用于免疫疗法的经修饰的自然杀伤(nk)细胞
相关申请
1.本技术要求于2019年2月15日提交的美国临时申请号62/806,457；于2019年4月30日提交的美国临时申请号62/841,066；于2019年5月1日提交的美国临时申请号62/841,684；以及于2019年12月4日提交的美国临时申请号62/943,649的优先权，其每一项的全部内容明确地通过引用并入本文。
背景技术：
2.nk细胞可用于免疫治疗方法，例如，在免疫肿瘤学的背景下。nk细胞是一种类型的细胞毒性先天淋巴细胞。nk细胞在肿瘤免疫中发挥着重要作用，并且nk细胞的细胞毒性活性由激活和抑制路径网络紧密调节(参见，例如，gras navarro a,bjorklund at和chekenya m(2015)front.immunol.[免疫学前沿]6:202；通过引用以其整体并入本文)。
[0003]
已经报道了天然存在的或经修饰nk细胞在免疫治疗方法中的用途，例如通过自体或同种异体nk细胞转移，并且虽然已经取得了一些成功，但这种方法典型地是通过次优nk细胞应答表征的。在免疫肿瘤学的背景下，据信，该次优应答至少部分针对利用nk细胞抑制路径的肿瘤，以抑制细胞毒性nk细胞活性、限制nk细胞侵袭和/或抑制nk细胞增殖和存活率。因此，在实体瘤的疗法中应用nk细胞已见有限的成功。
[0004]
已经在尝试于特定细胞上聚焦nk细胞应答方面进行了前期工作，例如，通过表达nk细胞中使nk细胞靶向肿瘤细胞的嵌合抗原受体，或通过调节激活或抑制nk细胞路径，以实现更强的和/或更持续的nk细胞应答。参见，例如，jing y,等人(2015)plos one[公共科学图书馆
·
综合]10(3):e0121788；以及oberschmidt 0,kloess s和koehl u(2017)front.immunol.[免疫学前沿]8:654；通过引用以其整体并入本文。
[0005]
为了寻求可以与治疗抗体组合使用的现成同种异体nk细胞疗法，已经开发了诱导性多能干细胞系，其中细胞表达cd16(hncd16)的增强版，并且已从该ipsc系衍生nk细胞。参见，例如，li等人,cell stem cell[细胞
·
干细胞].2018年8月2日；23(2):181
‑
192.e5；通过引用以其整体并入本文。
[0006]
但是，迄今为止，所有这些方法都仅见有限的成功。因此，仍然需要开发更好的用于免疫疗法的治疗方法。
技术实现要素：
[0007]
本披露的一些方面提供了在免疫治疗方法例如免疫肿瘤学治疗方法的背景下可用的组合物、细胞、细胞群、方法、策略和治疗方式。在一些实施例中，本披露提供了可用于nk细胞疗法的经修饰的nk细胞(或其他淋巴细胞)，例如，在免疫治疗方法的背景下。在一些实施例中，本文提供的细胞和细胞群的特征在于一种或多种修饰，该一种或多种修饰增强其在免疫治疗方法中的功效。例如，在一些实施例中，提供了nk细胞，这些nk细胞包含如下的一种或多种修饰，其在治疗背景下实现与抑制nk细胞功能相关的基因或蛋白质的功能丧失；和/或如下的一种或多种修饰，其在治疗背景下实现与增强的nk细胞功能相关的外源核
酸或蛋白质的表达。在一些实施例中，本披露提供了衍生自诱导性多潜能细胞(ipsc)的经修饰的nk细胞。ipsc衍生的nk细胞在本文中也称为ink细胞。在一些实施例中，提供了经修饰的ink细胞，其衍生自体细胞，例如但不限于成纤维细胞、外周血细胞或发育成熟的t细胞(经历过胸腺选择的t细胞)。在一些实施例中，本文提供的nk或ink细胞包含一种或多种基因组编辑，例如因用rna指导的核酸酶切割基因组座位导致的外源核酸构建体的插缺(indel)或插入。在产生经修饰的nk和ink细胞的背景下使用rna指导的核酸酶技术允许在具有临床应用相关的增强特性的情况下复杂改变的工程化。
[0008]
本披露的一些方面提供了复杂的编辑策略，以及得到的具有复杂的基因组改变的nk细胞，这些复杂的基因组改变允许产生用于临床应用(例如，用于免疫肿瘤学治疗方法)的先进的nk细胞产品。在一些实施例中，本文提供的经修饰的nk细胞可以用作用于患有或已被诊断出过度增殖性疾病(例如癌症)的患者的现成临床解决方案。在一些实施例中，与未修饰的nk细胞相比，经修饰的nk细胞表现出增强的存活率、增殖、nk细胞应答水平、nk细胞应答持续时间、对nk细胞耗尽的抵抗和/或靶标识别。例如，本文提供的经修饰的nk细胞可以包含导致经修饰的nk细胞中的以下情况的基因组编辑：目的嵌合抗原受体(car)的表达，例如，靶向间皮素、egfr、her2和/或mica/b的car；cd16变体的表达，例如，非天然存在的cd16变体，例如像hncd16(参见，例如zhu等人,blood[血液]2017,130:4452，其内容通过引用以其整体并入本文)；il15/il15ra融合体的表达；tgfβ受体2(tgfβr2)的功能丧失；和/或显性负性tgfβr2变体的表达；adora2a的功能丧失；b2m的功能丧失；hla
‑
g的表达；ciita的功能丧失；pd1的功能丧失；tigit的功能丧失；和/或cish的功能丧失；或其两种或更多种的任何组合。在一个实施例中，经修饰的nk细胞包含导致tgfβr2的功能丧失和cish的功能丧失的基因组编辑。在一个实施例中，经修饰的nk细胞包含导致tgfβr2的功能丧失和tigit的功能丧失的基因组编辑。在一个实施例中，经修饰的nk细胞包含导致tgfβr2的功能丧失和adora2a的功能丧失的基因组编辑。在一个实施例中，经修饰的nk细胞包含导致tgfβr2的功能丧失和nkg2a的功能丧失的基因组编辑。在一个实施例中，经修饰的nk细胞包含导致cish的功能丧失和tigit的功能丧失的基因组编辑。在一个实施例中，经修饰的nk细胞包含导致cish的功能丧失和adora2a的功能丧失的基因组编辑。在一个实施例中，经修饰的nk细胞包含导致cish的功能丧失和nkg2a的功能丧失的基因组编辑。在一个实施例中，经修饰的nk细胞包含导致tigit的功能丧失和adora2a的功能丧失的基因组编辑。在一个实施例中，经修饰的nk细胞包含导致tigit的功能丧失和nkg2a的功能丧失的基因组编辑。在一个实施例中，经修饰的nk细胞包含导致adora2a的功能丧失和nkg2a的功能丧失的基因组编辑。在一个实施例中，经修饰的nk细胞包含导致tgfβr2的功能丧失、cish的功能丧失和tigit的功能丧失的基因组编辑。在一个实施例中，经修饰的nk细胞包含导致tgfβr2的功能丧失、cish的功能丧失和adora2a的功能丧失的基因组编辑。在一个实施例中，经修饰的nk细胞包含导致tgfβr2的功能丧失、cish的功能丧失和nkg2a的功能丧失的基因组编辑。在一个实施例中，经修饰的nk细胞包含导致tgfβr2的功能丧失、tigit的功能丧失和adora2a的功能丧失的基因组编辑。在一个实施例中，经修饰的nk细胞包含导致tgfβr2的功能丧失、tigit的功能丧失和nkg2a的功能丧失的基因组编辑。在一个实施例中，经修饰的nk细胞包含导致tgfβr2的功能丧失、adora2a的功能丧失和nkg2a的功能丧失的基因组编辑。在一个实施例中，经修饰的nk细胞包含导致cish的功能丧失、tigit的功能丧失和adora2a的功能丧失的基因组编
辑。在一个实施例中，经修饰的nk细胞包含导致cish的功能丧失、tigit的功能丧失和nkg2a的功能丧失的基因组编辑。在一个实施例中，经修饰的nk细胞包含导致cish的功能丧失、adora2a的功能丧失和nkg2a的功能丧失的基因组编辑。在一个实施例中，经修饰的nk细胞包含导致tigit的功能丧失、adora2a的功能丧失和nkg2a的功能丧失的基因组编辑。
[0009]
在一些实施例中，本文提供的经修饰的nk细胞可以包含导致经修饰的nk细胞中的以下情况的基因组编辑：外源cd16变体的表达，例如hncd16；外源il15/il15ra融合体的表达；外源hla
‑
g的表达；外源dn
‑
tgfβr2的表达；tgfβr2的功能丧失；b2m的功能丧失；pd1的功能丧失；tigit的功能丧失；和/或adora2a的功能丧失。
[0010]
在一些实施例中，本文提供的经修饰的nk细胞可以包含导致经修饰的nk细胞中的以下情况的基因组编辑：外源cd16变体的表达，例如hncd16；外源il15/il15ra融合体的表达；外源hla
‑
g的表达；外源dn
‑
tgfβr2的表达；可溶性mica和/或micb的表达；tgfβr2的功能丧失；b2m的功能丧失；pd1的功能丧失；tigit的功能丧失；和/或adora2a的功能丧失。
[0011]
在一些实施例中，本文提供的经修饰的nk细胞可以包含导致经修饰的nk细胞中的以下情况的基因组编辑：外源cd16变体的表达，例如hncd16；外源il15/il15ra融合体的表达；外源hla
‑
g的表达；外源dn
‑
tgfβr2的表达；可溶性mica和/或micb的表达；外源il
‑
12的表达；外源il
‑
18的表达；tgfβr2的功能丧失；b2m的功能丧失；pd1的功能丧失；tigit的功能丧失；和/或adora2a的功能丧失。
[0012]
在一些实施例中，本文提供的经修饰的nk细胞可以包含导致经修饰的nk细胞中的以下情况的基因组编辑：外源cd16变体的表达，例如hncd16；外源il15/il15ra融合体的表达；外源hla
‑
g的表达；外源dn
‑
tgfβr2的表达；外源il
‑
12的表达；外源il
‑
18的表达；tgfβr2的功能丧失；b2m的功能丧失；pd1的功能丧失；tigit的功能丧失；和/或adora2a的功能丧失。
[0013]
在一方面，本披露的特征是经修饰的淋巴细胞，其中经修饰的淋巴细胞不表达内源cd3、cd4和/或cd8；并表达至少一种编码以下的内源基因：(i)cd56(ncam)、cd49和/或cd45；(ii)nk细胞受体(分化簇16(cd16))；(iii)自然杀伤组
‑
2成员d(nkg2d)；(iv)cd69；(v)天然细胞毒性受体；或其两种或更多种的任何组合；其中该经修饰的淋巴细胞进一步：(1)包含至少一种编码以下的外源核酸构建体：(i)嵌合抗原受体(car)；(ii)非天然存在的免疫球蛋白γfc区受体iii变体(fcγriii，cd16)；(iii)白细胞介素15(il
‑
15)；(iv)il
‑
15受体(il
‑
15r)或其变体；(v)白细胞介素12(il
‑
12)；(vi)白细胞介素
‑
12受体(il
‑
12r)或其变体；(vii)人白细胞抗原g(hla
‑
g)；(viii)人白细胞抗原e(hla
‑
e)；(ix)编码白细胞表面抗原分化簇cd47(cd47)的核酸序列；或其两种或更多种的任何组合；和/或(2)表现出以下中至少一种的功能丧失：(i)转化生长因子β受体2(tgfβr2)；(ii)腺苷a2a受体(adora2a)；(iii)具有ig和itim结构域的t细胞免疫受体(tigit)；(iv)β
‑
2微球蛋白(b2m)；(v)程序性细胞死亡蛋白1(pd
‑
