一种3-甾酮-Δ1-脱氢酶及其编码基因和应用的制作方法

一种3
‑
甾酮
‑
δ1‑
脱氢酶及其编码基因和应用
技术领域
1.本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体涉及一种3
‑
甾酮
‑
δ1‑
脱氢酶及其应用。


背景技术：

2.甾体药物具有很强的抗感染、抗过敏、抗病毒和抗休克等药理作用，甾体药物已经成为仅次于抗生素的第二大类药物。甾体激素类药物分类：肾上腺皮质激素，包括氢化可的松，强的松等，可治疗阿狄森氏症，抗炎，抗过敏，抗休克等；蛋白同化激素，其主要生理功能是抑制蛋白异化和促进蛋白合成，主要用于治疗蛋白质增加和合成不足引起的疾病；性激素，包括雌性激素、雄性激素和孕激素。
3.甾体药物母核a环c1,2位引入双键后，能成倍增加抗炎活性，目前，许多临床上常用重要甾体化合物的生产，特别是大多数具有抗炎能力的肾上腺皮质激素的生产均涉及c1,2位脱氢反应，包括泼尼松龙（prednisolone）、地塞米松（dexamethasone）、帕拉米松（paramethasone）、倍他米松（betamethasone）、氟可龙（fluocortolone）、氟轻松（fluocinolone）、曲安西龙（triamcinolone）、甲基强的松龙（medrol）等。甾体化合物的1,2位脱氢的方法一般包括化学法和微生物发酵法。化学法脱氢一般需要使用seo2，收率比较低，而且seo2对环境污染很大，目前已逐渐被生物法取代。微生物发酵法脱氢，现在应用较多的菌种是节杆菌（cn101760495，cn200710060202），虽然避免了化学法的上述缺陷，但存在着底物浓度低、转化时间长、转化率和收率都比较低、分离纯化比较困难等缺点。
[0004]3‑
甾酮
‑
δ1‑
脱氢酶（3
‑
ketosteroid
‑
δ1‑
dehydrogenase，ksdd），是一种黄素蛋白依赖型的脱氢酶，在催化反应过程中以黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)为辅因子，可以催化3
‑
甾酮类固醇母核a环1,2位的碳碳单键(c
‑
c)脱氢变成碳碳双键(c＝c)，一步完成反应，具有广阔的应用前景，如下图所示。
[0005]3‑
甾酮
‑
δ1‑
脱氢酶在微生物中广泛存在，不断有人从不同的微生物细胞内制备并获得了3
‑
甾酮
‑
δ1‑
脱氢酶，1990年，itagaki等研究人员从nocardia corallina中纯化得到ksdd，并测定了该酶对多种底物的活力，发现c19类化合物雄甾
‑4‑
烯
‑
3,17
‑
二酮（4
‑
ad）c11位置被羰基取代后，酶活降低，c11位置被羟基取代后基本没有活性；对于c21类化合物17α,21
‑
双羟基孕甾
‑4‑
烯
‑
3,20
‑
二酮（cortexolone），c11位置被羰基取代后，酶活有一定升高，而c11位置被羟基取代后基本没有活性【itagaki e, hatta t, wakabayashi t & suzuki k. spectral properties of 3
‑
ketosteroid
‑
δ1‑
dehydrogenase from nocardia corallina. biochim biophys acta, 1990, 1040:281
‑
286】。随后，1995年，choi等将arthrobacter simplex中的kstd基因构建了穿梭质粒在streptomyces lividans
中进行异源表达，并对酶学性质和底物谱进行了研究，实验结果表明甾体母核c11位置被羟基取代后，酶的催化活力大大降低【choi kp, moln
á
r t, yamashita m & murooka y. purification and characterization of the 3
‑
ketosteroid
‑
δ1‑
dehydrogenase of arthrobacter simplex produced in streptomyces liuidans. j biochem, 1995, 117:1043
‑
1049】。2007年，路福平课题组将arthrobacter simplex中的kstd基因通过载体pwb980在枯草芽孢杆菌中实现表达，以4
