一种裸藻多糖含量的定量测定方法与流程

1.本发明涉及分析化学技术领域，特别涉及一种裸藻多糖含量的定量测定方法。


背景技术：

2.裸藻多糖是裸藻所特有的一种具有β-1,3-d-葡聚糖结构的线性多糖，裸藻多糖与膳食纤维一样不易消化，利用微波处理将其内部降解后会发现螺旋状缠绕的复杂结构中有无数的小孔。内部为多孔结构，因此吸附性能极佳，因此可以吸附体内多余物质如胆固醇、中性脂肪、重金属、酒精等并排出体外，同时促进体内有益酶的活性，调整肠胃。裸藻多糖具有抗氧化作用和清除自由基的作用。降低胆固醇和降血糖作用效果明显。
3.裸藻多糖具有作为免疫刺激剂和免疫增强剂的潜在性质，其硫酸化衍生物也显示出抗hiv活性。此外，裸藻多糖及其修饰物能刺激免疫系统尤其是巨噬细胞，增强免疫活力，其抗癌、抗细菌活性和抗病毒的活性极强。这些免疫调节和抗肿瘤活性体现出纤细裸藻在生物医学领域具有潜在的应用。裸藻多糖对小鼠急性肝中毒有缓解作用，具有成为保肝药的重要潜力。
4.在一些已经报道的专利及文献中，裸藻多糖含量的测定都是利用多糖含量测定的常规方法，如苯酚硫酸法和蒽酮法等，但是常规的方法测定时，由于其中会有其他单糖及不同种类的多糖，通常导致测量结果不准确。结合裸藻多糖结构来看，由于其结构的高度集中，是仅由线性β-1，3-葡聚糖构成的多糖体，可以考虑β-葡聚糖特定的测定方法以提高裸藻多糖含量测定的准确性。而β-葡聚糖含量的准确测定一直是其研究开发的主要困难之一。
5.目前，β-葡聚糖的定量测定方法主要是酶法和流动注射(fia)荧光法，前者会由于酶的纯度不高，测量结果通常是不准确的，而高纯度的特异性β-葡聚糖水解酶非常昂贵，这在很大程度上限制这种方法的使用。fia法具有高效率和准确性高的优点，但是仪器昂贵。荧光增白剂钙calcoflour和β-葡聚糖的结合能力会受到很多因素的影响，比如说calcoflour的发光以及实验条件等。所以这种方法也难以得到广泛的应用。
6.关于多糖含量定量测定方面的内容已公开的一部分了相关专利。
7.中国专利cn109682893a公开了一种香菇多糖组合物中香菇多糖含量的测定方法，包括：采用高效液相色谱法对香菇多糖组合物样品供试溶液进行洗脱，然后进行香菇多糖含量的测定。该方法能够有效排除右旋糖酐等辅料对香菇多糖含量测定的影响，提高了含量测定的精确性，适用于各种香菇多糖制剂的含量测定。
8.中国专利cn103969384b公开了一种毛蚶多糖的含量测定方法，先用凝胶色谱柱高效液相色谱法确定被测样品中的多糖是毛蚶多糖，再用分光光度法测定含量。
9.中国专利cn1220876c公开了一种灰树花多糖中淀粉含量的测定方法，其方法包括脂溶性成分除去，可溶性糖类干扰物质除去，酶法分解淀粉，淀粉酶解检测，淀粉酶解液处理，斐林法测定还原糖含量等步骤。该发明的方法具有可操作性强、测定结果稳定可靠、测定结果的变异系数小、误差小、重现性高等优点。
10.中国专利cn100567956c公开了一种荔枝多糖含量的测定方法，该发明提供了一种在用苯酚一硫酸法测定荔枝多糖时解决蛋白质干扰的方法，其主要内容包括：(1)粗多糖的制备；(2)精制荔枝多糖的制备；(3)样品液制备和测定；(4)荔枝粗多糖中净多糖含量确定；(5)多糖含有的蛋白质在苯酚一硫酸法测定多糖时产生的吸光度与其含量之间函数关系的建立；(6)样品液蛋白质产生的吸光度计算；(7)样品多糖含量计算。
