一种用于肿瘤成像和靶向协同治疗的谷胱甘肽响应纳米探针及其构建方法与流程

：
1.本发明属于肿瘤细胞协同治疗及光谱成像领域，具体涉及一种用于肿瘤成像和靶向协同治疗的谷胱甘肽响应纳米探针及其构建方法，将化疗药物与光敏剂的共同递送实现了化疗(ct)与光动力治疗(pdt)的协同治疗及双光谱(荧光光谱、表面增强拉曼散射光谱)肿瘤细胞成像分析。


背景技术：

2.谷胱甘肽(gsh)是一种巯基化合物，在细胞中gsh含量的异常变化直接关系到一些疾病的产生，如肿瘤、神经疾病、艾滋病等。gsh已经成为公认的肿瘤细胞标志物，在许多恶性肿瘤中明显高于正常细胞。因此，对gsh的监测及成像研究是癌症早期诊断的迫切需要。gsh在癌细胞内含量为2
‑
10mm，健康细胞为2
‑
10μm，肿瘤微环境内gsh的含量大约是正常组织的100
‑
1000倍，gsh水平的显著差异使得gsh应答的纳米载体成为靶向细胞内药物传递的首选。其中，二硫键作为典型的还原敏感键被广泛应用于肿瘤特异性刺激应答纳米载药探针的设计中。
3.作为一种非侵入性医疗技术，pdt已经成为一种可靠的癌症治疗方式。越来越多的研究旨在利用无害的光敏剂和可见光在pdt中消融恶性肿瘤。pdt还可引起急性炎症和白细胞浸润，从而促进免疫反应。pdt依赖于光敏剂(pss)产生的活性氧(ros)，与常规化疗相比，pdt可提供额外的组织选择性，这是因为预先确定的pss积累和光照放置的原因，治疗区域的大小取决于光照射区域的大小，确保对邻近健康组织的副作用较小。化疗药物有强烈的毒副作用，限制了它的应用。为了克服这些局限性，人们开发了一系列靶向能力好、治疗效率高、毒副作用小的靶向纳米平台，实现了肿瘤的特异性治疗，提高了疗效。适体、短肽和小分子，最近成为有前途的靶向配体设计新型药物传递系统。由于它们能特异性识别肿瘤细胞中过表达的不同细胞表面靶点，因此，靶向给药控释系统的构建对药物靶向供给在癌症治疗中的安全性至关重要。pdt有助于克服化疗药物的多药耐药。因此，一种既能实现光敏剂与化疗药物的有效协同递送，又能降低化疗的脱靶毒性的药物递送系统在癌症治疗中具有很大的潜力。二氢卟吩e6(chlorin e6，ce6)作为传统的光敏剂常用与肿瘤的pdt治疗。
4.目前的光学传感器主要依靠单一的信号依赖性分析，容易受到一些物质的干扰。相比之下，基于双信号的光学传感器，如比率传感器，具有较高的精度。然而，更重要的是，使用不同类型信号的双模式光学传感器更有利于提高灵敏度和精度，具有相当大的应用前景。近年来，基于表面增强拉曼散射(sers)和荧光的双信号光学传感器在检测领域得到了广泛的发展。例如，谭团队最近开发了基于cy3和金纳米粒子的荧光
‑
sers开关纳米探针来监测细胞的动态行为和检测多种mirnas。张与其同事制备了基于sers和荧光信号的细胞色素c激活双模受体传感器，该传感器由dna修饰的au纳米三角形和cy5修饰的互补链自组装而成。因此利用sesr技术与荧光技术构建大量的纳米平台策略，用来实现对肿瘤的诊疗一体化，提高了肿瘤检测的精准度，增强了肿瘤治疗效果。


技术实现要素：

5.基于上述情况，本发明目的在于设计一种基于dna的纳米探针携带化疗药物及光敏剂以肿瘤微环境响应进行药物释放，将光敏剂与化疗药物有效协同递送，实现肿瘤的ct
‑
pdt协同治疗，提高肿瘤治疗效率以及肿瘤细胞的成像分析。
6.为了实现上述目的，本发明涉及的用于肿瘤成像和靶向协同治疗的谷胱甘肽响应纳米探针，包括金纳米粒子、dna y
‑
motif，dna y
‑