‑
ad为底物，测得胞内外酶活分别是0.11 u/mg和0.015 u/mg。采用枯草芽孢杆菌重组细胞转化1 g/l底物4
‑
ad，转化40 h达到的最大转化率仅为45.5%【li y, lu f, sun t & du l. expression of ksdd gene encoding 3
‑
ketosteroid
‑∆1‑
dehydrogenase from arthrobacter simplex in bacillus subtilis. letters in applied microbiology, 2007, 44:563
‑
568】。2013年，饶志明课题组将mycobacterium neoaurum中ksdd基因在枯草芽孢杆菌中表达，以4
‑
ad为底物，测得胞内外酶活分别是1.75 u/mg和0.08 u/mg。采用枯草芽孢杆菌重组细胞转化1 g/l底物4
‑
ad，转化10 h达到的最大转化率仅为65.7%【zhang wq, shao ml, rao zm, xu mj, zhang x, yang tw, li h & xu zh. bioconversion of 4
‑
androstene
‑
3,17
‑
dione to androst
‑
1,4
‑
diene
‑
3,17
‑
dione by recombinant bacillus subtilis expressing ksdd gene encoding 3
‑
ketosteroid
‑∆1‑
dehydrogenase from mycobacterium neoaurum jc
‑
12. j steroid biochem mol biol, 2013, 135:36
‑
42】。
[0006]
综上所述，目前3
‑
甾酮
‑
δ1‑
脱氢酶对甾体药物中间体的活性较低，特别是对甾体母核上c11位有关键基团取代的中间体，甚至没有活性，导致其应用于甾体c1,2位脱氢药物中间体的合成时仍然面临底物投料浓度小、转化率低等问题。
[0007]
因此，充分挖掘ksdd酶基因资源，筛选出一种对大多数甾体底物具有高活性的3
‑
甾酮
‑
δ1‑
脱氢酶，并应用于甾体c1,2位脱氢药物中间体的合成，是甾体酶工艺工业化的关键需求。


技术实现要素：

[0008]
为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种新的3
‑
甾酮
‑
δ1‑
脱氢酶及其编码基因和应用，以解决目前3
‑
甾酮
‑
δ1‑
脱氢酶对甾体药物中间体的活性较低，应用时底物投料浓度小，转化率低等问题。
[0009]
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明的第一方面，提供一种3
‑
甾酮
‑
δ1‑
脱氢酶，所述3
‑
甾酮
‑
δ1‑
脱氢酶为如下(1)或(2)的蛋白质；(1)氨基酸序列如seq id no：1所示的蛋白质；(2)与(1)中蛋白质具有至少80％、至少90%、至少95%、至少99%同源性、且具有(1)中蛋白质功能的蛋白质。
[0010]
最优选地，所述3
‑
甾酮
‑
δ1‑
脱氢酶的氨基酸序列如seq id no：1所示。
[0011]
本发明的第二方面，提供一种多核苷酸，所述的多核苷酸编码前述3
‑
甾酮
‑
δ1‑
脱氢酶。优选地，所述编码前述3
‑
甾酮
‑
δ1‑
脱氢酶的多核苷酸的核苷酸序列如seq id no：2所示。
[0012]
本发明的第三方面，提供一种基因工程表达载体，包含前述的多核苷酸。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建所述重组表达载体。这些方法包括重组dna技术、dna合成技术等。可将编码所述3
‑
甾酮
‑
δ1‑
脱氢酶的dna有效连接到载体中的多克隆位点上，以指
导mrna合成进而表达3
‑
甾酮
‑
δ1‑
脱氢酶，或者用于同源重组。本发明的较佳案例中，所述表达载体采用pet
‑
21a。
[0013]
本发明的第四方面，提供一种基因工程表达菌株，所述菌株含有前述重组表达载体或基因组中整合有外源的如前述的多核苷酸。
