一种利用低频高强度超声波预处理协同可得然凝胶多糖改善大豆分离蛋白凝胶特性的方法与流程

1.本发明涉及大豆蛋白加工特性的调控领域，具体涉及一种通过低频高强度超声预处理后，添加可得然凝胶多糖，通过蛋白与多糖的相互作用改善spi凝胶特性的方法。


背景技术：

2.spi具有较高的营养价值和丰富的功能特性，其在香肠、火腿等加工肉制品中得到广泛应用，提高了肉制品的营养和食用品质。作为使用最为广泛的植物蛋白肉原料，spi的必需氨基酸组成符合人体需求，除了蛋氨酸含量略低外其余必需氨基酸丰富，更为重要的是spi的消化率约为60%，经热处理后可以提高至90%，与动物肉接近。在经蛋白质消化率修正氨基酸得分量表上，加工后的spi与动物蛋白的得分相当，因此spi是传统动物蛋白的最佳替代品。
3.spi功能特性主要取决于其蛋白组成、结构、变性和聚集程度。蛋白凝胶特性可以将水分、脂肪、风味以及色素物质包裹在三维网络结构中，对于食品品质和食品纹理的形成具有非常重要的作用。热、酸、盐、酶等方式均能诱导蛋白凝胶形成，但热处理是食品加工中最常见、最基本的处理手段。spi热诱导凝胶形成，首先需要加热使多肽链展开暴露更多的作用位点，然后展开的蛋白质分子相互作用并发生聚集，最后聚集体凝聚形成网络结构。spi凝胶能力和黏弹性很大程度上取决于分子间的相互作用，如氢键和共价键(二硫键)，静电和疏水相互作用。目前，商业化生产的spi仍然采用碱提酸沉 喷雾干燥的方式进行生产，致使蛋白发生一定程度的变性，溶解性下降，且spi对离子、ph值、温度等极端外部环境敏感，因此spi凝胶在食品生产、存储运输过程中易于絮凝聚集，凝胶保水力下降，产生不好的口感质地，限制了spi在食品领域的应用。
4.许多技术被用来修饰和改变大豆蛋白的结构和聚集性，从而改善其功能特性。超声波技术是一种常见的物理技术，通过超声波与介质相互作用，使介质发生物理和化学变化，从而产生空化效应、机械效应和热效应，广泛应用于辅助成分提取领域。其操作特点是简单、节能、省时和环保。超声波可以破坏非共价相互作用，甚至可以断裂肽键，引起结构的变化，同时也会引起蛋白功能特性的改变。近年来的研究表明超声波处理可使spi平均粒径减小，溶解性增加，表面疏水性增强，二级结构改变，可以促进spi形成结构均匀、致密的改性凝胶。因此，对spi溶液进行超声预处理有利于其后续凝胶特性的改善。
5.虽然超声处理作为一种物理改性的手段，可以增强 spi 的凝胶性能、改善胶凝能力。但如果仅仅依靠超声波这一种手段，改善蛋白凝胶特性的效果是有限的，spi凝胶仍未突破弱凝胶的范围。为了进一步提高spi凝胶特性，本方法将超声波技术与其他技术相结合（即添加多糖通过蛋白与多糖之间的相互作用）对spi进行改性，以获得更强改善其功能特性的效果。
6.可得然是一种中性细菌胞外多糖，其直链状分子完全由d
‑
葡萄糖单元通过β
‑
（1
→
3）糖苷键连接。可得然凝胶多糖可以形成两种类型的凝胶（trc和tirc），二者具有不同的物
理稳定性，保水、保油特性、热力学特性和流变学特性。当将可得然水溶液加热至55
–
60 ℃，然后冷却至40 ℃以下时，所获得的可得然凝胶多糖是热可逆的。当将该水溶液加热到80 ℃以上时，可形成tirc。由于两种凝胶类型以及它们各自独特的热力学和流变学特性，可得然凝胶多糖已广泛用于食品工业中，以改善产品的品质。有研究将带鱼肉沫与可得然凝胶多糖以1
‑
3%的浓度混合时，鱼肉凝胶的强度增加；两种类型的可得然凝胶多糖可以通过不同的作用方式，有效地改善肌原纤维蛋白的胶凝特性。目前，可得然凝胶多糖多用于动物蛋白的改性，对植物蛋白的改性方面却鲜有研究；利用超声波技术预处理后可获得较好凝胶特性的蛋白，但通过低频高强度超声预处理后添加可得然凝胶多糖对蛋白进行复合改性的技术方法鲜见报道。
7.基于此，我们发明并建立了一种利用低频高强度超声波预处理协同可得然凝胶多糖改善spi凝胶特性的方法。本发明为利用可得然凝胶多糖改善spi凝胶特性提供了新的思路。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于，首先通过超声预处理提高spi的溶解性，然后制备trc和tirc，最后利用两种可得然凝胶多糖与spi充分反应，从而提高spi形成凝胶的能力，改善spi凝胶的品质。本发明首先以20 khz的不同功率输出功率（200w~600w）分别处理10~30min对spi溶液进行超声处理，均使spi的溶解特性显著改善。其中400w、10min对spi溶解特性的改善能力最好。spi经过超声预处理（400w、10min）后，与两种可得然凝胶多糖充分混合均匀，然后于4℃下水合至少12h，使二者充分相互作用，反应体系中spi终浓度为100mg/ml，两种可得然凝胶多糖终浓度为0.1%~0.5%（w/w,基于spi溶液的总重量计）。最后称取反应后样品利用水浴加热，从25℃加热至75℃后保温30 min制备spi凝胶。
