发酵方法、发酵产物及包含其的试剂盒与流程

1.本发明涉及发酵领域，具体而言，涉及一种发酵方法、发酵产物及包含其的试剂盒。


背景技术：

2.人参，味甘微寒，主补五脏，安精神，定魂魄，止惊悸，除邪气，明目，开心益智。久服，轻身延年。一名人衔，一名鬼盖。生山谷。
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《神农本草经》。
3.萎蕤(又叫玉竹)，性平，味甘，柔润可食。
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《本草纲目》。
4.莲之味甘，气温而性涩，禀清芳之气，得稼穑之味，乃脾之果也。土为元气之母，母气既和，津液相成，神乃自生，久视耐老，以其权舆也。昔人治心肾不交，劳伤白浊，有清心莲子饮；补心肾，益精血，有瑞莲丸，皆得此理。
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《本草纲目》。
5.薏苡仁，阳明药也，能健脾，益胃。虚则补其母，故肺痿肺痈用之。筋骨之病，以治阳明为本，故拘挛筋急，风痹者用之。土能生水除湿，故泄痢水肿用之
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《本草纲目》。
6.人参、玉竹、莲子、薏苡仁作为传统的药材及食品在我国具有悠久的利用传统，现有技术中也有将上述成成作为添加物与众多其他成分混合作为一种普通食品，或者以其中单一成分进行发酵或者与其他物质组合进行发酵，然而这些食品或发酵产品其在药用、食用或护肤方面的功效，仍未得到有效的开发和利用。


技术实现要素：

7.本发明的主要目的在于提供一种发酵方法、发酵产物及包含其的试剂盒，以解决现有技术中对传统中药材和食材在药用、食用或护肤方面的功效开发利用程度仍较低的问题。
8.为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种发酵方法，该发酵方法包括：以人参、玉竹、莲子及薏苡仁为原材料配制待发酵液，利用多种菌对待发酵液进行联合发酵，得到发酵产物，其中，多种菌包括至少一种酵母菌及至少一种乳酸菌。
9.进一步地，采用多种菌对待发酵液进行联合发酵，得到发酵产物的步骤包括：将多种菌与待发酵液混合后进行初培养，得到初培养物；对初培养物进行厌氧或好氧培养，得到发酵产物。
10.进一步地，采用多种菌对待发酵液进行联合发酵，得到发酵产物的步骤包括：将酵母菌与待发酵液混合后进行初培养，得到初培养物；利用乳酸菌对初培养物进行厌氧或好氧培养，得到发酵产物。
11.进一步地，采用多种菌对待发酵液进行联合发酵，得到发酵产物的步骤包括：将乳酸菌与待发酵液混合后进行初培养，得到初培养物；利用酵母菌对初培养物进行厌氧或好氧培养，得到发酵产物。
12.进一步地，采用多种菌对待发酵液进行联合发酵，得到发酵产物的步骤包括：将乳酸菌与待发酵液混合后进行发酵培养，得到第一发酵培养物；将酵母菌与待发酵液混合后
进行发酵培养，得到第二发酵培养物；将第一发酵培养物与第二发酵培养物混合，得到发酵产物；优选地，将第一发酵培养物与第二发酵培养物按等体积混合，得到发酵产物。
13.进一步地，以人参、玉竹、莲子及薏苡仁为原材料配制待发酵液的步骤包括：将人参、玉竹、莲子及薏苡仁混合得到混合材料；对混合材料进行酶解处理，得到酶解液；向酶解液中添加氮源和碳源，得到待发酵液；其中，酶解包括淀粉酶酶解、糖化酶酶解以及蛋白酶酶解；优选地，以重量份计，人参、玉竹、莲子及薏苡仁的混合比例为1～10：1～10：1～10：1～10；优选地，按重量份计，在100份去离子水中，加入1～20份的混合材料进行酶解处理；优选地，氮源选自硫酸铵、氯化铵、水解大豆蛋白、酵母提取物及奶粉中的任意一种或多种；更优选，氮源的添加量为0.5-10份；优选地，碳源选自葡萄糖、果糖、麦芽糖及水解淀粉中的任意一种或多种；更优选，碳源的添加量为0.5-20份。
14.进一步地，在待发酵液在进行联合发酵之前，发酵方法还包括对待发酵液进行灭菌的步骤，优选地，灭菌的温度为80℃～130℃，灭菌的时间为3s～240min。
15.进一步地，初培养在25℃～30℃采用摇床培养24～96h，优选摇床的转速为160～200rpm/min。
16.进一步地，厌氧培养或好氧培养的步骤为：向初培养物中加入氮源和碳源，得到初发酵液；调节初发酵液的ph值至6.5～7.5后进行厌氧培养或好氧培养；优选地，厌氧培养或好氧培养的时间为24～240h，温度为35～37.5℃。
17.进一步地，在利用多种菌对待发酵液进行联合发酵之前，发酵方法还包括：分别对至少一种酵母菌以及至少一种乳酸菌依次进行菌种活化、菌种纯化以及扩大培养的步骤。