[0014]
本发明的较佳实施方式中，所述基因工程表达菌株采用大肠杆菌。所述的大肠杆菌优选为bl21(de3)。
[0015]
本发明还提供前述3
‑
甾酮
‑
δ1‑
脱氢酶或3
‑
甾酮
‑
δ1‑
脱氢酶基因工程表达菌株在3
‑
酮基甾体化合物的δ1‑
脱氢反应中的应用。
[0016]
所述应用是以3
‑
酮基甾体化合物为底物，加入电子受体，优选地电子受体是吩嗪硫酸甲酯或1,4
‑
萘醌，进行转化反应得到c1,2位脱氢甾体化合物；所述的3
‑
酮基甾体化合物为以下化合物中的一种：雄甾
‑4‑
烯
‑
3,17
‑
二酮；雄甾
‑4‑
烯
‑
3,11,17
‑
三酮；雄甾
‑
4,9(11)
‑
二烯
‑
3,17
‑
二酮；17β
‑
羟基雄甾
‑4‑
烯
‑
3,17
‑
二酮；孕甾
‑4‑
烯
‑
3,20
‑
二酮；4
‑
孕烯
‑
3,11,20
‑
三酮；17α
‑
羟基孕甾
‑4‑
烯
‑
3,20
‑
二酮；17α,21
‑
双羟基孕甾
‑4‑
烯
‑
3,20
‑
二酮；17α,21
‑
双羟基孕甾
‑4‑
烯
‑
3,11,20
‑
三酮；11β,17α,21
‑
三羟基孕甾
‑4‑
烯
‑
3,20
‑
二酮；11β,17α,21
‑
三羟基孕甾
‑4‑
烯
‑
3,20
‑
二酮
‑
21
‑
醋酸酯；21
‑
羟基
‑
孕甾
‑
4,9(11),16
‑
三烯
‑
3,20
‑
二酮
‑
21
‑
醋酸酯。
[0017]
本发明还提供了一种制备c1,2位脱氢甾体化合物的方法，包括步骤：将本发明的第一方面的3
‑
甾酮
‑
δ1‑
脱氢酶或第四方面所述的基因工程表达菌株，作用于3
‑
酮基甾体化合物，同时加入电子受体，在25
‑
35℃，优选为30℃进行转化，转化时间6
‑
24 h后得到c1,2位脱氢甾体化合物。
[0018]
本发明的较佳实施方式中，所述的3
‑
酮基甾体化合物为以下几种化合物中的一种：雄甾
‑4‑
烯
‑
3,17
‑
二酮；雄甾
‑4‑
烯
‑
3,11,17
‑
三酮；雄甾
‑
4,9(11)
‑
二烯
‑
3,17
‑
二酮；17β
‑
羟基雄甾
‑4‑
烯
‑
3,17
‑
二酮；孕甾
‑4‑
烯
‑
3,20
‑
二酮；4
‑
孕烯
‑
3,11,20
‑
三酮；17α
‑
羟基孕甾
‑4‑
烯
‑
3,20
‑
二酮；17α,21
‑
双羟基孕甾
‑4‑
烯
‑
3,20
‑
二酮；17α,21
‑
双羟基孕甾
‑4‑
烯
‑
3,11,20
‑
三酮；11β,17α,21
‑
三羟基孕甾
‑4‑
烯
‑
3,20
‑
二酮；11β,17α,21
‑
三羟基孕甾
‑4‑
烯
‑
3,20
‑
二酮
‑
21
‑
醋酸酯；21
‑
羟基
‑
孕甾
‑
4,9(11),16
‑
三烯
‑
3,20
‑
二酮
‑
21
‑
醋酸酯。
[0019]
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明人通过基因挖掘，筛选出一种底物谱广，对大多数甾体底物具有高活性的3
‑
甾酮
‑
δ1‑
脱氢酶，与目前文献报道的其它3
‑
甾酮
‑
δ1‑
脱氢酶相似度低于60%，具有明显的差异性，是一种新的3
‑
甾酮
‑
δ1‑
脱氢酶，为进一步研究该酶家族进化关系提供条件，也为利用基因工程技术构建具有高效3
‑
甾酮
‑
δ1‑
脱氢酶基因工程菌提供了更多的基因资源。尤其是，本发明通过基因工程手段，将所述3
‑
甾酮
‑
δ1‑
脱氢酶基因在大肠杆菌中进行了异源过量表达，获得了高效表达3
‑
甾酮
‑
δ1‑
脱氢酶的基因工程菌。建立的该基因工程菌对系列3
‑
酮基甾体化合物的生物转化工艺，以高底物投料浓度，获得高收率的目标产物，无副产物，转化率不低于94％，而且转化时间短，所用生物催化剂用量少，制备方法简单方便、条件温和、环境友好，具有很好的产业化前景。
附图说明
[0020]
图1所示的是实施例4.1中基因工程菌菌株bl21
‑
sat转化雄甾
‑4‑
烯
‑
3,17
‑
二酮的hplc图。其中，a为产物雄甾
‑
1,4
‑
烯
‑
3,17
‑
二酮的标准品，b为基因工程菌株bl21
‑
sat转化
雄甾
‑4‑
烯
‑
3,17
‑
二酮的转化样品。
[0021]