1)；(vi)细胞因子诱导型含sh2蛋白(cish)；(vii)主要组织相容性复合体ii类反式激活因子(ciita)；(viii)自然杀伤细胞受体nkg2a(自然杀伤组2a)；(ix)两种或更多种hla ii类组织相容性抗原α链基因，和/或两种或更多种hla ii类组织相容性抗原β链基因；(x)分化簇32b(cd32b，fcgr2b)；(xi)t细胞受体α恒定区(trac)；或其两种或更多种的任何组合。在一个实施例中，经修饰的淋巴细胞表现出tgfβr2的功能丧失和cish的功能丧失。在一个实施例中，经修饰的淋巴细胞表现出tgfβr2的功能丧失和tigit的功能丧
失。在一个实施例中，经修饰的淋巴细胞表现出tgfβr2的功能丧失和adora2a的功能丧失。在一个实施例中，经修饰的淋巴细胞表现出tgfβr2的功能丧失和nkg2a的功能丧失。在一个实施例中，经修饰的淋巴细胞表现出cish的功能丧失和tigit的功能丧失。在一个实施例中，经修饰的淋巴细胞表现出cish的功能丧失和adora2a的功能丧失。在一个实施例中，经修饰的淋巴细胞表现出cish的功能丧失和nkg2a的功能丧失。在一个实施例中，经修饰的淋巴细胞表现出tigit的功能丧失和adora2a的功能丧失。在一个实施例中，经修饰的淋巴细胞表现出tigit的功能丧失和nkg2a的功能丧失。在一个实施例中，经修饰的淋巴细胞表现出adora2a的功能丧失和nkg2a的功能丧失。在一个实施例中，经修饰的淋巴细胞表现出tgfβr2的功能丧失、cish的功能丧失和tigit的功能丧失。在一个实施例中，经修饰的淋巴细胞表现出tgfβr2的功能丧失、cish的功能丧失和adora2a的功能丧失。在一个实施例中，经修饰的淋巴细胞表现出tgfβr2的功能丧失、cish的功能丧失和nkg2a的功能丧失。在一个实施例中，经修饰的淋巴细胞表现出tgfβr2的功能丧失、tigit的功能丧失和adora2a的功能丧失。在一个实施例中，经修饰的淋巴细胞表现出tgfβr2的功能丧失、tigit的功能丧失和nkg2a的功能丧失。在一个实施例中，经修饰的淋巴细胞表现出tgfβr2的功能丧失、adora2a的功能丧失和nkg2a的功能丧失。在一个实施例中，经修饰的淋巴细胞表现出cish的功能丧失、tigit的功能丧失和adora2a的功能丧失。在一个实施例中，经修饰的淋巴细胞表现出cish的功能丧失、tigit的功能丧失和nkg2a的功能丧失。在一个实施例中，经修饰的淋巴细胞表现出cish的功能丧失、adora2a的缺失和nkg2a的功能丧失。在一个实施例中，经修饰的淋巴细胞表现出tigit的功能丧失、adora2a的缺失和nkg2a的功能丧失。
[0014]
在一个实施例中，经修饰的淋巴细胞不表达内源cd3、cd4和/或cd8；并表达至少一种编码以下的内源基因：(i)cd56(ncam)、cd49和/或cd45；(ii)nk细胞受体(分化簇16(cd16))；(iii)自然杀伤组
‑
2成员d(nkg2d)；(iv)cd69；(v)天然细胞毒性受体；或其两种或更多种的任何组合；其中该经修饰的淋巴细胞进一步：(1)包含至少一种编码以下的外源核酸构建体：(i)嵌合抗原受体(car)；(ii)非天然存在的免疫球蛋白γfc区受体iii变体(fcγriii，cd16)；(iii)白细胞介素15(il
‑
15)；(iv)il
‑
15受体(il
‑
15r)或其变体；(v)白细胞介素12(il
‑
12)；(vi)白细胞介素
‑
12受体(il
‑
12r)或其变体；(vii)人白细胞抗原g(hla
‑
g)；(viii)人白细胞抗原e(hla
‑
e)；(ix)编码白细胞表面抗原分化簇cd47(cd47)的核酸序列；或其两种或更多种的任何组合；和/或(2)表现出转化生长因子β受体2(tgfβr2)、细胞因子诱导型含sh2蛋白(cish)或其组合的功能丧失。
[0015]
在一些实施例中，核酸构建体是表达构建体，其包含编码在(1)(i)
‑
(1(ix)或其任何组合下列出的基因产物的核酸序列，与驱动靶细胞(例如，经修饰的淋巴细胞，例如，本文提供的经修饰的nk细胞)中的核酸序列表达的启动子可操作地连接。在一些实施例中，启动子在靶细胞中特异性地表达，例如，启动子是淋巴细胞或nk细胞特异性启动子。在一些实施例中，启动子是cd56(ncam)启动子。在一些实施例中，启动子是cd49启动子。在一些实施例中，启动子是cd45启动子。在一些实施例中，启动子是fcγriii启动子。在一些实施例中，启动子是nkg2d启动子。在一些实施例中，启动子是cd69启动子。
[0016]
在一些实施例中，编码(1)下列出的基因产物的外源核酸构建体被敲入编码(2)下列出的基因产物的基因组座位，导致(2)下列出的基因产物的功能丧失和由外源核酸构建体编码的基因产物的表达，由异源启动子驱动或由敲入外源核酸构建体的基因组座位的内
源启动子驱动。
[0017]
在一些实施例中，编码(1)下列出的基因产物的外源核酸构建体被敲入“安全港(safe harbor)”基因座，例如rosa26基因座、胶原(collagen)基因座或aavsi基因组座位。
[0018]
在一些实施例中，两种或更多种hla ii类组织相容性抗原α链基因选自hla
‑
dqa1、hla
‑
dra、hla
‑
dpa1、hla
‑
dma、hla
‑
dqa2、和hla
‑
doa。在一些实施例中，两种或更多种hla ii类组织相容性抗原β链基因选自hla
‑
dmb、hla
‑
dob、hla
‑
dpb1、hla
‑
dqb1、hla
‑
dqb3、hla
‑
dqb2、hla
‑
drb1、hla
‑
drb3、hla
‑
drb4、和hla
‑
drb5。
[0019]
在一些实施例中，经修饰的淋巴细胞包含重排的内源t细胞受体(tcr)基因座。在一些实施例中，重排的tcr包含tcrαvj和/或tcrβv(d)j区段重排和完整的v
‑
结构域外显子。
[0020]
在一些实施例中，天然细胞毒性受体是nkp30、nkp44、nkp46、和/或cd158b。
[0021]
在一些实施例中，il
‑
15r变体是组成型活性il
‑
15r变体。在一些实施例中，组成型活性il
‑
15r变体是il
‑
15r和il
‑
15r激动剂(例如il
‑
15蛋白或其il
‑
15r结合片段)的融合体。在一些实施例中，il
‑
15r激动剂是il
‑
15，或其il
‑
15r结合变体。示例性的适合il
‑
15r变体包括但不限于，例如，描述于以下中的那些：mortier e等人,2006；the journal of biological chemistry[生物化学杂志]2006 281:1612
‑
1619；或bessard
‑
a等人,mol cancer ther.[分子癌症治疗学]2009年9月；8(9):2736
‑
45，其每一项的全部内容通过引用并入本文。基于本披露和本领域的知识，另外的适合变体对本领域普通技术人员而言是显而易见的。本披露在这方面不受限制。
[0022]
在一些实施例中，tgfβr2是tgfβ受体ii的显性负性变体(dn
‑
tgfβr2)。
[0023]
在一些实施例中，car能够结合间皮素、egfr、her2、mica/b、bcma、cd19、cd22、cd20、cd33、cd123、雄激素受体、psma、psca、muc1、hpv病毒肽(即e7)、ebv病毒肽、cd70、wt1、cea、egfrviii、il13rα2、gd2、ca125、cd7、epcam、muc16和/或cd30。
[0024]
在一些实施例中，经修饰的淋巴细胞衍生自多潜能或多能干细胞。在一些实施例中，多能干细胞是造血干细胞(hsc)。在一些实施例中，多潜能干细胞是诱导性多潜能干细胞(ipsc)。在一些实施例中，多潜能干细胞是胚胎干细胞(esc)。
[0025]
在一些实施例中，经修饰的淋巴细胞衍生自多潜能或多能干细胞，其包含编码(1)(i)
‑
(1)(ix)或其任何组合中任一种的至少一种或多种外源核酸构建体；和/或至少一种基因组改变，该至少一种基因组改变实现淋巴细胞中(2)(i)
‑
(2)(xi)或其任何组合中任一种的功能丧失。
[0026]
在一些实施例中，经修饰的淋巴细胞衍生自多潜能或多能干细胞，其包括至少一种基因组改变，该至少一种基因组改变实现淋巴细胞中(2)(i)
‑
(2)(xi)或其任何组合中任一种的功能丧失。
[0027]
在一些实施例中，实现淋巴细胞中(2)(i)
‑
(2)(xi)中一种或多种的功能丧失的至少一种基因组改变包括插入外源核酸构建体。
[0028]
在一些实施例中，外源核酸构建体编码(1)(i)
‑
(1)(ix)或其任何组合中任一种。
[0029]
在一些实施例中，经修饰的淋巴细胞表现出在(2)下列出的基因/蛋白中两种或更多种的功能丧失。
[0030]
在一些实施例中，经修饰的淋巴细胞包含(2)下的含有基因或编码蛋白质的基因组座位中的外源核苷酸构建体的插缺或插入。
[0031]
在一些实施例中，经修饰的淋巴细胞包含(2)下的含有基因或编码蛋白质的两个或更多个基因组座位中的外源核苷酸构建体的插缺或插入。
[0032]
在一些实施例中，经修饰的淋巴细胞通过用rna指导的核酸酶编辑基因组座位来获得。在一些实施例中，rna指导的核酸酶是crispr/cas核酸酶。在一些实施例中，rna指导的核酸酶选自由以下组成的组：spcas9、sacas9、(kkh)sacas9、ascpf1(ascas12a)、lbcpf1、(lbcas12a)、casx、casy、cas12h1、cas12i1、cas12c1、cas12c2、espcas9、cas9
‑
hf1、hypacas9、dcas9
‑
fokl、sniper
‑
cas9、xcas9、aacas12b、evocas9、spcas9
‑
ng、vrqr、vrer、nmecas9、cjcas9、bhcas12b、和bhcas12b v4。
[0033]
在一些实施例中，经修饰的淋巴细胞通过编辑含有编码(2)下的任何蛋白质的基因的两个或更多个基因组座位来获得。在一些实施例中，含有编码(2)下的任何蛋白质的基因的两个或更多个基因组座位中至少两个已通过不同的rna指导的核酸酶编辑。在一些实施例中，含有编码(2)下的任何蛋白质的基因的两个或更多个基因组座位中至少一个已通过cas9编辑，并且其中该基因座中至少一个已通过cpf1编辑。
[0034]
在一些实施例中，经修饰的淋巴细胞表达内源cd56、cd49和cd45。
[0035]
在一些实施例中，经修饰的淋巴细胞是自然杀伤(nk)细胞。
[0036]
在另一方面，本披露的特征是经修饰的细胞，其中经修饰的细胞(1)包含至少一种编码以下的外源核酸构建体：(i)嵌合抗原受体(car)；(ii)非天然存在的免疫球蛋白γfc区受体iii变体(fcγriii，分化簇16(cd16))；(iii)白细胞介素15(il
‑
15)；(iv)il
‑
15受体(il
‑
15r)或其变体；(v)白细胞介素12(il
‑
12)；(vi)il
‑
12受体(il
‑
12r)或其变体；(vii)人白细胞抗原g(hla