11.中国专利cn102252978b公开了一种虫草菌丝体错多糖的测定方法，包括如下步骤：(1)供试品溶液的制备；(2)标准曲线的制备；(3)虫草菌丝体中粗多糖吸收系数的确定；(4)按步骤(1)-(3)重复n次，获得多个供试品待测液的吸收系数e2、e3、e4
……
en，计算e1、e2、e3、e4
……
en的平均值e，即为虫草菌丝体中粗多糖的吸收系数；(5)利用确定的吸收系数e根据下述公式计算虫草菌丝体中粗多糖的含量。
12.然而上述记载的各种不同多糖的测定方法均仅适用于各个特定的多糖，经实验表明该些方法也均无法准确地测定裸藻多糖含量，测量结果不准确。
13.因此，需要一种新的裸藻多糖含量的定量测定方法，以解决上述技术问题。


技术实现要素：

14.本发明的目的在于提供一种重复性好且准确性高的裸藻多糖含量测定方法。
15.为了达到上述目的，根据本发明的一方面，提供一种裸藻多糖含量的定量测定方法，所述定量测定方法是以刚果红染色的样品溶液作为待测溶液，在最大吸收波长540nm下测定所述待测溶液的吸光度，并根据标准方程计算出样品溶液中裸藻多糖的含量。
16.在一些实施例中，以刚果红溶液对所述样品溶液进行染色，所述待测溶液为所述样品溶液与所述刚果红溶液按照体积比为1:2的比例混合而成。
17.在一些实施例中，所述刚果红溶液的溶剂为ph值为8的磷酸缓冲液。
18.在一些实施例中，所述磷酸缓冲液的浓度为0.1mol/l。
19.在一些实施例中，所述刚果红溶液的浓度为150μg/ml。即，每1ml磷酸缓冲液中含有150μg市售刚果红粉。
20.在一些实施例中，所述样品溶液的溶剂为二甲基亚枫溶液(dmso溶液)。
21.在一些实施例中，所述二甲基亚枫溶液的体积浓度为10％。即，所述二甲基亚枫溶液为以市售纯二甲基亚枫与水的体积比为1:9的比例制成。
22.在本技术一优选实施例中，提供一种裸藻多糖含量的定量测定方法，包括步骤：在最大吸收波长540nm下测定标准溶液的吸光度，绘制标准曲线并获得标准方程；以刚果红染色的样品溶液作为待测溶液，在最大吸收波长540nm下测定所述待测溶液的吸光度；以及，根据所述标准方程计算获得所述样品溶液中所述裸藻多糖的含量；其中，
23.所述标准溶液为裸藻多糖标准液与刚果红溶液按照体积比为1:2的比例混合的混合溶液；所述裸藻多糖标准液的溶剂为二甲基亚枫溶液，所述裸藻多糖标准液中裸藻多糖的质量浓度为5μg/ml～100μg/ml；所述刚果红溶液的浓度为150μg/ml，溶剂为ph值为8的磷酸缓冲液；以所述刚果红溶液染色所述样品溶液，所述待测溶液为所述样品溶液与所述刚果红溶液按照体积比为1:2的比例混合而成；并且，所述样品溶液的溶剂为二甲基亚枫溶液。
24.本技术所述裸藻多糖含量的定量测定方法中，利用刚果红对样品中的裸藻多糖进
行染色，以大幅降低样品中蛋白质及单糖等杂质对定量检测的影响，从而提高裸藻多糖含量测定的准确性。经验证表明，本技术所述裸藻多糖含量的定量测定方法可以准确测定样品中裸藻多糖的含量，且具有很高的精确度，计算得相对标准偏差仅在3％左右。并且，当样品中含有各种杂质时，该些杂质并不会影响裸藻多糖含量的测定。
附图说明
25.图1：最大吸收波长的确定；
26.图2：根据本发明一实施例的裸藻多糖含量的定量测定方法中的标准曲线。
具体实施方式
27.以下，结合具体实施方式，对本发明的技术进行详细描述。应当知道的是，以下具体实施方式仅用于帮助本领域技术人员理解本发明，而非对本发明的限制。