9.本发明的优点：1、超声波技术是一种绿色的食品物理加工技术，基于低频率高强度超声波（频率20～100 khz、强度＞1 w/cm2）处理下可以改善spi功能特性。高强度超声波通过“空化效应”产生机械、化学、热作用等，可使spi平均粒径减小，溶解性增加，表面疏水性增强，二级结构改变，可以促进spi形成结构均匀、致密的改性凝胶;2. 两种类型的可得然凝胶多糖（trc和tirc），具有不同的物理稳定性，保水、保油能力以及质地特征。通过蛋白与多糖的相互作用，可以很好地改善spi凝胶的功能特性。两种可得然凝胶多糖促进了spi结构的展开，改变了spi的三级结构，显著增强了spi复合凝胶的持水性和凝胶强度;3. 与常用的多糖相比（纤维素、淀粉、黄原胶和卡拉胶），可得然具有独特的理化和功能特性，可得然在热水（通常约55
°
c）中，形成的trc对温度具有可逆性，强度较低；在高温（80~100
°
c）的水悬浮液中加热后，它会形成有弹性的tirc，在加热或冷却后均不会再次融化，且可得然凝胶多糖在高温下也是无色无味的。通过低频高强度超声预处理和添加可得然凝胶多糖可以显著改善spi的凝胶特性。本发明为改善spi凝胶特性提供了新的思路。
附图说明
10.图1 超声预处理spi溶液溶解度图示，注：control:未经超声处理的spi溶液；
200w
‑
10m、20m、30m：200w的输出功率分别超声10、20、30分钟的spi溶液；400w
‑
10m、20m、30m：400w的输出功率分别超声10、20、30分钟的spi溶液；600w
‑
10m、20m、30m：600w的输出功率分别超声10、20、30分钟的spi溶液；图2 超声预处理spi溶液粒径分布图示，注：control:未经超声处理的spi溶液；200w
‑
10m、20m、30m：200w的输出功率分别超声10、20、30分钟的spi溶液；400w
‑
10m、20m、30m：400w的输出功率分别超声10、20、30分钟的spi溶液；600w
‑
10m、20m、30m：600w的输出功率分别超声10、20、30分钟的spi溶液；图3 spi
‑
trc溶胶荧光光谱图示，注：control:经超声处理的spi溶胶；trc
‑
0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%：经超声处理后分别添加0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的trc的spi溶胶；图4 spi
‑
tirc溶胶荧光光谱图示，注：control:经超声处理的spi溶胶；tirc
‑
0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%：经超声处理后分别添加0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的tirc的spi溶胶；图5 spi凝胶强度图示，注：n
‑
u:未经超声处理凝胶；u：经超声处理的spi凝胶；n
‑
u
‑
trc
‑
0.2%：未经超声处理但添加了0.2%trc的spi凝胶；n
‑
u
‑
tirc
‑
0.2%：未经超声处理但添加了0.2%tirc的spi凝胶；u
‑
trc
‑
0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%：经超声处理后分别添加0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的trc的spi凝胶；u
‑
tirc
‑
0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%：经超声处理后分别添加0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的tirc的spi凝胶；图6 spi凝胶蒸煮损失图示，注：n
‑
u:未经超声处理凝胶；u：经超声处理的spi凝胶；n
‑
u
‑
trc
‑
0.2%：未经超声处理但添加了0.2%trc的spi凝胶；n
‑
u
‑
tirc
‑
0.2%：未经超声处理但添加了0.2%tirc的spi凝胶；u
‑
trc
‑
0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%：经超声处理后分别添加0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的trc的spi凝胶；u
‑
tirc
‑
0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%：经超声处理后分别添加0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的tirc的spi凝胶；图7 spi
‑
trc凝胶储能模量图示，注：n