18.进一步地，酵母菌选自保藏编号为cctcc no:m2017781的酿酒酵母a3.12、保藏编号为cctcc no:m2017780的毕赤酵母c1.8或保藏编号为cctcc no:m2017782的假丝酵母c1.7；优选地，乳酸菌选择保藏编号为cctcc no:m2017625的戊糖乳杆菌001、保藏编号为cctcc no:m2017631的干酪乳杆菌001、保藏编号为cctcc no:m2017628的嗜酸乳杆菌001、保藏编号为cctcc no:m2017629的植物乳杆菌001或cctcc no:m2017630的鼠李糖乳杆菌001。
19.进一步地，按重量份计，多种菌中包括0.1～5份的酵母菌与0.1～5份的乳酸菌；优选地，按重量份计，多种菌与待发酵液的用量比为0.2～10：100～200。
20.为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种发酵产物，发酵产物采用上述任一种发酵方法发酵得到。
21.为了实现上述目的，根据本发明的第三个方面，提供了一种发酵试剂盒，该试剂盒包括发酵原材料、至少一种酵母菌及至少一种乳酸菌，发酵原材料为人参、玉竹、莲子及薏苡仁。
22.进一步地，酵母菌选自保藏编号为cctcc no:m2017781的酿酒酵母a3.12、保藏编号为cctcc no:m2017780的毕赤酵母c1.8及保藏编号为cctcc no:m2017782的假丝酵母c1.7中的至少一种，乳酸菌选自保藏编号为cctcc no:m2017625的戊糖乳杆菌001、保藏编号为cctcc no:m2017631的干酪乳杆菌001、保藏编号为cctcc no:m2017628的嗜酸乳杆菌001、保藏编号为cctcc no:m2017629的植物乳杆菌001及保藏编号为cctcc no:m2017630的鼠李糖乳杆菌001中的至少一种。
23.应用本发明的技术方案，通过利用酵母菌及乳酸菌等可食用安全菌种的发酵特
性，对包含人参、玉竹、莲子及薏苡仁的原料组合进行发酵，此两类菌在生长过程中所产生功效物质种类多，酶系复杂，能够促进原料中不同功效成分的释放，从而实现中药中的功效物质含量的提升及结构的转化，提升发酵产物的整体功效。
附图说明
24.构成本技术的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
25.图1示出了根据本发明的实施例2的复合提取物与复合发酵物的保湿率。
26.菌种保藏信息
27.本发明所用的菌种均保藏在中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮政编码：430072；电话：(027)-68754052。具体菌种的保藏信息如下：
28.酿酒酵母a3.12(saccharomyces cerevisiae a3.12)于2017年12月11日保藏在中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctcc no:m2017781。
29.假丝酵母c1.7(wickerhamomyces anomalus c1.7)于2017年12月11日保藏在中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctcc no:m2017782。
30.毕赤酵母c1.8(cyberlindnera fabianii c1.8)于2017年12月11日保藏在中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctcc no:m2017780。
31.戊糖乳杆菌001(pediococcus pentosaceus 001)于2017年10月25日保藏在中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctcc no:m2017625。
32.植物乳杆菌001(lactobacillus plantarum 001)于2017年10月25日保藏在中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctcc no:m2017629。
33.鼠李糖乳杆菌001(lactobacillus rhamnosus 001)于2017年10月25日保藏在中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctcc no:m2017630。
34.嗜酸乳杆菌001(lactobacillus acidophilus 001)于2017年10月25日保藏在中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctcc no:m2017628。