图2所示的是实施例4.2中基因工程菌菌株bl21
‑
sat转化雄甾
‑
4,9(11)
‑
二烯
‑
3,17
‑
二酮的转化样品的hplc图。
[0022]
图3所示的是实施例4.3中基因工程菌菌株bl21
‑
sat转化孕甾
‑4‑
烯
‑
3,20
‑
二酮的转化样品的hplc图。
[0023]
图4所示的是实施例4.4中基因工程菌菌株bl21
‑
sat转化17α
‑
羟基孕甾
‑4‑
烯
‑
3,20
‑
二酮的转化样品的hplc图。
[0024]
图5所示的是实施例4.5中基因工程菌株bl21
‑
sat转化氢化可的松的hplc图。其中，a为产物泼尼松龙的标准品，b为基因工程菌株bl21
‑
sat转化氢化可的松的转化样品。
[0025]
图6所示的是实施例4.6中基因工程菌株bl21
‑
sat转化21
‑
羟基
‑
孕甾
‑
4,9(11),16
‑
三烯
‑
3,20
‑
二酮
‑
21
‑
醋酸酯的hplc图。其中，a为底物21
‑
羟基
‑
孕甾
‑
4,9(11),16
‑
三烯
‑
3,20
‑
二酮
‑
21
‑
醋酸酯的标准品，b为基因工程菌株bl21
‑
sat转化21
‑
羟基
‑
孕甾
‑
4,9(11),16
‑
三烯
‑
3,20
‑
二酮
‑
21
‑
醋酸酯的转化样品。
[0026]
图7所示的是sat蛋白纯化后sds
‑
page图。其中，m
‑
标准蛋白；1
‑
诱导表达后破菌上清；2
‑
镍柱纯化后所得。
具体实施方式
[0027]
下面通过具体实施方式进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。
[0028]
实施例1：3
‑
甾酮
‑
δ1‑
脱氢酶（sat）基因的合成和基因工程菌的构建1. 3
‑
甾酮
‑
δ1‑
脱氢酶基因的合成通过基因挖矿技术，从ncbi数据库中搜寻可能的3
‑
甾酮
‑
δ1‑
脱氢酶，蛋白序列之间的一致性在30%
‑
80%之间，通过序列分析，n端均具有非常保守的fad结合区域（gsgx5‑6ax2ax3glx5e），且存在有保守的氨基酸残基，挖掘到来源于saccharopolyspora kobensis的可能的3
‑
甾酮
‑
δ1‑
脱氢酶序列，其核苷酸序列如seq id no：2所示，编码氨基酸序列如seq id no：1所示。由通用生物系统(安徽)有限公司合成所述核苷酸序列，连接在pet21a载体上得到3
‑
甾酮
‑
δ1‑
脱氢酶的重组质粒。
[0029]
2. 重组质粒的转化氯化钙法制备感受态大肠杆菌细胞。
[0030]
(1) 取10μl上述重组质粒于50μl大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中，冰浴30 min。
[0031]
(2) 42℃水浴热激45 s，快速置于冰上1～2 min。
[0032]
(3) 加入新鲜lb液体培养基600 μl，于37℃振荡培养45～60 min。
[0033]
(4) 取200 μl菌液涂布于含有氨苄青霉素的lb固体培养基表面，37℃培养12～16 h至单菌落出现。
[0034]
实施例2：3
‑
甾酮
‑
δ1‑
脱氢酶（sat）的诱导表达及纯化配置种子液50 ml，培养基为lb液体培养基(蛋白胨10 g/l，酵母粉5g/l，nacl 10g/l)，用接种环挑取基因工程菌株bl21
‑
sat的单菌落接入培养基中，37℃，200 rpm培养过夜。将过夜培养的种子液以1％的接种量转接到发酵培养基(lb培养基)，37℃，200rpm培养至a600 0.6
‑
1.0左右，加入0.05 mm的iptg，并置于25℃，200 rpm诱导10～12h。4℃，
6000rpm条件下离心收集菌体，用tris
‑
hcl缓冲液(50mm，ph 8.0)清洗两遍，并用高压匀浆机破碎，13000rpm离心留取上清液，然后采用金属亲和层析(镍柱)法纯化回收目的蛋白，目的蛋白经透析除去咪唑后即得纯酶液。sds
‑
page电泳图谱显示纯化所得蛋白条带单一，达到了电泳纯(见图7)。
[0035]
实施例3：3
‑
甾酮
‑
δ1‑
脱氢酶（sat）的底物谱酶活测定体系：总反应体积0.2 ml，50 mm tris
‑