‑
g)；(viii)人白细胞抗原e(hla
‑
e)；(ix)白细胞表面抗原分化簇cd47(cd47)；或其两种或更多种的任何组合；和/或(2)表现出以下中至少一种的功能丧失：(i)转化生长因子β受体2(tgfβr2)；(ii)腺苷a2a受体(adora2a)；(iii)具有ig和itim结构域的t细胞免疫受体(tigit)；(iv)β
‑
2微球蛋白(b2m)；(v)程序性细胞死亡蛋白1(pd
‑
1)；(vi)细胞因子诱导型含sh2蛋白(cish)；(vii)主要组织相容性复合体ii类反式激活因子(ciita)；(viii)自然杀伤细胞受体nkg2a(自然杀伤组2a)；(ix)两种或更多种hla ii类组织相容性抗原α链基因，和/或两种或更多种hla ii类组织相容性抗原β链基因；(x)分化簇32b(cd32b，fcgr2b)；(xi)t细胞受体α恒定区(trac)；或其两种或更多种的任何组合。在一个实施例中，经修饰的细胞表现出tgfβr2的功能丧失和cish的功能丧失。在一个实施例中，经修饰的细胞表现出tgfβr2的功能丧失和tigit的功能丧失。在一个实施例中，经修饰的细胞表现出tgfβr2的功能丧失和adora2a的功能丧失。在一个实施例中，经修饰的细胞表现出tgfβr2的功能丧失和nkg2a的功能丧失。在一个实施例中，经修饰的细胞表现出cish的功能丧失和tigit的功能丧失。在一个实施例中，经修饰的细胞表现出cish的功能丧失和adora2a的功能丧失。在一个实施例中，经修饰的细胞表现出cish的功能丧失和nkg2a的功能丧失。在一个实施例中，经修饰的细胞表现出tigit的功能丧失和adora2a的功能丧失。在一个实施例中，经修饰的细胞表现出tigit的功能丧失和nkg2a的功能丧失。在一个实施例中，经修饰的细胞表现出adora2a的功能丧失和nkg2a的功能丧失。在一个实施例中，经修饰的细胞表现出tgfβr2的功能丧失、cish的功能丧失和tigit的功能丧失。在一个实施例中，经修饰的细胞表现出tgfβr2的功能丧失、cish的功能丧失和adora2a的功能丧失。在一个实施例中，经修饰的细胞表现出tgfβr2的功能丧失、cish的功能丧失和nkg2a的功能丧失。在一个实施
例中，经修饰的细胞表现出tgfβr2的功能丧失、tigit的功能丧失和adora2a的功能丧失。在一个实施例中，经修饰的细胞表现出tgfβr2的功能丧失、tigit的功能丧失和nkg2a的功能丧失。在一个实施例中，经修饰的细胞表现出tgfβr2的功能丧失、adora2a的功能丧失和nkg2a的功能丧失。在一个实施例中，经修饰的细胞表现出cish的功能丧失、tigit的功能丧失和adora2a的功能丧失。在一个实施例中，经修饰的细胞表现出cish的功能丧失、tigit的功能丧失和nkg2a的功能丧失。在一个实施例中，经修饰的细胞表现出cish的功能丧失、adora2a的功能丧失和nkg2a的功能丧失。在一个实施例中，经修饰的细胞表现出tigit的功能丧失、adora2a的功能丧失和nkg2a的功能丧失。
[0037]
在一个实施例中，经修饰的细胞(1)包含至少一种编码以下的外源核酸构建体：(i)嵌合抗原受体(car)；(ii)非天然存在的免疫球蛋白γfc区受体iii变体(fcγriii，分化簇16(cd16))；(iii)白细胞介素15(il
‑
15)；(iv)il
‑
15受体(il
‑
15r)或其变体；(v)白细胞介素12(il
‑
12)；(vi)il
‑
12受体(il
‑
12r)或其变体；(vii)人白细胞抗原g(hla
‑
g)；(viii)人白细胞抗原e(hla
‑
e)；(ix)白细胞表面抗原分化簇cd47(cd47)；或其两种或更多种的任何组合；和/或(2)表现出转化生长因子β受体2(tgfβr2)、细胞因子诱导型含sh2蛋白(cish)或其组合的功能丧失。
[0038]
在本文提供的包含外源核酸构建体的经修饰的细胞(例如，经修饰的淋巴细胞)的一些实施例中，外源核酸构建体是表达构建体，其包含编码在(1)(i)
‑
(1(x)或其任何组合下列出的基因产物的核酸序列，与驱动靶细胞(例如，经修饰的淋巴细胞，例如，本文提供的经修饰的nk细胞)中的核酸序列表达的启动子可操作地连接。在一些实施例中，启动子在靶细胞中特异性地表达，例如，启动子是淋巴细胞或nk细胞特异性启动子。在一些实施例中，启动子是cd56(ncam)启动子。在一些实施例中，启动子是cd49启动子。在一些实施例中，启动子是cd45启动子。在一些实施例中，启动子是fcγriii启动子。在一些实施例中，启动子是nkg2d启动子。在一些实施例中，启动子是cd69启动子。
[0039]
在本文提供的经修饰的细胞(例如，经修饰的淋巴细胞)的一些实施例中，编码(1)下列出的基因产物的外源核酸构建体被敲入编码(2)下列出的基因产物的基因组座位，导致(2)下列出的基因产物的功能丧失和由外源核酸构建体编码的基因产物的表达，由异源启动子驱动或由敲入外源核酸构建体的基因组座位的内源启动子驱动。
[0040]
在本文提供的经修饰的细胞(例如，经修饰的淋巴细胞)的一些实施例中，这些经修饰的细胞包含两种或更多种hla ii类组织相容性抗原α链基因和/或两种或更多种hla ii类组织相容性抗原β链基因的功能丧失，该两种或更多种hla ii类组织相容性抗原α链基因选自hla
‑
dqa1、hla
‑
dra、hla
‑
dpa1、hla
‑
dma、hla
‑
dqa2、和hla
‑
doa。在一些实施例中，两种或更多种hla ii类组织相容性抗原β链基因选自hla
‑
dmb、hla
‑
dob、hla
‑
dpb1、hla
‑
dqb1、hla
‑
dqb3、hla
‑
dqb2、hla
‑
drb1、hla
‑
drb3、hla
‑
drb4、和hla
‑
drb5。
[0041]
在一些实施例中，经修饰的细胞是免疫细胞。在一些实施例中，免疫细胞是淋巴细胞。在一些实施例中，淋巴细胞是nk细胞。在一些实施例中，淋巴细胞是ink细胞。
[0042]
在一些实施例中，经修饰的细胞是多潜能或多能干细胞，例如ips细胞或造血干细胞，或衍生自这种多能或多潜能干细胞的分化细胞，例如ink细胞。
[0043]
在一些实施例中，经修饰的细胞不表达内源t细胞共受体。
[0044]
在一些实施例中，淋巴细胞是t细胞。
[0045]
在一些实施例中，经修饰的细胞包含重排的内源tcr基因座，其中该重排的tcr包含tcrαvj和/或tcrβv(d)j区段重排和完整的v
‑
结构域外显子。
[0046]
在一些实施例中，经修饰的细胞表达至少一种编码以下的内源基因：(i)cd56(ncam)、cd49和/或cd45；(ii)nk细胞受体(分化簇16(cd16))；(iii)自然杀伤组
‑
2成员d(nkg2d)；(iv)cd69；(v)天然细胞毒性受体；或其两种或更多种的任何组合。
[0047]
在一些实施例中，天然细胞毒性受体是nkp30、nkp44、nkp46、和/或cd158b。
[0048]
在一些实施例中，经修饰的细胞表达至少一种nk细胞生物标记。在一些实施例中，nk细胞生物标记是cd56、cd49和/或cd45。
[0049]
在一方面，本文披露了一种细胞群，其包含本文所述的经修饰的淋巴细胞或本文所述的经修饰的细胞。
[0050]
在一方面，本文披露了一种药物组合物，其包含本文披露的细胞群。
[0051]
在另一方面，本披露提供了分离的淋巴细胞群，其中该细胞群包含至少1x103、至少1x104、至少1x105、至少2x105、至少3x105、至少4x105、至少5x105、至少1x106、至少2x106、至少3x106、至少4x106、至少5x106、至少1x107、至少1x107、至少2x107、至少3x107、至少4x107、至少5x107、至少1x108、至少2x108、至少3x108、至少4x108、至少5x108、至少1x109、至少1x109、至少2x109、至少3x109、至少4x109、至少5x109、至少1x10
10
、至少2x10
10
、至少3x10
10
、至少4x10
10
、至少5x10
10
、至少1x10
11
、或至少1x10
12
个细胞，并且其中该细胞群中的淋巴细胞的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.9％、至少99.99％、至少99.999％、或几乎100％：(a)包含重排的t细胞受体(tcr)基因座；(b)不表达内源cd3；(c)表达内源cd56(ncam)、cd49和/或cd45；并且(d)表达至少编码以下的内源基因：(i)nk细胞受体(分化簇16(cd16))；(ii)自然杀伤组
‑
2成员d(nkg2d)；(iii)cd69；(iv)天然细胞毒性受体；或其两种或更多种的任何组合；并且其中该经修饰的淋巴细胞进一步：(1)包含至少一种编码以下的外源核酸构建体：(i)嵌合抗原受体(car)；(ii)非天然存在的免疫球蛋白γfc区受体iii变体(fcγriii，cd16)；(iii)白细胞介素15(il
‑
15)；(iv)il
‑
15受体(il
‑
15r)或其变体；(v)白细胞介素12(il
‑
12)；(vi)il
‑
12受体(il
‑
12r)或其变体；(vii)人白细胞抗原g(hla
‑
g)；(viii)人白细胞抗原e(hla
‑
e)；(ix)白细胞表面抗原分化簇cd47(cd47)；或其两种或更多种的任何组合；和/或(2)表现出以下中至少一种的功能丧失：(i)转化生长因子β受体2(tgfβr2)；(ii)腺苷a2a受体(adora2a)；(iii)具有ig和itim结构域的t细胞免疫受体(tigit)；(iv)β
‑
2微球蛋白(b2m)；(v)程序性细胞死亡蛋白1(pd
‑
1)；(vi)细胞因子诱导型含sh2蛋白(cish)；(vii)主要组织相容性复合体ii类反式激活因子(ciita)；(viii)自然杀伤细胞受体nkg2a(自然杀伤组2a)；(ix)两种或更多种hla ii类组织相容性抗原α链基因，和/或两种或更多种hla ii类组织相容性抗原β链基因；(x)分化簇32b(cd32b，fcgr2b)；(xi)t细胞受体α恒定区(trac)；或其两种或更多种的任何组合。在一个实施例中，经修饰的淋巴细胞表现出tgfβr2的功能丧失和cish的功能丧失。在一个实施例中，经修饰的淋巴细胞表现出tgfβr2的功能丧失和tigit的功能丧失。在一个实施例中，经修饰的淋巴细胞表现出tgfβr2的功能丧失和adora2a的功能丧失。在一个实施例中，经修饰的淋巴细胞表现出tgfβr2的功能丧失和nkg2a的功能丧失。在一个实施例中，经修饰的淋巴细胞表现出cish的功能丧失和tigit的功能丧失。在一个实施例中，经修饰的淋巴细胞表现出cish的功能丧失和adora2a的功能丧失。在一个实施例中，经修饰的淋巴细胞