35.干酪乳杆菌001(lactobacillus casei 001)于2017年10月25日保藏在中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctcc no:m2017631。
具体实施方式
36.需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
37.如背景技术所提到的，在现有技术中的发酵产品对传统中药材或食材的功效利用效率较低，为了改善这一现状，在本技术一种典型的实施方式中，提供了一种发酵方法，该发酵方法包括：以人参、玉竹、莲子及薏苡仁为原材料配制待发酵液，利用多种菌对待发酵液进行联合发酵，得到发酵产物，其中，多种菌包括至少一种酵母菌及至少一种乳酸菌。
38.上述发酵方法中的原材料为人参、玉竹、莲子及薏苡仁，其中人参中发挥各类功效的主要成分是人参皂苷，而玉竹中玉竹多糖和黄酮是其主要物质。莲子中水溶性多糖、总黄酮和超氧化物歧化酶是其主要的三大物质。薏苡仁中包含的主要活性成分包括薏苡仁酯、甘油三酯类、脂肪酸类、内酰胺类、薏苡内酯、糖类、甾醇类、三萜类等化合物。上述原料搭配
组合之后可以发挥不同功效成分间的协同增效作用，同时四者都含有丰富的淀粉、蛋白、微量元素等，可以为微生物发酵提供充足的原料物质。
39.通过利用酵母菌及乳酸菌等可食用安全菌种的发酵特性，对包含人参、玉竹、莲子及薏苡仁的原料组合进行发酵，此两类菌在生长过程中所产生功效物质种类多，酶系复杂，能够促进原料中不同功效成分的释放，从而实现中药中的功效物质含量的提升及结构的转化(如人参皂苷从普通皂苷转化为稀有人参皂苷，黄酮类物质结构改变水溶性提升等)，提升发酵产物的整体功效。
40.在一种优选的实施例中，采用多种菌对待发酵液进行联合发酵，得到发酵产物的步骤包括：将多种菌与待发酵液混合后进行初培养，得到初培养物；对初培养物进行厌氧或好氧培养，得到发酵产物。
41.将多种菌与待发酵液混合后进行初培养，目的是为了获得菌种的最佳培养条件，以利于后续发酵。然后再进行厌氧培养或好氧培养进行发酵，能够使发酵更充分，原料的利用率高。此处的好氧培养是指：发酵过程中通灭菌空气。
42.上述优选实施例中，通过将至少一种酵母菌和至少一种乳酸菌的多种菌混合后，对上述原材料的待发酵液进行联合发酵，酵母菌和乳酸菌在共生条件下存在既竞争又相互依存的关系，在竞争营养物质的同时也会给对方制造对方所需的物质。比如：乳酸菌是营养缺陷型菌株，酵母菌在发酵过程中为乳酸菌提供氨基酸维生素丙酮酸盐等物质，而乳酸菌的代谢产物可以为酵母菌提供能量来源。因此，经过初培养和后续的厌氧或好氧培养，发酵的过程中释放各种酶类，促进上述原材料中功效物质的释放，功能的提升，从而使所得的发酵产物具有抗疲劳、延缓衰老以及保湿的作用。
43.在一种优选的实施例中，采用多种菌对待发酵液进行联合发酵，得到发酵产物的步骤包括：将酵母菌与待发酵液混合后进行初培养，得到初培养物；利用乳酸菌对初培养物进行厌氧或好氧培养，得到发酵产物。
44.在一种优选的实施例中，采用多种菌对待发酵液进行联合发酵，得到发酵产物的步骤包括：将乳酸菌与待发酵液混合后进行初培养，得到初培养物；利用酵母菌对初培养物进行厌氧或好氧培养，得到发酵产物。
45.上述两种优选的实施例中，两类菌种先后进行发酵，前一种菌发酵所释放的物质可以为后一种菌提供营养物质或能量，从而使得原料中的各种功效物种充分释放，进而使得发酵产物的整体功效得以提升。
46.在一种优选的实施例中，采用多种菌对待发酵液进行联合发酵，得到发酵产物的步骤包括：将乳酸菌与待发酵液混合后进行发酵培养，得到第一发酵培养物；将酵母菌与待发酵液混合后进行发酵培养，得到第二发酵培养物；将第一发酵培养物与第二发酵培养物混合，得到发酵产物；优选地，将第一发酵培养物与第二发酵培养物按等体积混合，得到发酵产物。
47.上述的优选实施例中，分别利用两类菌种各自对四种原料进行发酵，然后将两类菌的发酵培养物混合，从而使得发酵产物包含了两类菌的发酵产物。相比单一种类的菌的发酵产物，两类菌对四种原材料的发酵产物更丰富，整体功效更好。
48.上述各种不同的联合发酵方案中，在得到发酵产物之后，还可以包括对发酵产物进行过滤得到上清液的步骤。过滤步骤去除了发酵产物中的固体残渣，使得发酵产物的性
能更优异。具体的过滤方式不限，现有任何有利于固液分离的过滤方式均适用于本技术。在本技术中，优选采用离心、板框过滤的方式进行过滤得到上清液。
49.上述发酵方法中，各原材料还需要被配制成适合菌发酵的环境条件，比如先酶解形成酶解液，然后添加包括菌种生长繁殖所需的氮源及碳源，具体的配制过程及配比可以根据实际需要进行合理调整。