28.实施例1.最大吸收波长的确定
29.在本实施例中，首先以紫外可见光分光光度计通过全波长扫描(190-800nm)的方法，确定了本发明所述裸藻多糖含量的定量测定方法中的最大吸收波长。
30.取一定量高度纯化的裸藻多糖(cat#89862,sigma aldrich corporation,st.louis,mo,usa)，溶解于10％的dmso溶液中，配制成裸藻多糖母液。将0.015g刚果红粉末，溶解于0.1mol/l、ph 8.0的磷酸缓冲液中，定容到100ml备用。使用紫外可见光分光光度计对对1ml裸藻多糖母液和2ml刚果红溶液的混合液进行全波段的吸收光谱扫描，并1ml的10％dmso溶液和2ml刚果红溶液的混合液为空白对照，获得如图1所示的检测结果。由此，确定本发明所述裸藻多糖含量的定量测定方法的最合适的最大吸收波长(测量波长)为540nm。
31.实施例2.裸藻多糖含量的定量测定
32.在本实施例中，提供一种裸藻多糖含量的定量测定方法，包括步骤：在最大吸收波长540nm下测定标准溶液的吸光度，绘制标准曲线并获得标准方程；以刚果红染色的样品溶液作为待测溶液，在最大吸收波长540nm下测定所述待测溶液的吸光度；以及，根据所述标准方程计算获得所述样品溶液中所述裸藻多糖的含量；其中，
33.所述标准溶液为裸藻多糖标准液与刚果红溶液按照体积比为1:2的比例混合的混合溶液；所述裸藻多糖标准液的溶剂为二甲基亚枫溶液，所述裸藻多糖标准液中裸藻多糖的质量浓度为5μg/ml～100μg/ml；所述刚果红溶液的浓度为150μg/ml，溶剂为ph值为8的磷酸缓冲液；以所述刚果红溶液染色所述样品溶液，所述待测溶液为所述样品溶液与所述刚果红溶液按照体积比为1:2的比例混合而成；并且，所述样品溶液的溶剂为二甲基亚枫溶液。
34.具体来说，在本实施例中，所述裸藻多糖含量的定量测定方法包括以下步骤：
35.(一)标准溶液的制备
36.取纯化的裸藻多糖(cat#89862,sigma aldrich corporation,st.louis,mo,usa)，以少量10％的dmso溶液为溶剂，以超声辅助溶解中，配制成裸藻多糖母液。将0.015g刚果红粉末，溶解于0.1mol/l、ph 8.0的磷酸缓冲液中，定容到100ml备用。
37.取10组10ml试管，第一组只包含一只试管，其他组每组都包含3只平行试管。每组
分别加入上述裸藻多糖母液0、5、10、20、50、100、150、200、500、1000μg，然后用10％dmso补充至1ml，以获得浓度为0.5μg/ml、1.0μg/ml、2.0μg/ml、5.0μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml、50μg/ml、100μg/ml的裸藻多糖标准液。
38.向以上试管中加入2ml的刚果红溶液，摇匀使其充分反应后获得标准溶液。
39.(二)绘制标准曲线
40.对上述各标准溶液分别在540nm处测定光度吸收值(即od值)，以裸藻多糖浓度为横坐标(x)，以吸光度值为纵坐标(y)，绘制获得如图2所示的标准曲线，获得回归方程为y＝0.0021x 0.0251，相关系数(r2＝0.9975)。
41.在本步骤中，得出结论：本发明所述方法在裸藻多糖浓度5μg/ml～100μg/ml的质量浓度范围内符合比尔定律，回归效果显著。