motif包括dna s1、dna s2和muc1适体dna s3，dna序列s1分别与dna序列s2和muc1适体dna s3碱基互补配对杂交成y形结构，其中，s1序列为5'
‑
sh
‑
gct acg ata acg acg aaa gga tca act g
‑
3'，s2序列为5'
‑
cca ggg aat cca tcg tcg ssa tcg tag c
‑
3'，s3序列为5'
‑
aca cgg cag ttg atc ctt tgg ata ccc tgg cgt gt
‑
3'，s1序列5'端的巯基连接在金纳米粒子表面构成aunp y
‑
motif，s2序列5'端修饰光敏剂，s2序列3'端修饰双模式成像基团且靠近金纳米粒子表面，通过调整双模式成像基团与金纳米粒子之间的距离，实现荧光
‑
表面增强拉曼散射双模式肿瘤细胞成像。
7.所述用于肿瘤成像和靶向协同治疗的谷胱甘肽响应纳米探针到达细胞表面时，muc1适体与muc1蛋白结合，促进了肿瘤细胞对纳米探针的内吞，进入细胞后，gsh将双硫键切断后，dna
‑
y
‑
motif完全解链释放光敏剂，实现肿瘤微环境响应的精准靶向治疗及光动力治疗。aunps
‑
y
‑
motif探针中的双模式成像基团紧靠aunps会产生强烈的拉曼信号，荧光猝灭，当gsh切断双硫键时双模式成像基团会远离aunps使荧光信号恢复，即肿瘤细胞内gsh与aunp
‑
y
‑
motif探针作用引起y
‑
motif的构象变化至使双模式成像基团产生拉曼信号减弱荧光信号增强的变化，实现了肿瘤细胞的表面增强拉曼散射光谱成像分析。
8.具体地，所述双模式成像基团包括但不限于cy3、cy5和rox中的一种。
9.具体地，所述光敏剂包括但不限于光敏剂二氢卟吩e6(ce6)、亚甲基蓝或hemin。
10.进一步地，所述用于肿瘤成像和靶向协同治疗的谷胱甘肽响应纳米探针，还包括化疗药物，所述化疗药物插入到dna y
‑
motif碱基对中。具体地，化疗药物包括但不限于阿霉素(dox)。此时，探针在携带光敏剂的同时也携带化疗药物，通过共同递送光敏剂和化疗药物来实现内源性物质控制药物释放，实现肿瘤细胞的ct
‑
pdt联合治疗。
11.本发明涉及的用于肿瘤成像和靶向协同治疗的谷胱甘肽响应纳米探针的构建方法，具体包括以下步骤：
12.(1)dna s2序列5'端修饰光敏剂，3'端修饰双模式成像基团，将dna s1、dna s2和muc1适体dna s3退火处理，然后在冰浴中冷却备用；
13.(2)冷却后的dna s1与aunps振动混合，使dna s1通过共价金
‑
硫醇键固定在aunps表面，形成aunps
‑
s1；
14.(3)将aunps
‑
s1重新分散在pbs中，加入步骤(1)处理后的dna s2以及mucin
‑
1适体dna s3，在室温下震荡，充分反应后，mucin
‑
1适体dna s3和dna s2分别与dna s1碱基互补配对杂交成y形结构，得到探针aunp
‑
y
‑
motif；
15.(4)将化疗药物与aunp
‑
y
‑
motif混合，使化疗药物插入到gc碱基对中。
16.相对于现有技术，本发明所述的gsh响应纳米探针用于肿瘤成像和靶向协同治疗具有以下优势：
17.(1)通过适体的靶向作用，利用内源性物质dna构建携带化疗药物及光敏剂的纳米探针，实现了光敏剂与化疗药物的有效协同递送，提高肿瘤的靶向治疗效率，且该纳米探针
制备简单、花费低。
18.(2)使用荧光、拉曼双模式光学信号对肿瘤细胞进行成像，更有利于提高灵敏度和精确度，克服了单信号策略中复杂环境的干扰。
附图说明：