‑
u:未经超声处理凝胶；u：经超声处理的spi凝胶；n
‑
u
‑
trc
‑
0.2%：未经超声处理但添加了0.2%trc的spi凝胶； u
‑
trc
‑
0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%：经超声处理后分别添加0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的trc的spi凝胶；图8 spi
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tirc凝胶储能模量图示，注：n
‑
u:未经超声处理凝胶；u：经超声处理的spi凝胶； n
‑
u
‑
tirc
‑
0.2%：未经超声处理但添加了0.2%tirc的spi凝胶； u
‑
tirc
‑
0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%：经超声处理后分别添加0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的tirc的spi凝胶；图9 spi
‑
trc凝胶损耗模量图示，注：n
‑
u:未经超声处理凝胶；u：经超声处理的spi凝胶；n
‑
u
‑
trc
‑
0.2%：未经超声处理但添加了0.2%trc的spi凝胶； u
‑
trc
‑
0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%：经超声处理后分别添加0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的trc的spi凝胶；图10 spi
‑
tirc凝胶损耗模量图示，注：n
‑
u:未经超声处理凝胶；u：经超声处理的spi凝胶； n
‑
u
‑
tirc
‑
0.2%：未经超声处理但添加了0.2%tirc的spi凝胶； u
‑
tirc
‑
0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%：经超声处理后分别添加0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的tirc的spi凝胶。
具体实施方式
11.以下结合附图和实施例，对本发明进行进一步的详细说明。
12.1. 以20 khz的不同功率输出功率（200w~600w）分别处理10~30min（脉冲持续时间5 s和关闭时间2 s）对spi溶液进行超声处理。通过分析溶解度(附图1)、粒径（附图2），最终选取400w、10min为超声预处理的最佳条件。
13.2、将可得然溶液在55℃的恒温水浴中连续搅拌15min制备trc；将可得然溶液在90℃的恒温水浴中连续搅拌15min制备tirc。
14.3. 将0.1%~0.5%（w/w,基于spi溶液的总重量计）的两种凝胶多糖加入到400w、10min超声预处理过的蛋白浓度为100 mg/ml spi溶液中，混合均匀，于4℃下水合至少12 h，使二者充分相互作用。然后测定溶胶的荧光强度（附图3、图4）,从附图3、图4可以看出加入trc或tirc分别以浓度依赖的方式显著降低了spi复合溶胶的色氨酸荧光强度，trc或tirc可以与trp残基相互作用，并在spi的三级结构展开过程中增强极性环境。这有效地降低了spi
‑
trc和spi
‑
tirc溶胶的总体色氨酸荧光强度。
15.4. spi复合凝胶的制备：称取反应后的样品5 g，置于10 ml烧杯中放入水浴锅，从25℃加热至75℃后保温30 min取出，取出后的样品立即冰浴来终止反应，在4℃下放置过夜后测定凝胶强度（附图5）和蒸煮损失（附图6）。从附图5可以看出，经超声处理后凝胶强度提升，trc和tirc的加入也明显增加了凝胶强度，且超声和多糖之间存在协同作用，经超声处理后再加多糖处理组明显凝胶强度要高于只进行超声处理组和只加多糖组。trc和tirc的添加增强了spi和trc、tirc之间的氢键相互作用、疏水相互作用，改善凝胶的质构特性；从附图6可以看出，超声处理、trc和tirc的添加明显降低了凝胶的蒸煮损失，且两者之间存在协同作用，提高了凝胶的保水性。
16.5. 将1.5 ml的可得然凝胶多糖和spi混合溶液以2
°
c / min的速度从25
°
c加热到75
°
c，使用1 hz的恒定频率和1％的应变来测试储能模量（g'，pa）（附图7、图8），损耗模量（g''，pa）(附图9、图10)。超声处理后g' 、g''都有所增加，trc和tirc的添加显著提高了复合凝胶的g'值，尤其是高浓度凝胶多糖的复合凝胶，超声和多糖之间的协同作用较为明显。这表明通过超声处理和添加可得然凝胶多糖可以形成更强的凝胶结构。g''描述了凝胶的粘性性质，更大的粘度与更好的保水性有关，在当前的研究中，g''值随着两种可得然凝胶多糖浓度的增加而逐渐增加，保水性显著增强。