50.在一种优选的实施例中，以人参、玉竹、莲子及薏苡仁为原材料配制待发酵液的步骤包括：将人参、玉竹、莲子及薏苡仁混合得到混合材料；对混合材料进行酶解处理，得到酶解液；向酶解液中添加氮源和碳源，得到待发酵液；其中，酶解包括淀粉酶酶解、糖化酶酶解以及蛋白酶酶解；优选地，以重量份计，人参、玉竹、莲子及薏苡仁的混合比例为1～10：1～10：1～10：1～10；优选地，按重量份计，在100份去离子水中，加入1～20份的混合材料进行酶解处理；优选地，氮源选自硫酸铵、氯化铵、水解大豆蛋白、酵母提取物及奶粉中的任意一种或多种；更优选，氮源的添加量为0.5-10份；优选地，碳源选自葡萄糖、果糖、麦芽糖及水解淀粉中的任意一种或多种；更优选，碳源的添加量为0.5-20份。
51.上述优选实施例中，对各原料分别按照不同酶的酶解条件进行酶解，从而将各种营养成分释放出来，以便于发酵菌充分利用原料进行生长繁殖，从而获得较好的发酵产物。四种原材料按照上述比例进行混合，便于对原料的功效成分均衡利用。氮源和碳源是发酵菌生长繁殖所需要的营养物质。上述待发酵液的原料配比具有营养丰富均衡，利于多种菌高效发酵的有益效果。氮源采用上述类别的化合物具有无机氮源与有机氮源组合同时适合酵母和乳酸菌的好处，而碳源采用单糖与多糖组合，能够满足多菌种不同时期的不同需求。
52.为了获得功效更好的发酵产物，在发酵过程中，应避免杂菌的污染，任何可能带入杂菌的成分均需要进行灭菌处理。在一种优选的实施例中，在待发酵液在进行联合发酵之前，上述发酵方法还包括对待发酵液进行灭菌的步骤，优选地，灭菌的温度为80℃～130℃，灭菌的时间为3s～240min。
53.上述初培养的具体条件可以根据所使用的菌种的不同类别进行合理优化得到。在一种优选的实施例中，初培养在25℃～30℃采用摇床培养24～96h，优选摇床的转速为160～200rpm/min。
54.摇床培养是常用的菌种培养条件筛选的培养方式。根据所使用的混合菌种的不同，选择25℃～30℃之间的温度进行培养，有利于菌种的生长繁殖。摇床的转速越大，待发酵液及菌种的接触越频繁，菌种生长速度相对较快；反之，转速越慢，待发酵液及菌种的接触频率越低，菌种生长速度相对较慢。因此，对于得到一定数量的菌体而言，转速越快，培养时间相对较短，反之，转速越慢，培养时间相对较长。
55.上述压氧培养或好氧培养是在初培养得到相对最佳的培养条件后进行的，因而，可以根据所获得的最佳培养条件进行培养即可。在一种优选的实施例中，厌氧培养或好氧培养的步骤为：向初培养物中加入氮源和碳源，得到初发酵液；调节初发酵液的ph值至6.5～7.5后进行厌氧培养或好氧培养；优选地，厌氧培养或好氧培养的时间为24～240h，温度为35～37.5℃。
56.上述优选实施例，通过在初培养阶段获得最佳的培养条件后，发酵阶段通常转移至发酵罐中进行，而发酵罐中的生长环境更接近理想环境(包括温度，ph值等)，因而生物菌体生长更旺盛，对营养的消耗较快，养料不够，因而需要补加氮源和碳源以使发酵达到最佳
状态，从而使得菌体快速生长繁殖，直到其生产能力下降。
57.上述发酵方法中，多种菌包括至少一种酵母菌与至少一种乳酸菌，所使用的菌种量是适合进行后续发酵所用的。在一种优选的实施例中，在利用多种菌对待发酵液进行联合发酵之前，上述发酵方法还包括：分别对至少一种酵母菌以及至少一种乳酸菌依次进行菌种活化、菌种纯化以及扩大培养的步骤。
58.上述对各菌种依次进行活化、纯化及扩大培养的步骤为常规步骤。具体地，在本技术某些优选的实施例中，酵母菌和乳酸菌菌种活化的步骤为：挑取假丝酵母(或其他酵母菌种)菌落一环放入ypd液体培养基中，放入摇床中将菌种活化。挑取植物乳杆菌(或其他乳酸菌菌种)菌落一环放入mrs液体培养基中，摇床中活化。
59.在另一些优选实施例中，对菌种纯化的步骤为：将活化后的两种菌液梯度稀释铺平板，以获取单个菌落。
60.在某些优选实施例中，酵母菌种扩大培养的步骤为：挑取平板中单个酵母菌菌落接种至ypd液体培养基中，28℃摇床培养，当od值＝1.0时，得到发酵菌菌液(菌种处在对数期，浓度大约为1
×
108cfu/ml)，离心收集菌体。
61.在某些优选实施例中，乳酸菌菌种扩大培养的步骤为：挑取植物乳杆菌(或上述其他乳酸菌菌种)单个菌落一环放入mrs液体培养基中，37℃厌氧或好氧培养，当od值＝0.8以上时，得到乳酸菌发酵菌液(菌种处在对数期，浓度大约为1
×
108cfu/ml)，然后离心得到菌体。
