瓶中，
用稀释剂稀释至刻度，摇匀，标记为l-150。
[0139]
l-100:用1ml移液管移取1.0ml定量限项下对照品储备液
ⅲ-
3至100ml容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，标记为l-100。
[0140]
l-80:用1ml移液管移取0.8ml定量限项下对照品储备液
ⅲ-
3至100ml容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，标记为l-80。
[0141]
l-50:用0.5ml移液管移取0.5ml定量限项下对照品储备液
ⅲ-
3至100ml容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，标记为l-50。
[0142]
loq：参照方法中loq的配制。
[0143]
以上溶液分别进样分析，结果见表7和图8。
[0144]
表7线性与范围结果
[0145][0146][0147]
实验结果表明，4-二甲氨基吡啶在浓度5.035ng/ml～100.700ng/ml范围内与峰面积线性关系良好，相关系数为0.9997，y轴截距在100％响应值的25％以内，线性范围符合测定要求。
[0148]
6、准确度
[0149]
溶液配制
[0150]
供试品溶液(0.1mg/ml佐匹克隆)
[0151]
精密称取佐匹克隆0.01001g、0.01007g，分别转移至2个100ml容量瓶中，用稀释剂
定容，摇匀，分别标记为spl-3～spl-4。
[0152]
佐匹克隆样品准确度
[0153]
分别配制80％、100％、120％限度浓度的溶液各3份、6份和3份，并测定准确度。
[0154]
spl-80％std溶液：精密称取佐匹克隆0.01008g、0.01007g、0.01006g，分别转移至 3个100ml容量瓶中，加入0.8ml专属性项下对照品储备溶液
ⅲ-
1，用稀释剂稀释至刻度，摇匀。分别标示为spl-80％std-1～spl-80％std-3。
[0155]
spl-100％std溶液：精密称取佐匹克隆0.01001g、0.01001g、0.01004g、0.00996g、 0.00999g、0.01004g，分别转移至6个100ml容量瓶中，加入1.0ml专属性项下对照品储备溶液
ⅲ-
1，用稀释剂稀释至刻度，摇匀。分别标示为spl-100％std-1～spl-100％std-6。
[0156]
spl-120％std溶液：精密称取佐匹克隆0.01002g、0.01000g、0.01007g，分别转移至 3个100ml容量瓶中，加入1.2ml专属性项下对照品储备溶液
ⅲ-
1，用稀释剂稀释至刻度，摇匀。平行配制3份，分别标示为spl-120％std-1～spl-120％std-3。
[0157]
结果见表8。
[0158]
表8 4-二甲氨基吡啶准确度
[0159]
[0160][0161]
实验结果表明，4-二甲氨基吡啶在80％限度浓度、100％限度浓度、120％限度浓度下的回收率均在85％～110％之间，符合要求。因此方法的准确度良好。
[0162]
7、重复性
[0163]
溶液的配制
[0164]
佐匹克隆准确度中6份100％限度浓度加标样品的结果作为重复性结果。
[0165]
分别计算6份100％std-spl溶液的4-二甲氨基吡啶含量，并将结果输入表10。
[0166]
验证结果见表9、10。
[0167]
8、中间精密度
[0168]
溶液配制
[0169]
精密称取4-二甲氨基吡啶0.01002g于10ml容量瓶，加稀释剂溶解稀释至刻度，得对照品储备液ⅰ。
[0170]
用0.5ml移液管移取对照品储备液ⅰ0.5ml于10ml容量瓶中，加稀释剂定容，摇匀, 标记为对照品储备溶液ⅱ。
[0171]
用1ml移液管移取对照品储备液ⅱ1.0ml于10ml容量瓶中，加稀释剂定容摇匀，得对照品储备溶液ⅲ。
[0172]
用1ml移液管移取对照品储备溶液ⅲ1.0ml于100ml容量瓶中，加稀释剂定容摇匀，标示为std-1。
[0173]
中间精密度溶液的配制
[0174]
spl-100％std-1-b～spl-100％std-6-b溶液：精密称取佐匹克隆0.00992g、0.01003g、 0.01001g、0.00997g、0.01008g、0.01005g，分别转移至6个100ml容量瓶中，加入 1.0ml对照品储备溶液
ⅲ-
1，用稀释剂稀释至刻度，摇匀。分别标示为spl-100％std-1-b～ spl-100％std-6-b。
[0175]
以上溶液分别进样分析
[0176]
计算6份std-spl溶液的4-二甲氨基吡啶含量，并将结果输入表9、10。
[0177]
计算12份std-spl中4-二甲氨基吡啶含量的rsd％，并将结果输入表9、10。
[0178]
表9中间精密度系统适用性
[0179][0180][0181]
表10精密度
[0182][0183]
实验结果表明，4-二甲氨基吡啶在100％限度浓度下连续6次测定的rsd≤6％，100％限度浓度下12次测定的rsd≤11％，因此本方法的重复性和中间精密度符合要求。