表现出cish的功能丧失和nkg2a的功能丧失。在一个实施例中，经修饰的淋巴细胞表现出tigit的功能丧失和adora2a的功能丧失。在一个实施例中，经修饰的淋巴细胞表现出tigit的功能丧失和nkg2a的功能丧失。在一个实施例中，经修饰的淋巴细胞表现出adora2a的功能丧失和nkg2a的功能丧失。在一个实施例中，经修饰的淋巴细胞表现出tgfβr2的功能丧失、cish的功能丧失和tigit的功能丧失。在一个实施例中，经修饰的淋巴细胞表现出tgfβr2的功能丧失、cish的功能丧失和adora2a的功能丧失。在一个实施例中，经修饰的淋巴细胞表现出tgfβr2的功能丧失、cish的功能丧失和nkg2a的功能丧失。在一个实施例中，经修饰的淋巴细胞表现出tgfβr2的功能丧失、tigit的功能丧失和adora2a的功能丧失。在一个实施例中，经修饰的淋巴细胞表现出tgfβr2的功能丧失、tigit的功能丧失和nkg2a的功能丧失。在一个实施例中，经修饰的淋巴细胞表现出tgfβr2的功能丧失、adora2a的功能丧失和nkg2a的功能丧失。在一个实施例中，经修饰的淋巴细胞表现出cish的功能丧失、tigit的功能丧失和adora2a的功能丧失。在一个实施例中，经修饰的淋巴细胞表现出cish的功能丧失、tigit的功能丧失和nkg2a的功能丧失。在一个实施例中，经修饰的淋巴细胞表现出cish的功能丧失、adora2a的缺失和nkg2a的功能丧失。在一个实施例中，经修饰的淋巴细胞表现出tigit的功能丧失、adora2a的缺失和nkg2a的功能丧失。
[0052]
在一个实施例中，分离的淋巴细胞群包含至少1x103、至少1x104、至少1x105、至少2x105、至少3x105、至少4x105、至少5x105、至少1x106、至少2x106、至少3x106、至少4x106、至少5x106、至少1x107、至少1x107、至少2x107、至少3x107、至少4x107、至少5x107、至少1x108、至少2x108、至少3x108、至少4x108、至少5x108、至少1x109、至少1x109、至少2x109、至少3x109、至少4x109、至少5x109、至少1x10
10
、至少2x10
10
、至少3x10
10
、至少4x10
10
、至少5x10
10
、至少1x10
11
、或至少1x10
12
个细胞，并且其中该细胞群中的淋巴细胞的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.9％、至少99.99％、至少99.999％、或几乎100％：(a)包含重排的t细胞受体(tcr)基因座；(b)不表达内源cd3；(c)表达内源cd56(ncam)、cd49和/或cd45；并且(d)表达至少编码以下的内源基因：(i)nk细胞受体(分化簇16(cd16))；(ii)自然杀伤组
‑
2成员d(nkg2d)；(iii)cd69；(iv)天然细胞毒性受体；或其两种或更多种的任何组合；并且其中该经修饰的淋巴细胞进一步：(1)包含至少一种编码以下的外源核酸构建体：(i)嵌合抗原受体(car)；(ii)非天然存在的免疫球蛋白γfc区受体iii变体(fcγriii，cd16)；(iii)白细胞介素15(il
‑
15)；(iv)il
‑
15受体(il
‑
15r)或其变体；(v)白细胞介素12(il
‑
12)；(vi)il
‑
12受体(il
‑
12r)或其变体；(vii)人白细胞抗原g(hla
‑
g)；(viii)人白细胞抗原e(hla
‑
e)；(ix)白细胞表面抗原分化簇cd47(cd47)；或其两种或更多种的任何组合；和/或(2)表现出转化生长因子β受体2(tgfβr2)、细胞因子诱导型含sh2蛋白(cish)或其组合的功能丧失。
[0053]
在一些实施例中，重排的tcr基因座包含tcrαvj和/或tcrβv(d)j区段重排和完整的v
‑
结构域外显子。在一些实施例中，重排的内源tcr基因座由不超过两个重排的等位基因组成。
[0054]
在一些实施例中，天然细胞毒性受体是nkp30、nkp44、nkp46、和/或cd158b。
[0055]
在一些实施例中，体外淋巴细胞群不包含超过1％、超过0.1％、超过0.001％、超过0.0001％、超过0.00001％、超过0.000001％、超过0.0000001％、超过0.00000001％、超过0.000000001％、超过0.0000000001％、或超过超过0.00000000001％的表达来自外源核酸
构建体的重编程因子的细胞。
[0056]
在一些实施例中，体外淋巴细胞群不包含表达来自外源核酸构建体的重编程因子的细胞。在一些实施例中，重编程因子是oct
‑
4和/或sox
‑
2。
[0057]
在一些实施例中，体外淋巴细胞群不包含含有编码重编程因子的游离型表达构建体的细胞。
[0058]
在一些实施例中，体外淋巴细胞群中的每个细胞包含(1)下列出的外源核酸构建体和(2)下列出的功能丧失的相同组合。
[0059]
在一些实施例中，体外淋巴细胞群包含少于0.001％、少于0.002％、少于0.003％、少于0.004％、少于0.005％、少于0.006％、少于0.007％、少于0.008％、少于0.009％、少于0.01％、少于0.02％、少于0.03％、少于0.04％、少于0.05％、少于0.06％、少于0.07％、少于0.08％、少于0.09％、少于0.1％、少于0.2％、少于0.3％、少于0.4％、少于0.5％、少于0.6％、少于0.7％、少于0.8％、少于0.9％、少于1％、少于2％、少于3％、少于4％、少于5％、少于6％、少于7％、少于8％、少于9％、或少于10％的含有染色体易位的细胞。
[0060]
在另一方面，本披露提供了一种治疗受试者的方法，该方法包括向有需要的受试者施用任何经修饰的淋巴细胞、任何经修饰的细胞、任何药物组合物或体外分离的细胞群。在一些实施例中，受试者患有或被诊断出增殖性疾病。在一些实施例中，增殖性疾病是癌症。在一些实施例中，癌症是乳腺癌、结直肠癌、胃癌、肾细胞癌(rcc)、或非小细胞肺癌(nsclc)、实体瘤、膀胱癌、肝细胞癌、前列腺癌、卵巢癌/子宫癌、胰腺癌、间皮瘤、黑素瘤、胶质母细胞瘤、hpv相关和/或hpv阳性癌症如宫颈癌和hpv 头颈癌、口腔癌、咽癌、甲状腺癌、胆囊癌、软组织肉瘤和血液学癌症像all、cll、nhl、dlbcl、aml、cml、多发性骨髓瘤(mm)。
[0061]
在一些实施例中，产生本披露的经修饰的淋巴细胞、经修饰的细胞、细胞群或体外分离的淋巴细胞群的方法包括：(a)获得诱导性多潜能干细胞(ipsc)；(b)修饰该ipsc或其未分化的或分化的子细胞，以包含(1)的至少一个外源基因和/或包含(2)的至少一种基因的功能丧失；(c)使该ipsc的分化指向造血谱系细胞，其中这些造血谱系细胞保留在这些ipsc中包含的经编辑的遗传基因座。
[0062]
在一些实施例中，分化指向包括：(i)使ipsc与包含bmp路径激活剂和任选地bfgf的组合物接触，以获得中胚层细胞；以及(ii)使这些中胚层细胞与包含bmp路径激活剂、bfgf和wnt路径激活剂的组合物接触，以获得具有确定性生血内皮(he)潜力的中胚层细胞，其中这些具有确定性生血内皮(he)潜力的中胚层细胞能够提供造血谱系细胞；其中中胚层细胞和具有确定性he潜力的中胚层细胞在步骤(i)和(ii)中获得，没有拟胚体形成的步骤；其中这些造血谱系细胞包含确定性生血内皮细胞、造血干细胞和祖细胞(hsc)、造血多能祖细胞(mpp)、前t细胞祖细胞、前nk细胞祖细胞、t细胞祖细胞、nk细胞祖细胞、t细胞、nk细胞、nkt细胞或b细胞。
[0063]
在一些实施例中，使ipsc的分化指向造血谱系细胞的方法进一步包括：使这些具有确定性he潜力的中胚层细胞与包含bfgf和rock抑制剂的组合物接触，以获得确定性he细胞。
[0064]
在一些实施例中，分化指向的方法进一步包括：使这些确定性he细胞与以下的组合物接触，该组合物包含bmp激活剂和任选地rock抑制剂以及选自由tpo、il3、gmcsf、epo、bfgf、vegf、scf、il6、flt3l和il11组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子，以获得造
血多能祖细胞(mpp)。
[0065]
在一些实施例中，分化指向的方法进一步包括：使这些确定性he细胞与以下的组合物接触，该组合物包含选自由scf、flt3l和il7组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子；以及任选地bmp激活剂、rock抑制剂、tpo、vegf和bfgf中的一种或多种，以获得前t细胞祖细胞、t细胞祖细胞和/或t细胞。
[0066]
在一些实施例中，分化指向的方法进一步包括：使这些确定性he细胞与以下的组合物接触，该组合物包含选自由scf、flt3l、tpo、il7和il15组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子，以及任选地bmp激活剂、rock抑制剂、vegf和bfgf中的一种或多种，以获得前nk细胞祖细胞、nk细胞祖细胞和/或nk细胞。
[0067]
在一些实施例中，产生本披露的经修饰的淋巴细胞、经修饰的细胞、细胞群或体外分离的淋巴细胞群的方法进一步包括：在步骤c)之前，使多潜能干细胞与包含mek抑制剂、gsk3抑制剂和rock抑制剂的组合物接触，以接种和扩增这些细胞。
[0068]
在一些实施例中，产生本披露的经修饰的淋巴细胞、经修饰的细胞、细胞群或体外分离的淋巴细胞群的方法进一步包括：检测这些造血谱系细胞中的重排t细胞受体(tcr)基因座。在一些实施例中，该方法进一步包括基于由结合目的抗原的重排的tcr基因座编码的tcr，选择包含该重排的tcr基因座的造血谱系细胞。在一些实施例中，目的抗原是肿瘤抗原。
[0069]
在另一方面，本披露提供了一种方法，该方法包括：将供体细胞重编程为多能状态；编辑该供体细胞基因组中的靶基因座；以及使该重编程的供体细胞分化为淋巴细胞。在一些实施例中，编辑在将供体细胞重编程为多能状态的步骤之前或期间进行。在一些实施例中，供体细胞是成纤维细胞、外周血细胞、淋巴细胞、或t细胞。
[0070]
在另一方面，本披露提供了一种方法，该方法包括：将经遗传修饰的多潜能干细胞分化为淋巴细胞，其中该经遗传修饰的多潜能干细胞包含：(1)外源核酸，该外源核酸包含：(i)编码嵌合抗原受体(car)的核酸；(ii)编码非天然存在的免疫球蛋白γfc区受体iii变体(fcγriii，cd16)的核酸；(iii)编码白细胞介素15(il
‑
15)的核酸；(iv)编码il
‑
15r或其变体的核酸；(v)编码白细胞介素12(il
‑
12)的核酸；(vi)编码il
‑
12r或其变体的核酸；(vii)编码人白细胞抗原g(hla
‑
g)的核酸；(viii)人白细胞抗原e(hla
‑
e)；(ix)白细胞表面抗原分化簇cd47(cd47)；或其两种或更多种的任何组合；和(2)在以下一个或多个遗传基因座中的外源核酸插缺或插入：(i)转化生长因子β受体2(tgfβr2)；(ii)腺苷a2a受体(adora2a)；(iii)具有ig和itim结构域的t细胞免疫受体(tigit)；(iv)β