62.上述发酵方法中，酵母菌及乳酸菌均可以采用现有的菌种。在一种优选的实施例中，酵母菌选自保藏编号为cctcc no:m2017781的酿酒酵母a3.12、保藏编号为cctcc no:m2017780的毕赤酵母c1.8或保藏编号为cctcc no:m2017782的假丝酵母c1.7；优选地，乳酸菌选择保藏编号为cctcc no:m2017625的戊糖乳杆菌001、保藏编号为cctcc no:m2017631的干酪乳杆菌001、保藏编号为cctcc no:m2017628的嗜酸乳杆菌001、保藏编号为cctcc no:m2017629的植物乳杆菌001或cctcc no:m2017630的鼠李糖乳杆菌001。
63.本技术中，优选上述种类的酵母菌菌种与上述种类的乳酸菌菌种进行联合发酵，菌种在生长过程中所产生功效物质种类多，酶系复杂，具有促进待发酵液中的原料成分释放，功效提升的有益效果。
64.上述发酵方法中，根据原料的配比及菌种种类的不同，发酵所用的菌的用量也有所不同。在一种优选的实施例中，按重量份计，多种菌中包括0.1～5份的酵母菌与0.1～5份的乳酸菌；优选地，按重量份计，多种菌与待发酵液的用量比为0.2～10：100～200。将两类菌的比例控制在上述范围内，有助于缩短发酵过程，提高发酵转化效率。将多种菌与待发酵液的用量比控制在上述范围内，有助于对原料的发酵更彻底，发酵产物的功效更高。
65.在一种更优选的实施例中，当采用酵母菌与乳酸菌混合后与待发酵液进行发酵时，采用0.1～5份的酵母菌与0.1～5份的乳酸菌对100份的上述待发酵液进行发酵。当采用两类菌按照先后顺序对待发酵液进行发酵时，同样按照上述用量比进行。当分别采用两类菌对待发酵液分别发酵后再混合的方法进行发酵时，每类菌的用量为0.1～5份，均是对100份的待发酵液进行发酵。
66.在本技术第二种典型的实施方式中，还提供了一种发酵产物，该发酵产物采用上述任一种发酵方法发酵得到。本技术上述通过酵母菌和乳酸菌两类可食用菌进行不同工艺
的发酵，实现了发酵产品功效中功效物质的结构升级，有效成分的充分释放，因而具有抗疲劳、延缓衰老、保湿的作用。此外，该发酵产物中还结合了丰富的微生物代谢产物，因而所获得的发酵产物具有令人愉悦的风味。相比现有的发酵产品，本技术的发酵产品整体功效好，具有抗疲劳、延缓衰老、保湿的作用，因而，可以应用到食品、保健食品、护肤品诸多行业中。
67.在本技术第三种典型的实施方式中，还提供了一种发酵试剂盒，该试剂盒包括酵原材料、至少一种酵母菌及至少一种乳酸菌，发酵原材料为人参、玉竹、莲子及薏苡仁。当包含至少一种酵母菌和至少一种乳酸菌的混合菌的试剂盒用来对申请的四种中药材原料的待发酵液进行联合发酵时，酵母菌和乳酸菌在共生条件下存在既竞争又相互依存的关系，在竞争营养物质的同时也会给对方制造对方所需的物质。在分别进行发酵，或者先后进行发酵时，分别会释放出不同的酶类，促进原料中功效物质的释放，功能的升级，从而使所得的发酵产物具有抗疲劳、延缓衰老、保湿的作用。
68.在一种优选的实施例中，酵母菌选自保藏编号为cctcc no:m2017781的酿酒酵母a3.12、保藏编号为cctcc no:m2017780的毕赤酵母c1.8及保藏编号为cctcc no:m2017782的假丝酵母c1.7中的至少一种，乳酸菌选自保藏编号为cctcc no:m2017625的戊糖乳杆菌001、保藏编号为cctcc no:m2017631的干酪乳杆菌001、保藏编号为cctcc no:m2017628的嗜酸乳杆菌001、保藏编号为cctcc no:m2017629的植物乳杆菌001及保藏编号为cctcc no:m2017630的鼠李糖乳杆菌001中的至少一种。优选上述种类的酵母菌菌种与上述种类的乳酸菌菌种，在生长过程中所产生功效物质种类多，酶系复杂，具有促进原料中不同功效成分的释放，提升整体功效的有益效果。
69.在本技术一种最优选的实施例中，本技术的发酵产物的发酵方法包括如下步骤：
70.1)酵母菌和乳酸菌菌种活化：挑取假丝酵母(或上述其他酵母菌种)菌落一环放入ypd液体培养基中，放入摇床中将菌种活化。挑取植物乳杆菌(或上述其他乳酸菌菌种)菌落一环放入mrs液体培养基中，摇床中活化。
71.2)菌种纯化：将上步活化后的两种菌液梯度稀释铺平板，以获取单个菌落。
72.3)酵母菌种扩大培养：挑取上步平板中单个酵母菌菌落接种至ypd液体培养基中，28℃摇床培养，当od值＝1.0时，得到发酵菌菌液(菌种处在对数期，浓度大约为1
×
108cfu/ml)，离心收集菌体。
73.4)乳酸菌菌种扩大培养：挑取植物乳杆菌(或上述其他乳酸菌菌种)单个菌落一环放入mrs液体培养基中，37℃厌氧或好氧培养，当od值＝0.8以上时，得到乳酸菌发酵菌液(菌种处在对数期，浓度大约为1
×
108cfu/ml)，然后离心得到菌体。
74.5)人参、玉竹、莲子、薏苡仁处理：取干燥原料进行粉碎，处理后过80～200目筛待用。