19.图1为本发明的原理示意图。
20.图2为实施例1所述的aunps的透射电镜图(a)和探针的紫外光谱图(b)、动态光散射粒径图(c)、拉曼表征图(d)。
21.图3为实施例1所述的不同浓度的gsh(a
‑
f：0，1，2，3，4，5mm)与aunp
‑
y
‑
motif探针响应释放dox(a)及cy3(b)的荧光光谱图。
22.图4为实施例1中不同照射时间下所述的aunp
‑
y
‑
motif探针的体外1o2产生检测图。
23.图5为实施例1所述的aunp
‑
y
‑
motif探针的细胞内1o2产生检测图，其中dcf表示dcf的荧光图，bright表示白光图，merge表示荧光图与白光图的叠加图。
24.图6为实施例1所述的细胞荧光成像图，其中cy3表示cy3的荧光图，dox表示dox的荧光图，bright表示白光图，merge表示荧光图与白光图的叠加图。
25.图7为实施例1所述的细胞拉曼成像图，其中，从左到右每一列分别为hela细胞的拉曼成像图，hela细胞的拉曼成像与细胞白光像的叠加图，细胞的白光像以及对应细胞内cy3拉曼信号图。
26.图8为实施例1所述的探针对肿瘤细胞活性的检测图。
具体实施方式：
27.下面结合实施例及附图来详细说明本发明。
28.实施例1
29.本实施例中所述双模式成像基团采用cy3，光敏剂采用ce6。
30.1、金纳米颗粒的合成
31.取乙醇2l，再称量氢氧化钾(koh)500g，将koh溶于2l乙醇中，配成碱缸用于后续实验。每10天补加一定量的乙醇与koh。本文以aunps作为载体，其合成方法采用传统的柠檬酸还原法制备(也称一步还原法)，具有还原性的柠檬酸钠可以把氯金酸溶液中的au
3
还原成au的单质，au单质将会进一步的聚合生长，在柠檬酸钠的调控下(控制柠檬酸钠和氯金酸的体积比例)进而聚合成不同粒径的金纳米粒子。在制备过程中所有使用的玻璃器皿、磁子等先在碱缸中浸泡12h，然后清洗干净，在烘箱内烘干，再将烘干后的玻璃器皿用王水溶液中浸泡24h，清洗干净，然后烘干。这样可以有效的避免的外界因素导致的胶体不稳定性，保证了在接下来的aunps的合成不受污染，胶体状态更加稳定。先配制1％的haucl4溶液，再取1％的haucl4溶液1ml，定容至100ml容量瓶来获得0.01％的haucl4溶液，取柠檬酸钠用二次水溶解，获得1％的柠檬酸钠溶液。搭建回流装置，之后倒入0.01％的haucl4溶液，打开搅拌并加热，当溶液达到微沸状态时(有较大气泡产生)快速加入柠檬酸三钠溶液，此时观察溶液颜色，当逐渐变为酒红色时，为使溶液充分反应获得稳定的aunps溶液，持续加热搅拌回流30min，之后关闭加热，继续搅拌，使其自然恢复到室温，最后将冷却好的aunps溶液放冰箱4℃保存。最后，所有实验玻璃器皿都再放回碱缸中浸泡，以备下一次使用，保证其清洁
度。
32.2、aunp
‑
y
‑
motif探针的制备
33.2.1信标的dna序列，具体信息如表1。
34.表1实验使用dna序列
[0035][0036]
s2的构建过程具体为：首先在s2序列5'端修饰ce6，3'端修饰cy3，通过优化碱基互补配对的链熔温度，在近cy3一端插入了gsh响应的双硫键，gsh响应后该dna y
‑
motif可以解链释放药物及cy3。
[0037]
2.2aunp
‑
y
‑
motif探针的制备
[0038]
为成功制备aunp
‑
y
‑