‑
2微球蛋白(b2m)；(v)程序性细胞死亡蛋白1(pd
‑
1，cd279)；(vi)细胞因子诱导型含sh2蛋白(cish)；(vii)主要组织相容性复合体ii类反式激活因子(ciita)；(viii)自然杀伤细胞受体nkg2a(自然杀伤组2a)；(ix)两种或更多种hla ii类组织相容性抗原α链基因，和/或两种或更多种hla ii类组织相容性抗原β链基因；(x)分化簇32b(cd32b，fcgr2b)；(xi)t细胞受体α恒定区(trac)；或其两种或更多种的任何组合，其中该插缺或插入导致由对应的一个或多个遗传基因座编码的基因产物的功能丧失。在一个实施例中，该方法包括将经遗传修饰的多潜能干细胞分化为淋巴细胞，其中该经遗传修饰的多潜能干细胞包括在tgfβr2和cish中的外源核酸插缺或插入，其中该插缺或插入导致由tgfβr2和/或cish编码的基因产物的功能丧失。在一个实施例中，该方法包括将经遗传修饰的多潜能干细胞分化为淋巴细胞，其中该经遗
传修饰的多潜能干细胞包括在tgfβr2和tigit中的外源核酸插缺或插入，其中该插缺或插入导致由tgfβr2和/或tigit编码的基因产物的功能丧失。在一个实施例中，该方法包括将经遗传修饰的多潜能干细胞分化为淋巴细胞，其中该经遗传修饰的多潜能干细胞包括在tgfβr2和adora2a中的外源核酸插缺或插入，其中该插缺或插入导致由tgfβr2和/或adora2a编码的基因产物的功能丧失。在一个实施例中，该方法包括将经遗传修饰的多潜能干细胞分化为淋巴细胞，其中该经遗传修饰的多潜能干细胞包括在tgfβr2和nkg2a中的外源核酸插缺或插入，其中该插缺或插入导致由tgfβr2和/或nkg2a编码的基因产物的功能丧失。在一个实施例中，该方法包括将经遗传修饰的多潜能干细胞分化为淋巴细胞，其中该经遗传修饰的多潜能干细胞包括在cish和tigit中的外源核酸插缺或插入，其中该插缺或插入导致由cish和/或tigit编码的基因产物的功能丧失。在一个实施例中，该方法包括将经遗传修饰的多潜能干细胞分化为淋巴细胞，其中该经遗传修饰的多潜能干细胞包括在cish和adora2a中的外源核酸插缺或插入，其中该插缺或插入导致由cish和/或adora2a编码的基因产物的功能丧失。在一个实施例中，该方法包括将经遗传修饰的多潜能干细胞分化为淋巴细胞，其中该经遗传修饰的多潜能干细胞包括在cish和nkg2a中的外源核酸插缺或插入，其中该插缺或插入导致由cish和/或nkg2a编码的基因产物的功能丧失。在一个实施例中，该方法包括将经遗传修饰的多潜能干细胞分化为淋巴细胞，其中该经遗传修饰的多潜能干细胞包括在tigit和adora2a中的外源核酸插缺或插入，其中该插缺或插入导致由tigit和/或adora2a编码的基因产物的功能丧失。在一个实施例中，该方法包括将经遗传修饰的多潜能干细胞分化为淋巴细胞，其中该经遗传修饰的多潜能干细胞包括在tigit和nkg2a中的外源核酸插缺或插入，其中该插缺或插入导致由tigit和/或nkg2a编码的基因产物的功能丧失。在一个实施例中，该方法包括将经遗传修饰的多潜能干细胞分化为淋巴细胞，其中该经遗传修饰的多潜能干细胞包括在adora2a和nkg2a中的外源核酸插缺或插入，其中该插缺或插入导致由adora2a和/或nkg2a编码的基因产物的功能丧失。在一个实施例中，该方法包括将经遗传修饰的多潜能干细胞分化为淋巴细胞，其中该经遗传修饰的多潜能干细胞包括在tgfβr2、cish和tigit中的外源核酸插缺或插入，其中该插缺或插入导致由tgfβr2、cish和/或tigit编码的基因产物的功能丧失。在一个实施例中，该方法包括将经遗传修饰的多潜能干细胞分化为淋巴细胞，其中该经遗传修饰的多潜能干细胞包括在tgfβr2、cish和adora2a中的外源核酸插缺或插入，其中该插缺或插入导致由tgfβr2、cish和/或adora2a编码的基因产物的功能丧失。在一个实施例中，该方法包括将经遗传修饰的多潜能干细胞分化为淋巴细胞，其中该经遗传修饰的多潜能干细胞包括在tgfβr2、cish和nkg2a中的外源核酸插缺或插入，其中该插缺或插入导致由tgfβr2、cish和/或nkg2a编码的基因产物的功能丧失。在一个实施例中，该方法包括将经遗传修饰的多潜能干细胞分化为淋巴细胞，其中该经遗传修饰的多潜能干细胞包括在tgfβr2、tigit和adora2a中的外源核酸插缺或插入，其中该插缺或插入导致由tgfβr2、tigit和/或adora2a编码的基因产物的功能丧失。在一个实施例中，该方法包括将经遗传修饰的多潜能干细胞分化为淋巴细胞，其中该经遗传修饰的多潜能干细胞包括在tgfβr2、tigit和nkg2a中的外源核酸插缺或插入，其中该插缺或插入导致由tgfβr2、tigit和/或nkg2a编码的基因产物的功能丧失。在一个实施例中，该方法包括将经遗传修饰的多潜能干细胞分化为淋巴细胞，其中该经遗传修饰的多潜能干细胞包括在tgfβr2、adora2a和nkg2a中的外源核酸插缺或插入，其中该插缺或插入导
致由tgfβr2、adora2a和/或nkg2a编码的基因产物的功能丧失。在一个实施例中，该方法包括将经遗传修饰的多潜能干细胞分化为淋巴细胞，其中该经遗传修饰的多潜能干细胞包括在cish、tigit和adora2a中的外源核酸插缺或插入，其中该插缺或插入导致由cish、tigit和/或adora2a编码的基因产物的功能丧失。在一个实施例中，该方法包括将经遗传修饰的多潜能干细胞分化为淋巴细胞，其中该经遗传修饰的多潜能干细胞包括在cish、tigit和nkg2a中的外源核酸插缺或插入，其中该插缺或插入导致由cish、tigit和/或nkg2a编码的基因产物的功能丧失。在一个实施例中，该方法包括将经遗传修饰的多潜能干细胞分化为淋巴细胞，其中该经遗传修饰的多潜能干细胞包括在cish、adora2a和nkg2a中的外源核酸插缺或插入，其中该插缺或插入导致由cish、adora2a和/或nkg2a编码的基因产物的功能丧失。在一个实施例中，该方法包括将经遗传修饰的多潜能干细胞分化为淋巴细胞，其中该经遗传修饰的多潜能干细胞包括在tigit、adora2a和nkg2a中的外源核酸插缺或插入，其中该插缺或插入导致由tigit、adora2a和/或nkg2a编码的基因产物的功能丧失。
[0071]
在一些实施例中，(2)的外源核酸是(1)的外源核酸。在一些实施例中，多潜能干细胞是ips细胞。在一些实施例中，分化包括使多潜能干细胞与一种分化培养基或一系列分化培养基接触。
附图说明
[0072]
图1a和1b描绘了在nk细胞中实现了tgfbr2和cish的稳健单和双基因编辑。在nk细胞中使用crispr
‑
cpf1单独和同时靶向tgfbr2和cish在大于80％的nk细胞中两个靶标处都产生插/缺(in/del)，在编辑后72小时有大于90％的经编辑nk细胞存活。
[0073]
图2a和2b描绘了球状体曲线的归一化保持与在非归一化数据中观察到的相同的功效模式，如在3个独特的供体和5个独立实验中分析的。每个单敲除(sko)nk组在减少sk
‑
ov
‑
3球状体大小时比对照nk显著更有效，并且双重敲除(dko)nk组在减少sk
‑
ov
‑
3球状体大小时比sko nk组显著更有效。图2a描绘了在10:1e:t下用10ng/ml tgfβ进行的sk
‑
ov
‑
3球状体分析(3个供体，5个独立实验)。图2b具有作为sem的误差条。统计显著性是双向anova分析的结果。双向anova分析在一些实验中由于缺少时间点而排除了大于104小时的时间点。混合模型分析在考虑所有时间点时产生了相同或改进的组间统计学显著性。
[0074]
图3a和图3b描绘了在sk
‑
ov
‑
3球状体测定中，即使在较低nk效应细胞与靶细胞(e:t)比率下，cish/tgfbr2双重敲除nk细胞也证明了相对于单敲除nk细胞或对照nk细胞的优越效应子功能。图3a描绘了在20:1e:t下用10ng/ml tgf
‑
β进行的sk
‑
ov
‑
3球状体分析，如在3个独特的供体和5个独立实验中分析的。图3b描绘了在10:1e:t下用10ng/ml tgf
‑
β进行的sk
‑
ov
‑
3球状体分析，如在4个独特的供体和7个独立实验中分析的。在所有条件下不同的e:t比率之间的这些边际差异表明，效应细胞表型是由敲除而不是nk细胞与靶细胞的比率驱动的。
[0075]
图4a和图4b描绘了在pc
‑
3球状体测定中，即使在较低nk效应细胞与靶细胞(e:t)比率下，cish/tgfbr2双重敲除nk细胞也证明了相对于单敲除nk细胞或对照nk细胞的优越效应子功能。图4a描绘了在20:1e:t下用10ng/ml tgf
‑
β进行的pc
‑
3球状体分析，如在3个独特的供体和5个独立实验中分析的。图4b描绘了在10:1e:t下用10ng/ml tgf
‑
β进行的pc
‑
3球状体分析，如在4个独特的供体和7个独立实验中分析的。在所有条件下不同的e:t比率之
间的这些边际差异表明，效应细胞表型是由敲除而不是nk细胞与靶细胞的比率驱动的。
[0076]
图5a和图5b描绘了在sk
‑
ov
‑
3和pc
‑
3球状体测定中，在不存在任何外源细胞因子的情况下，cish/tgfbr2双重敲除nk细胞证明了相对于单敲除nk细胞或对照nk细胞的优越效应子功能。图5a描绘了在不存在任何外源细胞因子的情况下，在10:1e:t下的sk
‑
ov
‑
3球状体分析，如在4个独特的供体和7个独立实验中分析的。图5b描绘了在不存在任何外源细胞因子的情况下，在10:1e:t下的pc
‑
3球状体分析，如在4个独特的供体和7个独立实验中分析的。
[0077]
图6a描绘了ifn
‑
γ浓度与球状体测定中的nk细胞功效相关联。用10ng/ml tgf
‑
β和5ng/ml il
‑
15在不同e:t下进行sk
‑
ov
‑
3球状体分析。5:1和10:1e:t下的分析在4个独特的供体和7个独立实验中进行。20:1e:t下的分析在3个独特的供体和5个独立实验中进行。
[0078]
图6b描绘了tnf
‑
α浓度与球状体测定中的nk细胞功效相关联。用10ng/ml tgf
‑
β和5ng/ml il
‑
15在不同e:t下进行sk
‑
ov
‑
3球状体分析。5:1和10:1e:t下的分析在4个独特的供体和7个独立实验中进行。20:1e:t下的分析在3个独特的供体和5个独立实验中进行。
[0079]
图6c描绘了cish/tgfbr2双重敲除(dko)nk细胞中的标记表达。收获对照(未编辑的)和双重敲除nk细胞以在编辑后72小时染色。量化nk激活标记cd25和cd69的表达。与对照nk细胞相比，双ko nk细胞表达了显著较高水平的激活标记cd25和cd69。
[0080]
图6d描绘了在体内模型中测量nk细胞的抗肿瘤活性。nsg小鼠接受了500,000个用萤光素酶标记的skov3肿瘤细胞的腹膜内注射。肿瘤植入后七天，1000万经编辑的(cish/tgfbr2双敲除)或未编辑的(对照)nk细胞被注射到荷瘤小鼠的腹膜腔中。通过ip施用萤光素和ivis成像每周监测肿瘤负荷。在第34天进行双向anova分析，以确定对照和dko nk细胞组之间的统计学显著性(****，p<0.0001)