75.6)原材料酶解及配料：人参、玉竹、莲子、薏苡仁，其比例为：1-10：1-10：1-10：1-10进行混合，在100份去离子水中，取上述混合粉按照1-20的比例添加，参照淀粉酶、糖化酶、蛋白酶的优化处理工艺进行水解处理。水解结束后加入0.5-20份葡萄糖或果糖或麦芽糖或水解淀粉，0.5-10份硫酸铵或氯化铵或水解大豆蛋白或酵母提取物或奶粉，80℃-130℃灭菌3s-240min。
76.7)发酵方法1：将0.1-5份假丝酵母菌菌体，0.1-5份植物乳杆菌菌体，加入至100份上步冷却后的原材料混合液中，25℃-30℃摇床培养24-96h(摇床转速160-200rpm/min)后
加入0.5-10份的果糖或葡萄糖或蔗糖或麦芽糖或水解淀粉，0.5-10份硫酸铵或氯化铵或大豆水解蛋白或奶粉或酵母提取物等，后调节ph＝6.5-7.5之间37℃厌氧或耗氧培养发酵24-240h。
77.发酵方法2：将0.1-5份假丝酵母菌菌体加入至100份上步冷却后的原材料混合液中，25℃-28℃摇床培养24-120h(摇床转速160-200rpm/min)后加热灭活。再次加入灭菌后的0.5-10份的果糖或葡萄糖或蔗糖或麦芽糖或水解淀粉，0.5-10份硫酸铵或氯化铵或大豆水解蛋白或奶粉或酵母提取物等，后调节ph＝6.5-7.5。再次加入0.1-5份植物乳杆菌菌体35-37℃厌氧或耗氧培养发酵24-240h。或先发酵乳酸菌后发酵酵母菌。
78.发酵方法3：将0.1-5份酵母菌菌体入至100份上步冷却后的原材料混合液中，25℃-28℃摇床培养24-96h(摇床转速160-200rpm/min)。同时将0.1-5份植物乳杆菌菌体入至100份上步冷却后的原材料混合液中，35-37℃厌氧或耗氧培养发酵24-240h。两步发酵分别结束后进行等体积混合。
79.8)澄清处理：将发酵后的发酵产物通过离心、板框过滤的方式处理得到上清液即为复合发酵产品。
80.下面将结合具体的实施例来进一步说明本技术的有益效果。
81.以下实施例的原料为人参、玉竹、莲子、薏苡仁、氮源(包括但不限于硫酸铵、氯化铵、水解大豆蛋白、奶粉、酵母提取物)、碳源(包括但不限于葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、水解淀粉等)及酵母菌(包括但不限于酿酒酵母、毕赤酵母、假丝酵母)乳酸菌(包括但不限于戊糖乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌)，上述各原料除菌种为本技术具有上述保藏信息的菌种外，其余均可以从市场购买得到。
82.实施例1
83.酵母及乳酸菌菌种活化：挑取酿酒酵母菌落一环放入ypd液体培养基中，放入摇床中将菌种活化。挑取嗜酸乳杆菌菌落一环放入mrs液体培养基中，摇床中活化。
84.菌种纯化：将上步活化后的两种菌液梯度稀释铺平板，以获取单个菌落。
85.酵母菌菌种扩大培养：挑取上步平板中单个菌落接种至ypd液体培养基中，28℃摇床培养，当od值＝1.0时，得到发酵菌液，离心收集菌体。
86.乳酸菌菌种扩大培养：挑取嗜酸乳杆菌菌落一环放入mrs液体培养基中，进行纯化扩大培养，37℃厌氧发酵，当od值＝1.0时，得到发酵菌液，离心收集菌体。
87.人参、玉竹、莲子、薏苡仁处理：取干燥原料进行粉碎，处理后过100目筛待用。
88.原料后处理及复配：人参、玉竹、莲子、薏苡仁，其比例为：5：2：3：5进行混合，在100份去离子水中，取上述混合粉按照10份的比例添加，淀粉酶、糖化酶、蛋白酶进行水解处理。水解结束后(得到复合提取物)加入10份葡萄糖，5份硫酸铵，90℃灭菌30min。
89.混合同步发酵：取5份扩大培养后的酵母菌菌体，5份嗜酸乳杆菌菌体，加入至上步冷却后的原材料混合液中，25℃摇床培养96h(摇床转速180rpm/min)。再次添加灭菌后的5份的葡萄糖，3份大豆水解蛋白，调节ph＝6.5，37℃厌氧或耗氧培养发酵48h。
90.澄清处理：发酵结束后离心机高速5000r/min离心10min得到上清液即为发酵产品。
91.灭菌：上述发酵产品60℃灭菌0.5h。
92.实施例2
93.酵母及乳酸菌菌种活化：挑取假丝酵母菌落一环放入ypd液体培养基中，放入摇床中将菌种活化。挑取植物乳杆菌菌落一环放入mrs液体培养基中，摇床中活化。
94.菌种纯化：将上步活化后的两种菌液梯度稀释铺平板，以获取单个菌落。
95.酵母菌菌种扩大培养：挑取上步平板中单个菌落接种至ypd液体培养基中，28℃摇床培养，当od值≥1.0时，得到发酵菌菌液，离心收集菌体。
96.乳酸菌菌种扩大培养：挑取干酪乳杆菌菌落一环放入mrs液体培养基中，进行纯化扩大培养，37℃厌氧发酵，当od值＝1.0时，得到发酵菌菌液，离心收集菌体。
97.人参、玉竹、莲子、薏苡仁处理：取干燥原料进行粉碎，处理后过200目筛待用。