motif探针，首先将硫醇修饰dna s1(1.0μm，50.0μl)在95℃水浴中退火5min，避免碱基错配，然后在冰浴中冷却30min后使用。冷却后的s1与1ml的aunps于混合10ml小烧杯中，在37℃振荡器中轻轻摇动约16h。16h后，在随后的盐老化过程中，将200.0μl 0.05m nacl溶液缓慢均匀的滴加至混合物中，继续摇动6h，6h后再将200.0μl 0.1m nacl溶液缓慢均匀的滴加入混合物中再摇动6h，以增强探针的稳定性。二次加盐6h后，在10 000rpm下离心30min，然后再洗涤2次，去除游离多余的s1序列，至此，s1链通过共价金
‑
硫醇键固定在aunps表面。随后，将洗涤2遍的沉淀重新分散在pbs中(0.1m，ph值7.4)，然后dna s2(1μm，50μl)以及mucin
‑
1适体序列(s3，1μm，50μl)如上所述同样进行退火，将退火冷却后的s2、s3加入重新分散的aunp
‑
s1中，并在室温下震荡6h。6h后可获得探针aunp
‑
y
‑
motif，将该探针与2μl 10mm盐酸阿霉素可dox混合，在室温下震荡过夜，这样盐酸阿霉素可以完全插入到gc碱基对。如前所述，将混合物离心洗涤，然后重悬于pbs中，这样便获得了负载dox及光敏剂ce6的aunp
‑
y
‑
motif，用于后续实验。制备好的探针用拉曼检测cy3信号来验证其制备成功。
[0039]
3、aunp
‑
y
‑
motif探针的表征
[0040]
用uv、tem、dls和拉曼对aunp
‑
y
‑
motif探针进行表征。如图2
‑
a的tem图像显了aunps的尺寸和形貌，aunps的平均直径约为25nm，呈球体状，分散均匀。dls测量进一步表明，当表面修饰dna y
‑
motif结构时，aunps的水合粒径直径增大(图2
‑
b)。uv
‑
vis进一步显示功能化导致aunps的紫外吸收产生轻微红移(图2
‑
c)。aunps经核酸链修饰后在526nm处的特征吸收红移至529nm，这是因为功能化改变了aunps周围环境的介电常数造成的。cy3分子是一种拉曼信号分子，由于cy3分子接近aunps，因此可以检测到强烈的cy3sers信号。sers光谱在1586cm
‑1(cy3的特征峰)处显示出较强的拉曼信号(图2
‑
d)。以上所有这些表征结果都证实了aunp
‑
y
‑
motif探针的成功制备。
[0041]
4、aunp
‑
y
‑
motif探针与gsh响应的荧光分析
[0042]
准确配制不同浓度的gsh溶液(0，1，2，3，4，5mm)，使其与aunp
‑
y
‑
motif探针反应6h。反应结束后，将不同浓度的gsh与aunp
‑
y
‑
motif探针混合溶液离心(10000rpm，30min)，测定上清液中cy3和dox的荧光强度。
[0043]
然后，我们对不同浓度的gsh与aunp
‑
y
‑
motif反应的药物释放行为进行了探究，如图3
‑
a、b所示，在上清液中可以成功的检测到dox和cy3的荧光信号，gsh浓度在0
–
5mm的范围内，dox和cy3的荧光强度随着gsh浓度的增加有显著的上升，由此可以得出gsh浓度越高，dox的释放量越大。
[0044]
5、hela的细胞培养
[0045]
hela细胞使用dmem培养液(10％的牛血清白蛋白、1％的青霉素链霉素)培养的，在37℃下含有5％的二氧化碳的100％的湿润气体中的培养箱中进行培养。
[0046]
6、aunp
‑
y
‑
motif探针的体外1o2产生检测
[0047]
用1，3
‑
二苯异苯呋喃(dpbf)测定了体内aunp
‑
y
‑
motif的1o2生成能力，将50μlaunp
‑
y
‑