[0081]
图7a描绘了在2个独立实验和3个独特的供体中，在nk细胞中实现的稳健tigit单基因编辑。
[0082]
图7b描绘了在2个独立实验和3个独特的供体中，nk细胞中实现的稳健nkg2a单基因编辑。
[0083]
图7c描绘了在3个独立实验和3个独特的供体中，nk细胞中实现的稳健adora2a单基因编辑。
[0084]
图8a和图8b描绘了在体外球状体测定中，在不同效应细胞与靶细胞(e:t)比率下，tigit单敲除nk细胞证明了相对于未编辑的对照nk细胞的优越效应子功能。图8a描绘了在20:1e:t下的肿瘤球状体分析，如在2个独特的供体和2个独立实验中分析的。持续6天在incucyte成像系统上每两小时测量红色目标强度。图8b描绘了在1.25:1、2.5:1、5:1、10:1和20:1效应子:靶标比率下的肿瘤球状体分析，如在2个独特的供体和2个独立实验中分析的。在添加nk细胞后100小时显示红色目标强度。
[0085]
图9a和图9b描绘了在体外球状体测定中，在不同效应细胞与靶细胞(e:t)比率下，nkg2a单敲除nk细胞证明了相对于未编辑的对照nk细胞的优越效应子功能。图9a描绘了在20:1e:t下的肿瘤球状体分析，如在2个独特的供体和2个独立实验中分析的。持续6天在incucyte成像系统上每两小时测量红色目标强度。图9b描绘了在1.25:1、2.5:1、5:1、10:1和20:1e:t下的肿瘤球状体分析，如在2个独特的供体和2个独立实验中分析的。在添加nk细胞后100小时显示红色目标强度。
[0086]
图10a和图10b描绘了在体外球状体测定中，在不同效应细胞与靶细胞(e:t)比率下，adora2a单敲除nk细胞证明了相对于未编辑的对照nk细胞的优越效应子功能。图10a描绘了在20:1e:t下的肿瘤球状体分析，如在2个独特的供体和2个独立实验中分析的。持续6天在incucyte成像系统上每两小时测量红色目标强度。图10b描绘了在1.25:1、2.5:1、5:1、10:1和20:1e:t下的肿瘤球状体分析，如在2个独特的供体和2个独立实验中分析的。在添加nk细胞后100小时显示红色目标强度。
[0087]
图11描绘了在nk细胞中实现的tgfbr2/cish/tigit的三重基因编辑。
[0088]
图12a和图12b描绘了在体外球状体测定中，在不同效应细胞与靶细胞(e:t)比率下，tgfbr2/cish/tigit三重敲除nk细胞证明了相对于未编辑的对照nk细胞的优越效应子功能。图12a描绘了在20:1e:t下的肿瘤球状体分析。持续6天在incucyte成像系统上每两小时测量红色目标强度。图12b描绘了在5:1、10:1和20:1e:t下的肿瘤球状体分析。在添加nk细胞后100小时显示红色目标强度。
具体实施方式
[0089]
本披露的一些方面提供了可用于工程化“现成”同种异体细胞的策略、组合物和方法，这些同种异体细胞可在临床应用中使用。本披露的一些方面提供了可用于工程化多潜能或多能干细胞(例如，诱导性多潜能干细胞(ipsc)或造血干细胞(hsc)，其可用于衍生分化的子细胞，例如，经修饰的淋巴细胞，如ink细胞)的策略、组合物和方法。免疫反应性(移植物抗宿主和宿主抗移植物两者)对同种异体细胞的临床应用是一项重大挑战。本披露的一些方面提供了用于工程化以下细胞的策略、组合物和方法，这些细胞解决在同种异体环境中未修饰的细胞移植物典型地遇到的免疫反应性的各个方面。
[0090]
本披露的一些方面提供了可用于克服“非自身”宿主抗移植物免疫反应性的策略、组合物和方法，例如，通过除去靶细胞中的mhc i和ii类功能，以进行同种异体临床应用。例如，在一些实施例中，通过实现b2m(i类)和ciita(ii类)和/或两条或更多条mhc ii类α和/或β链的功能丧失来实现mhc i和ii类功能，如本文其他地方更详细描述的。
[0091]
本披露的一些方面提供了可用于克服“缺失自身”宿主抗移植物免疫反应性的策略、组合物和方法，例如，通过将包含编码nk抑制形式的核酸序列的外源表达构建体引入靶细胞中，以进行同种异体临床应用。例如，在一些实施例中，这种“缺失自身”免疫反应性通过实现靶细胞中hla
‑
g、hla
‑
e、和/或cd47的转基因表达以进行同种异体临床应用来解决。
[0092]
本披露的一些方面提供了可用于通过去除内源tcr功能来克服移植物抗宿主t细胞受体(tcr)同种异体反应性的策略、组合物和方法。例如，在一些实施例中，本文提供了可用于从多潜能或多能干细胞产生经修饰的细胞用以同种异体临床应用的策略、组合物和方法，包括工程化这些干细胞以包含本文所述的免疫调节修饰，并且然后将这些干细胞分化为用于施用给有需要的患者的细胞类型，例如分化为淋巴细胞，例如像用于免疫疗法的ink细胞。在一些实施例中，多潜能或多能干细胞衍生自表达tcr或包含重排的tcr基因座的细胞，例如衍生自t细胞，并且在一些此类实施例中，衍生自这种工程化干细胞的分化淋巴细胞可以表达tcr或是tcr同种异体反应性的靶标。在一些此类实施例中，有利的是实现内源tcr表达产物的功能丧失，并且本披露提供了可用于在对应细胞中实现这种功能丧失的策略、组合物和方法，例如，通过实现在本文其他地方更详细描述的trac的功能丧失。
[0093]
本披露的一些方面涉及可用作治疗剂(例如，在免疫肿瘤学的背景下)的经修饰的nk细胞(或其他淋巴细胞)的产生。例如，与非修饰的nk细胞相比，本文提供的至少一些经修饰的nk细胞表现出增强的nk细胞应答特性，例如增强的靶标识别、增强的nk细胞应答水平和/或持续时间、改进的nk细胞存活率、延迟的nk细胞耗尽、增强的靶标识别和/或对典型地不被未修饰的nk细胞识别的靶标的识别。
[0094]
本披露的一些方面提供了用于产生经修饰的nk细胞的组合物、方法和策略。在一些实施例中，通过编辑成熟nk细胞的基因组来产生这种经修饰的nk细胞。在一些实施例中，通过在体外或体内编辑衍生nk细胞的细胞的基因组来产生经修饰的nk细胞。在一些实施例中，衍生nk细胞的细胞是干细胞，例如造血干细胞(hsc)或多潜能干细胞，例如像胚胎干细胞(es细胞)或诱导性多潜能干细胞(ips细胞)。例如，在一些实施例中，通过编辑es细胞、ips细胞或造血干细胞的基因组并随后将经编辑的干细胞分化为nk细胞来产生经修饰的nk细胞。在一些实施例中，在经修饰的nk细胞的产生涉及由ips细胞分化经修饰的nk细胞的情况下，可以在ips细胞的产生、维持或分化期间的任何适合的时间发生基因组的编辑。例如，在将供体细胞重编程为ips细胞的情况下，可以在重编程为ips细胞之前、在重编程程序期间或在供体细胞被重编程为ips细胞之后，使供体细胞(例如体细胞，例如像成纤维细胞或t淋巴细胞)经受本文所述的基因编辑方法。
[0095]
衍生自ips细胞的nk细胞在本文中也称为ink细胞。在一些实施例中，本披露提供了用于产生衍生自发育成熟细胞(也称为体细胞，例如像成纤维细胞或外周血细胞)的ink细胞的组合物、方法和策略。
[0096]
在一些实施例中，本披露提供了用于产生衍生自发育成熟的t细胞(经历过胸腺选择的t细胞)的ink细胞的组合物、方法和策略。发育成熟的t细胞的一个标志是重排的t细胞受体基因座。在t细胞成熟期间，tcr基因座经历v(d)j重排以产生完整的v
‑
结构域外显子。这些重排在将t细胞重编程为诱导性多潜能干(ips)细胞的整个过程中以及在将得到的ips细胞分化为体细胞的整个过程中保留。
[0097]
使用t细胞用于产生ips细胞的一个优点是可以相对容易地编辑t细胞，例如，通过基于crispr的方法或其他基因编辑方法。
[0098]
使用t细胞生成ips细胞的另一个优点是重排的tcr基因座允许对单个细胞及其子细胞进行遗传跟踪。如果重编程、扩增、培养和/或分化策略在nk细胞产生中涉及单个细胞的克隆扩增，则重排的tcr基因座可用作明确地鉴定细胞及其子细胞的遗传标记。这进而允许表征细胞群为真实克隆，或允许鉴定混合群或克隆群中的污染细胞。
[0099]
在产生携带多种编辑的ink细胞时使用t细胞的第三个优点是在t细胞培养物中选择与染色体易位相关的某些核型畸变。当通过crispr技术编辑细胞时，特别是在产生携带多种编辑的细胞时，这种畸变造成了问题。
[0100]
使用t细胞衍生的ips细胞作为衍生治疗性淋巴细胞的起点的第四个优点是，它允许在淋巴细胞中表达预筛选的tcr，例如通过针对特定抗原(例如肿瘤抗原)的结合活性选择t细胞，将所选择的t细胞重编程为ips细胞，然后由这些ips细胞衍生表达tcr的淋巴细胞(例如，t细胞)。该策略还允许在其他细胞类型中激活tcr，例如，通过遗传或表观遗传策略。
[0101]
使用t细胞衍生的ips细胞作为ink分化的起点的第五个优点是，t细胞在整个重编程过程中保留其“表观遗传记忆”的至少一部分，因此随后的相同或密切相关的细胞类型
(如ink细胞)的分化与使用非相关细胞(如成纤维细胞)作为ink衍生的起点的方法相比将更有效和/或得到更高质量的细胞群。定义和缩写
[0102]
除非另外指定，否则以下术语中的每一个具有此章节中阐述的含义。
[0103]
不定冠词“一个”(“a”和“an”)是指至少一个相关名词，并且可与术语“至少一个”和“一个或多个”互换使用。
[0104]
连词“或”和“和/或”可作为非排他析取词互换使用。
[0105]“受试者”意指人类或非人类动物。人受试者可为任何年龄(例如，婴儿、儿童、青年人或成年人)，并且可患有疾病，并且可能实际上具有基因改变或特定基因的组合。可替代地，受试者可为动物，该术语包括但不限于哺乳动物，并且更具体地非人灵长类动物、啮齿类动物(例如小鼠、大鼠、仓鼠等)、兔子、豚鼠、犬、猫等。在本披露的某些实施例中，受试者为家畜，例如牛、马、绵羊或山羊。在某些实施例中，受试者是家禽。
[0106]
术语“治疗(treatment、treat和treating)”是指旨在逆转、减轻、延迟疾病或障碍或如本文所述的一种或多种症状的发作或者抑制进展和/或预防或延迟复发的临床干预。可以在发展一种或多种症状之后和/或诊断出疾病之后向受试者施用例如如本文所述的经修饰的nk细胞或经修饰的nk细胞群的形式的治疗。治疗可以在不存在症状的情况下施用，例如，以预防或延迟症状或者抑制疾病的发作或进展。例如，可以在症状发作之前向易感个体施用治疗(例如，鉴于遗传或其他易感因子)。治疗也可以在症状消退后继续，例如以预防或延迟其复发。
[0107]“预防(prevent/preventing/prevention)”是指预防哺乳动物(例如人类)的疾病，包括：(a)避免或预先排除疾病；(b)影响朝向疾病的倾向；或(c)预防或延迟疾病的至少一种症状的发作。
[0108]