42.(三)样品测定
43.取0.050g样品，溶于10％dmso中制成样品溶液。取1ml样品溶液，加入2ml的刚果红溶液，混合均匀。待反应完全后，在540nm测定od值，根据步骤(二)的回归方程及图2所示的标准曲线即可计算得出样品中裸藻多糖的含量。
44.实施例3.验证实施例
45.在本实施例中，对实施例2的所述裸藻多糖含量的定量测定进行验证。验证步骤包括：
46.纯化裸藻多糖的制备：称取1g质量干燥的裸藻粉末，将之悬浮于20ml、8.5g/l的sds溶液中，超声处理18.5min(超声3s,间隔4s)，然后将悬浮液离心(4000rpm,5min)去上清,往沉淀中加入40ml1g/l的sds溶液，置于95℃水浴1h，4000rpm离心5min去上清，往沉淀中加入0.1g/l的sds溶液，50℃水浴0.5小时，离心，用蒸馏水洗涤两次。冷冻干燥即得裸藻多糖然后将之悬浮离心(4000rpm,5min)，去上清，往沉淀中加入1g/l 40ml的sds溶液，至于95℃水浴1h，4000rpm离心去上清，用蒸馏水洗涤两次，冷冻干燥即得纯化裸藻多糖。
47.取0.050g上述纯化的裸藻多糖，溶于10％dmso中制成样品溶液，取1ml样品溶液，加入2ml的刚果红溶液，混合均匀，待反应完全。以实施例2记载的定量测定方法进行测定，在540nm测定od值，根据实施例2中步骤(二)的回归方程及图2所示的标准曲线计算得出纯化的裸藻多糖中裸藻多糖的含量为0.9569g/g。
48.表明本发明所述定量测定方法的测定结果准确。
49.实施例4.杂质对于测定结果的影响
50.在本实施例中，考量反应杂质对于本发明所述裸藻多糖的含量的定量测定方法的影响。
51.在测定体系1ml中分别添加1mg和10mg的葡萄糖、可溶性淀粉以及酪蛋白，考察这些杂质对该方法的的影响，其结果如表一所示。
52.表一.裸藻多糖标样与含杂质的裸藻多糖标样的吸光度
[0053][0054]
其中，样品i为裸藻多糖标样(μg/ml)、样品ⅱ为标样 葡萄糖(μg/ml)、样品ⅲ为标样 可溶性淀粉(μg/ml)、样品ⅳ为标样 蛋白质(μg/ml)。
[0055]
由表一结果可见，在含量远高于β-葡聚糖的情况下，除了10mg的可溶性淀粉对测定的结果影响较大以外，其他的杂质对测量的结果都影响不大。在实验过程中发现，加入10mg的可溶性淀粉到1ml反应体系中，并不能完全让溶解，会使反应体系浑浊，影响od值。这说明裸藻多糖与刚果红的结合具有良好的专一性。
[0056]
实施例5.精密度实验
[0057]
相对标准偏差rsd是指：标准偏差与测量结果算数平均值的比值。可在检验检测工作中分析结果的精密度。因此，在本实施例中，对同一种样品重复试验5次，在本实施例中，对本发明所述裸藻多糖的含量的定量测定方法的精密度进行考量，并获得如表二所示结果。
[0058]
表二、标样的相对标准偏差
[0059][0060]
由表二可见，利用本发明所述裸藻多糖的含量的定量测定方法进行的裸藻多糖含量的测定结果，其rsd值仅在3％左右，说明本发明所述定量测定方法的重复性较好，精密度高。
[0061]
本发明已由上述相关实施例加以描述，然而上述实施例仅为实施本发明的范例。必需指出的是，已公开的实施例并未限制本发明的范围。相反地，包含于权利要求书的精神及范围的修改及均等设置均包括于本发明的范围内。