98.原料处理及复配：人参、玉竹、莲子、薏苡仁，其比例为7：3：7：3进行混合，在100份去离子水中，取上述混合粉按照5份的比例添加，淀粉酶、糖化酶、蛋白酶进行水解处理。水解结束后(得到复合提取物)加入2份麦芽糖糖，2份奶粉，90℃灭菌30min。
99.酵母菌乳酸菌分别发酵：将1份酵母菌菌体入至100份上步冷却后的原材料混合液中，25℃摇床培养72h(摇床转速200rpm/min)。同时将1份戊糖乳杆菌菌体入至100份上步冷却后的原材料混合液中，35-37℃厌氧培养发酵96h。两步发酵分别结束后进行等体积混合。
100.澄清处理：发酵结束后离心机高速5000r/min离心10min得到上清液即为发酵产品。
101.灭菌：上述发酵产品130℃灭菌15s。
102.实施例3
103.酵母及乳酸菌菌种活化：挑取毕赤酵母菌落一环放入ypd液体培养基中，放入摇床中将菌种活化。挑取戊糖乳杆菌菌落一环放入mrs液体培养基中，摇床中活化。
104.菌种纯化：将上步活化后的两种菌液梯度稀释铺平板，以获取单个菌落。
105.酵母菌菌种扩大培养：挑取上步平板中单个菌落接种至ypd液体培养基中，28℃摇床培养，当od值≥1.0时，得到发酵菌菌液，离心收集菌体。
106.乳酸菌菌种扩大培养：挑取戊糖乳杆菌菌落一环放入mrs液体培养基中，进行纯化扩大培养，35℃耗氧发酵，当od值＝1.0时，得到发酵菌菌液，离心收集菌体。
107.人参、玉竹、莲子、薏苡仁处理：取干燥原料进行粉碎，处理后过200目筛待用。
108.原料处理及复配：人参、玉竹、莲子、薏苡仁，其比例为：2：5：7：5进行混合，在100份去离子水中，取上述混合粉按照10份的比例添加，淀粉酶、糖化酶、蛋白酶进行水解处理。水解结束后(得到复合提取物)加入1份水解淀粉糖，1份硫酸铵，1份的酵母提取物，120℃灭菌20min。
109.酵母菌、乳酸菌分步发酵：将5份酵母菌菌体加入至100份上步冷却后的原材料混合液中，28℃摇床培养24h(摇床转速200rpm/min)后加热灭活。再次加入灭菌后的7份的蔗糖，3份大豆水解蛋白，后调节ph＝6.5-7.5。再次加入0.1份戊糖乳杆菌菌体，37℃厌氧培养发酵96h。
110.澄清处理：发酵结束后板框过滤机过滤所得上清液即为复合发酵产品。
111.灭菌：上述发酵产品130℃灭菌5s。
112.实施例4至实施例9
113.实施例4-9采用表1和2所示原料，及表3所示条件，按照与实施例1相同的步骤进行操作，得到各实施例的发酵产物。
114.对比例1
115.采用单一发酵菌发酵的方式进行发酵，具体步骤如下：
116.采用实施例7所得的原料，加入10％的毕赤酵母菌种子液(每ml种子液中含有毕赤酵母菌5*107cfu)，搅拌均匀，在温度28℃发酵15天，当发酵体系的ph到达4.0时终止发酵，得到毕赤酵母发酵液。
117.澄清处理：发酵结束后板框过滤机过滤所得上清液即为发酵产物。
118.灭菌：上述发酵产物120℃灭菌15min。
119.对比例2
120.采用实施例7所得的原料，加入10％的干酪乳杆菌种子液(每ml种子液中含有干酪乳杆菌5*108cfu)，搅拌均匀，在温度37℃发酵15天，当发酵体系的ph到达4.3时终止发酵，得到乳酸菌发酵液。
121.澄清处理：发酵结束后板框过滤机过滤所得上清液即为发酵产物。
122.灭菌：上述发酵产物120℃灭菌15min。
123.对比例3
124.采用实施例7所得的原料，加入10％的干酪乳杆菌种子液(每ml种子液中含有干酪乳杆菌5*108cfu)，搅拌均匀，在温度37℃发酵15天，当发酵体系的ph到达4.3时终止发酵，得到乳酸菌发酵液。
125.向乳酸菌发酵液中加入8％的植物乳杆菌(每ml种子液中含有植物乳杆菌4.5*107cfu)，搅拌均匀，在温度37℃发酵60天，得到植物乳杆菌发酵液。
126.澄清处理：发酵结束后板框过滤机过滤所得上清液即为发酵产物。
127.灭菌：上述发酵产物120℃灭菌15min。
128.表1：各实施例和对比例所用原料
129.130.表2：
131.项目人参:玉竹:莲子:薏苡仁质量比原料粒径实施例15：2：3：5100目实施例27：3：7：3200目实施例32：5：7：5200目实施例41:1:1:190目实施例510:1:1:1120目实施例61:10:1:1180目实施例71:1:10:1180目实施例81:1:1:10210目实施例910:0.5:1:10180目对比例11:1:10:1180目对比例21:1:10:1180目对比例31:1:10:1180目
132.附：实施例9中所用到的酿酒酵母和乳酸菌的菌种保加利亚乳酸杆菌均为市售产品，酿酒酵母购自安琪酵母股份有限公司的低糖高活性干酵母，生产批号为2018021201。乳酸菌购自上海紫石生物科技有限公司的保加利亚乳杆菌，生产批号为20171225。