术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”、“核酸序列”和“寡核苷酸”是指dna和rna中的一系列核苷酸碱基(也称为“核苷酸”)，并且意指两个或更多个核苷酸的任何链。多核苷酸、核苷酸序列、核酸等可以是嵌合混合物或其衍生物或经修饰形式，单链或双链。它们可以在碱基部分、糖部分或磷酸骨架处经修饰，例如以改进分子的稳定性、其杂交参数等。核苷酸序列典型地携带遗传信息，包括但不限于细胞器用于制造蛋白质和酶的信息。这些术语包括双链或单链基因组dna、rna、任何合成的和遗传操纵的多核苷酸，以及正义和反义多核苷酸二者。这些术语还包括含有经修饰碱基的核酸。
[0109]
常规iupac表示法用于本文所呈现的核苷酸序列中，如下表1中所示(还参见cornish
‑
bowden a，nucleic acids res.[核酸研究]1985年5月10日；13(9):3021
‑
30，通过引用并入本文)。然而应注意，在序列可能由dna或者rna编码的那些情况下，例如在grna靶向结构域中，“t”表示“胸腺嘧啶或尿嘧啶”。表1：iupac核酸表示法符号碱基a腺嘌呤t胸腺嘧啶或尿嘧啶g鸟嘌呤c胞嘧啶
u尿嘧啶kg或t/uma或cra或gyc或t/usc或gwa或t/ubc、g或t/uva、c或gha、c或t/uda、g或t/una、c、g或t/u
[0110]
术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”可互换使用，是指通过肽键连接在一起的氨基酸的连续链。这些术语包括个别蛋白质、缔合在一起的蛋白质的组或复合物，以及此类蛋白质的片段或部分、变体、衍生物和类似物。肽序列使用常规表示法呈现于本文中，在左侧以氨基或n末端开始，并且前进至右侧的羧基或c末端。可以使用标准单字母或三字母缩写。
[0111]
术语“变体”是指诸如多肽、多核苷酸或小分子的实体，其与参照实体显示出显著的结构同一性，但与参照实体相比，在一个或多个化学部分的存在或水平方面与参照实体在结构上不同。在许多实施例中，变体在功能上也与其参考实体不同。通常，特定实体是否被恰当地视为参照实体的“变体”是基于其与参照实体的结构同一性程度。
[0112]
如本文所用，在核酸(例如，基因、蛋白质编码基因组区域、启动子)的背景下，术语“内源”是指在例如细胞的基因组内其自然位置的天然核酸或蛋白质。相比之下，本文在核酸例如表达构建体、cdna、插缺和核酸载体的背景下所用的术语“外源”是指使用例如基因编辑或基因工程技术(例如基于crispr的编辑技术)已人工引入细胞的基因组中的核酸。
[0113]
术语“rna指导的核酸酶”和“rna指导的核酸酶分子”在本文中可互换使用。在一些实施例中，rna指导的核酸酶是rna指导的dna内切核酸酶。在一些实施例中，rna指导的核酸酶是crispr核酸酶。rna指导的核酸酶的非限制性实例列于下表2中，并且本文披露的方法和组合物可以使用本文披露的或本领域普通技术人员已知的rna指导的核酸酶的任何组合。本领域普通技术人员将知道适用于本披露的背景下的另外的核酸酶和核酸酶变体，并且应该理解本披露在这方面不受限制。表2.rna指导的核酸酶
[0114]
考虑到本披露，另外的适合的rna指导的核酸酶(例如cas9和cas12核酸酶)对于本
领域技术人员将是显而易见的，并且本披露不受本文提供的示例性的适合核酸酶的限制。在一些实施例中，适合的核酸酶是cas9或cpf1(cas12a)核酸酶。在一些实施例中，本披露还包括核酸酶变体，例如cas9或cpf1核酸酶变体。核酸酶变体是指核酸酶，其包含由与核酸酶的野生型氨基酸序列相比的一个或多个氨基酸取代、缺失或添加表征的氨基酸序列。适合的核酸酶和核酸酶变体还可包含纯化标签(例如，多组氨酸标签)和信号肽，例如，包含核定位信号序列或由其组成。在本文其他地方更详细地描述了适合的核酸酶和核酸酶变体的一些非限制性实例，并且还包括于2019年3月14日提交且标题为“用于治疗血红蛋白病的系统和方法”的pct申请pct/us 2019/22374中描述的那些，该申请的全部内容通过引用并入本文。
[0115]
在一些实施例中，rna指导的核酸酶是氨基酸球菌属物种(acidaminococcus sp.)cpf1变体(ascpf1变体)。基于本披露，适合的cpf1核酸酶变体(包括适合的ascpf1变体)对于本领域普通技术人员而言将是已知的或显而易见的，并且包括但不限于本文披露的cpf1变体或本领域已知的其他。例如，在一些实施例中，rna指导的核酸酶是氨基酸球菌属cpf1 rr变体(ascpf1
‑
rr)。在另一个实施例中，rna指导的核酸酶是cpf1 rvr变体。例如，适合的cpf1变体包括具有m537r取代、h800a取代和/或f870l取代或其任何组合(根据ascpf1野生型序列的编号方案)的那些。
[0116]
如本文所用，术语“造血干细胞”或“确定性造血干细胞”是指能够产生成熟髓样和淋巴样细胞类型(包括t细胞、自然杀伤细胞和b细胞)的cd34 干细胞。
[0117]
如本文所用，术语“重编程”或“脱分化”或“增加细胞潜能”或“增加发育潜能”是指增加细胞潜能或将细胞分化为较低分化状态的方法。例如，与非重编程状态的相同细胞相比，具有增加的细胞潜能的细胞具有更多的发育可塑性(即，可以分化为更多细胞类型)。换句话说，重编程细胞是处于比在非重编程状态下相同细胞更低分化状态的细胞。在一些实施例中，术语“重编程”是指将体细胞或多潜能干细胞分化为多潜能干细胞，也称为诱导性多潜能干细胞或ips细胞。用于由体细胞或多能干细胞产生ips细胞的适合方法是本领域技术人员所熟知的。
[0118]
如本文所用，术语“分化”是非特化(“非专能”)或较少特化的细胞获取特化细胞例如血细胞或肌细胞的特征的过程。分化的细胞或分化诱导的细胞是细胞谱系内占据更特化(“专能”)位置的细胞。例如，在用细胞培养基中的适合分化因子处理后，可以将ips细胞分化为各种更高分化的细胞类型，例如神经干细胞或造血干细胞、淋巴细胞、心肌细胞和其他细胞类型。用于将多潜能和多能细胞类型分化为更高分化的细胞类型的适合的方法、分化因子和细胞培养基是本领域技术人员熟知的。当应用于分化过程时，术语“专能”是指在分化路径中行进到如下的点的细胞，其中在正常情况下，它将继续分化为特定的细胞类型或细胞类型的子集，并且在正常情况下，不能分化为不同的细胞类型或恢复到较低分化的细胞类型。
[0119]
如本文所用，术语“分化标记”、“分化标记基因”或“分化基因”是指其表达指示细胞(如多潜能细胞)中发生的细胞分化的基因或蛋白质。分化标记基因包括但不限于以下基因：cd34、cd4、cd8、cd3、cd56(ncam)、cd49、cd45；nk细胞受体(分化簇16(cd16))、自然杀伤组
‑
2成员d(nkg2d)、cd69、nkp30、nkp44、nkp46、cd158b、foxa2、fgf5、sox17、xist、nodal、col3a1、otx2、dusp6、eomes、nr2f2、nr0b1、cxcr4、cyp2b6、gat a3、gata4、erbb4、gata6、
hoxc6、inha、smad6、rora、nipbl、tnfsf11、cdh11、zic4、gal、sox3、pitx2、apoa2、cxcl5、cer1、foxq1、mll5、dpp10、gsc、pcdh10、ctcfl、pcdh20、tshz1、megf10、myc、dkk1、bmp2、lefty2、hes1、cdx2、gnas、egr1、col3a1、tcf4、heph、kdr、tox、foxa1、lck、pcdh7、cd1d foxg1、lefty1、tuj1、t基因(brachyury)、zic1、gata1、gata2、hdac4、hdac5、hdac7、hdac9、notch1、notch2、notch4、pax5、rbpj、runx1、stat1和stat3。
[0120]
如本文所用，术语“分化标记基因谱”或“分化基因谱”、“分化基因表达谱”、“分化基因表达签名”、“分化基因表达面板”、“分化基因面板”或“分化基因签名”是指多种分化标记基因的表达或表达水平。
[0121]
如本文所用，在细胞发育潜力的背景下，术语“潜能”或“发育潜能”是指细胞可得到的所有发育选项的总和(即发育潜能)。细胞潜能的连续体包括但不限于全能细胞、多潜能细胞、多能细胞、寡能细胞、单能细胞和末端分化细胞。
[0122]
如本文所用，术语“多潜能”是指细胞形成所有体或细胞体(即胚体)谱系的能力。例如，胚胎干细胞是一种类型的多潜能干细胞，其能够由三个胚层即外胚层、中胚层和内胚层中每个形成细胞。多潜能性是范围自不能够产生完整生物体的不完全或部分多潜能细胞(例如，上胚层干细胞或episc)至能够产生完整生物体的更原始、更具潜能的细胞(例如，胚胎干细胞或诱导性多潜能干细胞)的发育潜能的连续体。
[0123]
如本文所用，术语“诱导性多潜能干细胞”或ips细胞是指由分化的体细胞(例如成人、新生儿或胎儿细胞)获得的干细胞，通过称为重编程成能够分化为具有所有三个胚层或皮层——中胚层、内胚层和外胚层的组织的细胞的过程。未在自然界中发现ips细胞。
[0124]
如本文所用，术语“胚胎干细胞”是指衍生自胚胎囊胚的内细胞团的多潜能干细胞。胚胎干细胞是多潜能的，并在发育过程中产生三个主要胚层——外胚层、内胚层和中胚层的所有衍生物。它们不会促成额外的胚膜或胎盘，即，不是全能的。
[0125]
如本文所用，术语“多能干细胞”是指具有分化为具有一个或多个胚层(外胚层、中胚层和内胚层，但非全部三个)的细胞的发育潜力的细胞。因此，多能细胞也可以称为“部分分化的细胞”。多能细胞在本领域中是熟知的，并且多能细胞的实例包括成体干细胞，例如像造血干细胞和神经干细胞。“多能”指示细胞可以形成许多类型的给定谱系细胞(而非其他谱系细胞)。例如，多能造血细胞可以形成许多不同类型的血细胞(红细胞、白细胞、血小板等)，但不能形成神经元。因此，术语“多能性”是指发育潜力程度低于全能和多潜能的细胞的状态。
[0126]
可以部分地通过评估细胞的多潜能性特征来确定多潜能性。多潜能性特征包括但不限于：(i)多潜能干细胞形态；(ii)无限自我更新的潜力；(iii)多潜能干细胞标记的表达，这些多潜能干细胞标记包括但不限于ssea1(仅小鼠)、ssea3/4、ssea5、tra1
‑
60/81、tral
‑
85、tra2
‑
54、gctm
‑
2、tg343、tg30、cd9、cd29、cd133/普罗敏蛋白、cd140a、cd56、cd73、cd90、cd105、oct4、nanog、sox2、cd30和/或cd50；(iv)分化为所有三种体细胞谱系(外胚层、中胚层和内胚层)的能力；(v)由三种体细胞谱系组成的畸胎瘤形成；以及(vi)由来自三种体细胞谱系的细胞组成的拟胚体的形成。
[0127]
如本文所用，术语“多潜能干细胞形态”是指胚胎干细胞的经典形态学特征。正常胚胎干细胞形态的特征在于圆形且小的形状(具有高核质比)、明显存在核仁、以及典型的细胞内间隙。
基因组编辑系统
[0128]
本披露涉及经修饰的nk细胞的产生，例如，这些nk细胞的基因组已经修饰，或者其衍生自基因组已经修饰的多能或多潜能干细胞(例如hsc、es细胞或ips细胞)。本文提供的nk细胞和干细胞可以使用本领域普通技术人员已知的任何基因编辑技术来修饰，包括例如通过使用基因组编辑系统，例如crispr。