hcl ph 8.0，1.5 mm吩嗪硫酸甲酯(pms)，0.12 mm 2,6
‑
二氯酚靛酚(dcpip)，0.5 mm的不同底物（通过筛选实验室的甾体底物库得到），加入适量纯酶液sat (8
‑
48 ng)后，所述纯酶sat通过实施例2所述方法纯化所得，于30℃开始检测，测定600nm处吸光度的变化。1u的酶活性被定义为1 min内还原1μmol dcpip所需要的酶量。结果如表1所示。
[0036]
实施例4：基因工程菌株bl21
‑
sat对3
‑
酮基甾体化合物的转化种子培养：用接种环挑取基因工程菌株bl21
‑
sat单菌落接入含氨苄青霉素的lb培养基中，37℃，200 rpm培养过夜。
[0037]
发酵诱导培养：将过夜培养的种子液以1%的接种量转接到发酵培养基中，37℃，200 rpm培养至od
600nm 0.6
‑
1.0左右，加入0.1 mm的iptg，并置于25℃，200 rpm诱导10~12 h，得到发酵液，发酵液od
600nm
约为10.0。
[0038]
（4.1）：以雄甾
‑4‑
烯
‑
3,17
‑
二酮为底物将雄甾
‑4‑
烯
‑
3,17
‑
二酮粉末投入100 ml上述发酵液中，投料浓度为100 g/l，再加入吩嗪硫酸甲酯10 g/l，30℃搅拌反应。反应24 h，反应完成后，乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂，hplc检测反应的转化率达到99.0%。
[0039]
（4.2）：以雄甾
‑
4,9(11)
‑
二烯
‑
3,17
‑
二酮为底物将溶于dmf（10 ml）的雄甾
‑
4,9(11)
‑
二烯
‑
3,17
‑
二酮投入100 ml上述发酵液中，投料浓度为50 g/l ，再加入吩嗪硫酸甲酯5 g/l，30℃搅拌反应。反应24 h，反应完成后，乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂，hplc检测反应的转化率达到95.5%。
[0040]
（4.3）：以孕甾
‑4‑
烯
‑
3,20
‑
二酮为底物将溶于乙二醇（30 ml）的孕甾
‑4‑
烯
‑
3,20
‑
二酮粉末投入100 ml上述发酵液中，投料浓度为50 g/l ，再加入1,4
‑
萘醌2.5 g/l ，30℃搅拌反应。反应24 h，反应完成后，乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂，hplc检测反应的转化率达到94.4%。
[0041]
（4.4）：以17α
‑
羟基孕甾
‑4‑
烯
‑
3,20
‑
二酮为底物将溶于异辛醇（40 ml）的17α
‑
羟基孕甾
‑4‑
烯
‑
3,20
‑
二酮投入100 ml上述发酵液中，投料浓度为50 g/l，再加入吩嗪硫酸甲酯5 g/l，30℃搅拌反应。反应24 h，反应完成后，乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂，hplc检测反应的转化率达到94.8%。
[0042]
（4.5）：以11β,17α,21
‑
三羟基孕甾
‑4‑
烯
‑
3,20
‑
二酮（氢化可的松）为底物将11β,17α,21
‑
三羟基孕甾
‑4‑
烯
‑
3,20
‑
二酮粉末投入100 ml上述发酵液中，投料浓度为60 g/l，再加入吩嗪硫酸甲酯2.5 g/l，30℃搅拌反应。反应6
‑
8 h，反应完成后，乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂，hplc检测反应的转化率达到96.5%。
[0043]
（4.6）：以21
‑
羟基
‑
孕甾
‑
4,9(11),16
‑
三烯
‑
3,20
‑
二酮
‑
21
‑
醋酸酯为底物将溶于乙酸丁酯（40 ml）21
‑
羟基
‑
孕甾
‑
4,9(11),16
‑
三烯
‑
3,20
‑
二酮
‑
21
‑
醋酸酯投入100 ml上述发酵液中，投料浓度为50 g/l，再加入吩嗪硫酸甲酯2 g/l，30℃搅拌反应。反应24 h，反应完成后，乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂，hplc检测反应的转化率达到99.0%。