motif加入50μg/ml dpbf溶液中。混合物经650nm灯照射不同时间。照射后，在403nm激发波长下记录485nm处的荧光强度。以不含aunp
‑
y
‑
motif的dpbf溶液为对照。
[0048]
如图4
‑
a、b所示，dpbf、dpbf 光照、dpbf aunp
‑
y
‑
motif，都未能引起dpbf的荧光减弱，而aunp
‑
y
‑
motif与dpbf在650nm的激光照射下，随着激光照射时间从0到20min的延长，dpbf的荧光强度迅速下降，说明在光照下有ros生成至使dpbf被氧化，其荧光强度随之减弱。结果表明，aunp
‑
y
‑
motif纳米探针在体外溶液中具有良好的生成1o2的能力。
[0049]
dcfh
‑
da是一种细胞内ros
‑
sensitive探针，可以特异性被细胞内产生的1o2氧化，转变为具有强荧光信号的2,7
‑
二氯荧光素(dcf)。采用2'，7'
‑
二氯二氢荧光素二乙酸酯(dcfh
‑
da)检测细胞内1o2生成能力。将aunp
‑
y
‑
motif与hela细胞孵育。培养4h后，清洗细胞2次，再取10μm dcfh
‑
da与hela细胞共孵育30min，清洗细胞2次。然后，在650nm波长下，照射培养皿细胞20min。未加入aunp
‑
y
‑
motif、未光照的培养皿细胞作为对照组。20min后在共聚焦激光扫描显微镜上，激发波长为488nm，发射波长采集范围为510～540nm。
[0050]
如图5所示，只有dcfh
‑
da的hela细胞(5a)中未见dcf的荧光，有dcfh
‑
da且激光照射的hela细胞(5b)中dcf荧光可以忽略，不使用激光照射的dcfh
‑
da和aunp
‑
y
‑
motif处理的hela细胞(5c)可以观察到轻微的dcf荧光。相比之下，用dcfh
‑
da与aunp
‑
y
‑
motif孵育的hela细胞经激光照射(5d)后显示出强烈的绿色荧光，证实在癌细胞中有效生成1o2。
[0051]
7、hela细胞的荧光成像
[0052]
将hela细胞分入皿中培养24h，然后将20μl aunp
‑
y
‑
motif溶液与1ml培养液混合再加入到共聚焦培养皿中培养。37℃孵育不同时间后，用pbs洗涤3次，以减少背景荧光。然后进行共聚焦成像，激发光为514nm，从带通滤波器560～590nm处采集cy3的荧光发射，用激发波长488nm，采集波长范围为590～650nm处采集dox的荧光发射。
[0053]
研究了肿瘤细胞中aunp
‑
y
‑
motif靶向药物释放的能力，对hela细胞进行了荧光共聚焦成像分析。如图6所示，aunp
‑
y
‑
motif与细胞孵1h后，在gsh的作用下，在细胞质中成功检测了cy3和微弱的dox的荧光信号。证实dox可成功的从aunp
‑
y
‑
motif中被释放出来，随着培养时间的延长，进入肿瘤细胞的aunp
‑
y
‑
motif探针含量逐渐升高，cy3和dox的荧光强度也逐渐增强。在孵育了6h后，可以观察到在细胞核内出现明显的红色荧光，这表明dox在细胞核中积累，从而与染色体结合杀死癌细胞。这表明了，dox被成功封装在aunp
‑
y
‑
motif探
针中，并实现了肿瘤细胞内gsh控制的药物释放。总之，gsh刺激响应纳米平台的开发实现了在肿瘤细胞内激活成像和药物控制释放。
[0054]
8、hela细胞的拉曼成像
[0055]
将hela细胞接种于sers基底金片上，在培养箱内培养24h，然后用pbs清洗一遍，将aunp
‑
y
‑