133.表3：
[0134][0135]
测试：
[0136]
(1)负重游泳实验
[0137]
实验小鼠初选后进行游泳练习，选取负重测量基础时间标准差小于10min的小鼠30只，随机分为3组，分别为对照组和实验组，实验组包括各实施例和对比例的复合提取物组(即在发酵之前，原料经水解后的产物)和复合发酵液组(指发酵后的最终所得上清液)。实验组分别给予10g/kg体重浓度的复合提取物和复合发酵物，对照组每日灌胃无菌蒸馏水
10g/kg。小鼠连续30d灌胃给药，30d灌胃2h后进行负重游泳测试，选择小鼠体重5％的铅块绑在尾部近心端1/2处，置于水深50cm，体积约1m3，水温在28
±
2℃的水槽中，小鼠沉底10s，不能浮起标示力竭，测量记录小鼠游泳力竭时间。测试结果见表4。
[0138]
表4：复合发酵组与复合提取组对负重游泳结果的影响(n＝10)
[0139][0140]
小鼠负重游泳试验是考察抗疲劳能力的最直接方法，其游泳时间长短与动物运动疲劳程度呈正相关。从表4可以看出，各实施例的复合提取物组和复合发酵物组游泳力竭时间明显比对照组延长，而且复合发酵组高于复合提取物组，说明复合发酵组具有更显著的抗疲劳并增强体能的作用。
[0141]
(2)紫外照射损伤下复合提取物及复合发酵物对人成纤维细胞增殖效果对比
[0142]
将人真皮成纤维细胞(hsf)分为对照组、模型组和样品组。对照组正常培养液培养，不进行uva辐照；模型组和样品组：在uva照射前将培养液吸去，pbs冲洗一次，再加入少量pbs覆盖照射细胞上层，以uva光源照射，辐照剂量为10j/cm2。将模型组细胞以4
×
10 4
个细胞/孔接种于96孔板，待细胞贴壁后，样品组分别将复合提取物和复合发酵物加入到培养基中，空白组和模型给予等量的培养液作为对照，置于37℃，5％co2培养箱中继续培养24h后小心吸弃培养液，再向各孔加入100μl 5mg/ml四甲基偶氮唑盐(mtt)溶液，继续培养4h后小心吸弃上清液，每孔加入150μl dmso，振摇15min，使沉淀充分溶解，利用酶标仪测定570nm波长处的吸光度，并计算各组的细胞存活率(计算公式如下)，各组的检测结果见表5：
[0143][0144]
表5：复合提取物及复合发酵物对uva辐照后的hsf细胞增殖活力的影响(n＝3，)
[0145][0146]
如上表5所示，与对照组相比，经10j/cm
2 uva辐照造模后的模型组细胞吸光值及存活率均降低，分别降至0.432
±
0.02和57.1％；而与模型组相比，添加复合提取物组及复合发酵物组的细胞增殖活力明显恢复，复合发酵物及复合提取物具有促进人成纤维细胞增殖的效果，且复合发酵物效果要优于复合提取物，相比于实验组，对比组发酵物组也优于提取组，但增加效果不如实验组显著。
[0147]
(3)体外保湿率实验
[0148]
选用恒重后的60mm培养皿，分别在培养皿内侧贴一层3m医用透气胶带，分别吸取实施例2复合提取液、实施例2复合发酵液各500μl点在透气胶带上，称重后放入25℃相对湿度60％的恒温恒湿干燥器内8h，每隔1h称重一次，并与初始重量差计算保湿率：
[0149]
x(％)＝mt/m0
×
100％；
[0150]
注：m0为初始重量，单位为g；mt为取样点重量，单位为g；t为取样时间，h。
[0151]
检测结果见图1。由图1可知，复合提取物与复合发酵物均具有保湿效果，在实验初期3h内差异较小，随时间正常复合发酵物的保湿率要高于复合提取物。
[0152]
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：本技术的原材料为人参、玉竹、莲子及薏苡仁中，人参中发挥各类功效的主要成分是人参皂苷，而玉竹中玉竹多糖和黄酮是其主要物质。莲子中水溶性多糖、总黄酮和超氧化物歧化酶是其主要的三大物质。薏苡仁中包含的主要活性成分包括薏苡仁酯、甘油三酯类、脂肪酸类、内酰胺类、薏苡内酯、糖类、甾醇类、三萜类等化合物。上述原料搭配组合之后可以发挥不同功效成分间的协同增效作用，同时四者都含有丰富的淀粉、蛋白、微量元素等，可以为微生物发酵提供充足的原料物质。
[0153]
通过利用酵母菌及乳酸菌等可食用安全菌种的发酵特性，对包含人参、玉竹、莲子及薏苡仁的原料组合进行发酵，此两类菌在生长过程中所产生功效物质种类多，酶系复杂，能够促进原料中不同功效成分的释放，从而实现中药中的功效物质含量的提升及结构的转化(如人参皂苷从普通皂苷转化为稀有人参皂苷，黄酮类物质结构改变水溶性提升等)，提升发酵产物的整体功效。具有抗疲劳、延缓衰老以及保湿的作用
[0154]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。