motif探针与hela细胞孵育不同时间(1h、2h、3h)。随后，利用pbs去除游离的aunp
‑
y
‑
motif，在雷尼绍invia拉曼显微镜上进行成像，50
×
物镜，10％的激光强度，用633nm的hene激光器，曝光时间为5s，拉曼信号的检测范围从1700cm
‑1到600cm
‑1范围收集。
[0056]
图7中可以看到，在1h时可以在hela细胞中观察到强烈的cy3的sers信号，随着时间的推移cy3的拉曼信号逐渐削弱。结果表明，由于muc1的靶向作用，aunp
‑
y
‑
motif探针经内吞作用进入细胞，在最初拉曼信号最强，随着时间增加，大量探针与gsh作用，至使cy3标记的寡核苷酸从aunp
‑
y
‑
motif上释放，拉曼信号逐渐降低。
[0057]
9、aunp
‑
y
‑
motif探针的治疗研究
[0058]
用cck
‑
8法测定aunp
‑
y
‑
motif探针对hela细胞和hek293t细胞的细胞活性。将2种细胞接种在96孔板中，并生长24h。然后用不同浓度的aunp
‑
y
‑
motif(0.1
‑
0.9nm)孵育16h后，用pbs洗涤细胞，在650nm波长下，照射20min。未经激光照射的细胞作为对照。之后，每一个小孔加10μl cck
‑
8溶液，孵育3.5h，用酶标仪测定每孔在450nm处的光密度(od)。为了进一步研究不同的治疗方法的效果，将hela细胞与游离的dox、游离的ce6、仅装载dox的aunp
‑
y
‑
motif(aunp
‑
y
‑
motif/dox)、仅装载ce6的aunp
‑
y
‑
motif(aunp
‑
y
‑
motif/ce6)和aunp
‑
y
‑
motif(装载两种药物)孵育，然后通过上述处理对细胞进行测量。细胞存活率按细胞毒性检测试剂盒描述计算。
[0059]
用cck
‑
8细胞活性实验探究了aunp
‑
y
‑
motif的ct
‑
pdt对肿瘤细胞的协同治疗作用。首先，探索了特定的细胞靶向肿瘤治疗能力，选择过表达muc1受体的hela细胞作为靶模型，以hek293t细胞为对照组，评估aunp
‑
y
‑
motif副作用及治疗作用。如图8
‑
a、b所示，aunp
‑
y
‑
motif(不含药物)对hela细胞和hek293t细胞的毒性可以忽略，表明aunp
‑
y
‑
motif具有良好的生物相容性和无毒性。然而，随着aunp
‑
y
‑
motif(负载药物)浓度的增加和激光照射20min，hela细胞的活力显著下降。在相同条件下，与对照组相比，非靶标hek293t细胞的存活率较高，说明aunp
‑
y
‑
motif对hela细胞有一定的毒性作用，并实现了药物的特异性释放。同时，这也解释了非靶向hek293t细胞对aunp
‑
y
‑
motif的摄取效率较低，而aunp
‑
y
‑
motif对靶向的hela细胞具有良好的选择性，这归因于hek293t细胞muc1受体的低表达。
[0060]
在hela细胞内进一步测试不同药物治疗的细胞毒性，如图8
‑
c相对细胞活性显示，aunp
‑
y
‑
motif装载dox与ce6组(8c
‑
e)的化疗
‑
pdt协同治疗作用对肿瘤细胞生长的抑制作用明显高于对照组(control)、游离的ce6组(8c
‑
a)、游离dox组(8c
‑
b)、aunp
‑
y
‑
motif只装载dox组(8c
‑
c)、aunp
‑
y
‑
motif只装载ce6组(8c
‑
d)。该结果表明具有靶向性的纳米载体的两种治疗作用要远优于非靶向的无载体的单一药物治疗策略。