[0129]
术语“基因组编辑系统”是指具有rna指导的dna编辑活性的任何系统。本披露的基因组编辑系统包括至少两种从天然存在的crispr系统改适的组分：指导rna(grna)和rna指导的核酸酶。这两种组分形成复合物，所述复合物能够与特定核酸序列结合并在所述核酸序列中或其周围编辑dna，例如通过制备一条或多条单链断裂(ssb或切口)、双链断裂(dsb)和/或点突变。
[0130]
天然存在的crispr系统进化性地组织化为两个类别和五种类型(makarova等人,nat rev microbiol[自然微生物学评论].2011年6月；9(6):467
‑
477(makarova)，通过引用并入本文)，并且虽然本披露的基因组编辑系统可改适任一类型或类别的天然存在的crispr系统的组分，但本文所呈现的实施例通常是从2类和ii型或v型crispr系统改适。2类系统涵盖ii型和v型，其特征为相对较大的多结构域rna指导的核酸酶蛋白(例如，cas9或cpf1)以及一个或多个指导rna(例如，crrna和任选地tracrrna)，它们形成核糖核蛋白(rnp)复合物，所述复合物缔合(即，靶向)并裂解与crrna的靶向(或间隔序列)序列互补的特定基因座。根据本披露的基因组编辑系统类似地靶向并编辑细胞dna序列，但与自然界中存在的crispr系统显著不同。例如，本文所述的单分子指导rna在自然界中不存在，并且根据本披露的指导rna和rna指导的核酸酶二者可并入任一数目的非天然存在的修饰。
[0131]
基因组编辑系统可以用多种方式来实施(例如施用或递送至细胞或受试者)，并且不同的实施可适合于不同应用。例如，在某些实施例中，基因组编辑系统是作为蛋白质/rna复合物(核糖核蛋白，或rnp)来实施，其可以包括于药物组合物中，所述药物组合物任选地包括药学上可接受的载体和/或囊封剂，例如脂质或聚合物微粒或纳米颗粒、胶束、脂质体等。在某些实施例中，基因组编辑系统是作为一种或多种编码上述rna指导的核酸酶和指导rna组分的核酸(任选地具有一种或多种其他组分)来实施；在某些实施例中，基因组编辑系统是作为一种或多种包含此类核酸的载体来实施，例如病毒载体，例如腺相关病毒；并且在某些实施例中，基因组编辑系统是作为前述任一种的组合来实施。根据本文所述原理操作的其他或经修改的实施将为技术人员所显而易见并且在本披露的范围内。
[0132]
应注意，本披露的基因组编辑系统可靶向单一特定核苷酸序列，或者可通过使用两个或更多个指导rna靶向(并且能平行编辑)两个或更多个特定核苷酸序列。在本披露通篇中，多种grna的使用称为“多重化”，并且可用于靶向多个无关的目的靶序列，或用于在单一靶结构域内形成多个ssb或dsb，并且在一些情形中，用于在这种靶结构域内产生特定编辑。例如，maeder等人的国际专利公开号wo 2015/138510(maeder)(其是通过引用并入本文)描述用于修正人类cep290基因中的点突变(c.2991 1655a至g)的基因组编辑系统，所述点突变导致产生隐蔽剪接位点，这又降低或消除该基因的功能。maeder的基因组编辑系统利用两个指导rna，这些指导rna靶向该点突变任一侧上的(即，侧接)序列，并且形成侧接该突变的dsb。这又促进了包括突变在内的间插序列的缺失，由此消除隐蔽剪接位点并恢复正常的基因功能。
[0133]
作为另一实例，cotta
‑
ramusino等人的wo 2016/073990(“cotta
‑
ramusino”)(通过引用并入本文)描述利用两个grna与cas9切口酶(制造单链切口的cas9，例如化脓链球菌(s.pyogenes)d10a)的基因组编辑系统，该布置称为“双重切口酶系统”。cotta
‑
ramusino的双重切口酶系统经配置以在目的序列的相对链上制造两个偏移一个或多个核苷酸的切口，所述切口组合产生具有悬突(在cotta
‑
ramusino情形中是5’悬突，但3’悬突也有可能)的双链断裂。在一些情况下，该悬突又可以促进同源定向修复事件。并且作为另一实例，palestrant等人的wo 2015/070083(“palestrant”，通过引用并入本文)描述靶向编码cas9的核苷酸序列的grna(称为“管理rna”)，其可以包括于基因组编辑系统中，所述基因组编辑系统包含一个或多个其他grna以容许cas9的瞬时表达，所述cas9可能原本例如在一些经病毒转导的细胞中是组成型表达的。这些多重化应用旨在具有示例性而不是限制性，并且技术人员将了解，其他多重化应用通常与本文所述的基因组编辑系统相容。
[0134]
在一些情况下，基因组编辑系统可以形成双链断裂，这些双链断裂是通过细胞dna双链断裂机制例如nhej或hdr来修复。这些机制描述于多处文献中，例如davis和maizels,pnas,111(10):e924
‑
932,2014年3月11日(davis)(描述alt
‑
hdr)；frit等人,dna repair[dna修复]17(2014)81
‑
97(frit)(描述alt
‑
nhej)；以及iyama和wilson iii,dna repair[dna修复](amst.)2013年8月；12(8):620
‑
636(iyama)(概括描述经典hdr和nhej路径)。
[0135]
如果基因组编辑系统通过形成dsb来操作，那么此类系统任选地包括促进或有助于特定双链断裂修复模式或特定修复结果的一个或多个组分。例如，cotta
‑
ramusino还描述其中添加单链寡核苷酸“供体模板”的基因组编辑系统；将供体模板并入细胞dna的靶区域中，该靶区域由基因组编辑系统切割，并且可以导致靶序列中的变化。
[0136]
在某些实施例中，基因组编辑系统在不引起单链或双链断裂的情况下修饰靶序列，或修饰靶序列中或附近的基因的表达。例如，基因组编辑系统可包括融合至作用于dna的功能结构域的rna指导的核酸酶，由此修饰靶序列或其表达。作为一个实例，rna指导的核酸酶可连接至(例如融合至)胞苷脱氨酶功能结构域，并且可通过产生所靶向的c至a取代来操作。示例性核酸酶/脱氨酶功能描述于komor等人nature[自然]533,420
‑
424(2016年5月19日)(“komor”)中，所述文献是通过引用并入。可替代地，基因组编辑系统可利用裂解失活的(即，“死”)核酸酶，例如死cas9(dcas9)，并且可通过在细胞dna的一个或多个所靶向区域上形成稳定复合物来操作，由此干扰涉及一个或多个所靶向区的功能，包括但不限于mrna转录、染色质重塑等。指导rna(grna)分子
[0137]
术语“指导rna”和“grna”是指促进rna指导的核酸酶例如cas9或cpf1与靶序列例如细胞中的基因组序列或游离序列特异性结合(或“靶向”)的任何核酸。grna可以是单分子的(包含单个rna分子，也可替代性地称为嵌合分子)，或是模块化的(包含超过一个，且通常包含两个单独的rna分子，例如crrna和tracrrna，它们通常例如通过双链化相互关联)。grna及其组分在整个文献中都有描述，例如在briner等人(molecular cell[分子细胞]56(2),333
‑
339,2014年10月23日(“briner”)，将其通过引用并入本文)和在cotta
‑
ramusino中。
[0138]
在细菌和古细菌中，ii型crispr系统通常包含rna指导的核酸酶蛋白(例如cas9)、包括与外来序列互补的5’区的crispr rna(crrna)和包括与crrna的3’区互补并形成双链
体的5’区的反式激活crrna(tracrrna)。虽然并非旨在受限于任何理论，但认为此双链体有助于形成cas9/grna复合物，并且是所述复合物的活性所需的。在ii型crispr系统经改适用于基因编辑中时，发现crrna和tracrrna可以接合成单一单分子或嵌合指导rna，在一个非限制性实例中借助桥接crrna(在其3’端)和tracrrna(在其5’端)的互补区的四核苷酸(例如gaaa)“四环(tetraloop)”或“接头”序列来接合。(mali等人science[科学].2013年2月15日；339(6121):823
‑
826(“mali”)；jiang等人nat biotechnol[自然生物技术].2013年3月；31(3):233
‑
239(“jiang”)；和jinek等人,2012science[科学]8月17日；337(6096):816
‑
821(“jinek”)，全部通过引用并入本文)。
[0139]
指导rna不论是单分子或模块都包括“靶向结构域”，所述靶向结构域与靶序列内的靶结构域完全或部分互补，所述靶序列例如期望编辑的细胞基因组中的dna序列。靶向域在文献中通过多种名称来提及，包括但不限于“指导序列”(hsu等人,nat biotechnol.[自然生物技术]2013年9月；31(9):827
‑
832(“hsu”)，通过引用并入本文)，“互补性区”(cotta
‑
ramusino)，“间隔区”(briner)，并统称为“crrna”(jiang)。不论给予其何种名称，靶向结构域典型地长度为10
‑
30个核苷酸，并且在某些实施例中长度为16
‑
24个核苷酸(例如，长度为16、17、18、19、20、21、22、23或24个核苷酸)，并且在cas9 grna情形中位于5’末端处或5’末端附近，并且在cpf1 grna情形中位于3’末端处或3’末端附近。
[0140]
除了靶向结构域以外，grna典型地(但不一定，例如，如下文所讨论)包括多个可影响grna/cas9复合物的形成或活性的域。例如，如上文所提及，通过grna的第一和第二互补性结构域形成的双链化结构(也称为重复:抗重复双链体)与cas9的识别(rec)叶相互作用，并且可以介导cas9/grna复合物的形成。(nishimasu等人,cell[细胞]156,935
‑
949,2014年2月27日(“nishimasu 2014”)和nishimasu等人,cell[细胞]162,1113
‑
1126,2015年8月27日(“nishimasu 2015”)，两项都通过引用并入本文)。应注意，第一和/或第二互补性结构域可含有一个或多个多聚腺苷酸段，其可以由rna聚合酶识别为终止信号。因此，第一和第二互补性域的序列任选地经修饰以消除这些段，并促进grna的体外转录的完成，例如通过使用如briner中所述的a
‑
g交换、或通过使用a
‑
u交换来修饰。对第一和第二互补性结构域的这些和其他类似修饰在本披露的范围内。
[0141]
与第一和第二互补性结构域一起，cas9 grna典型地包括两个或更多个其他双链化区域，该两个或更多个另外的双链化区域在体内但不一定在体外参与核酸酶活性。(nishimasu 2015)。在第二互补性结构域的3’部分附近的第一茎环1被不同地称为“近端结构域”(cotta
‑
ramusino)、“茎环1”(nishimasu 2014和2015)以及“连结(nexus)”(briner)。一个或多个其他茎环结构通常存在于grna的3’端附近，其数目依物种而变：化脓链球菌grna典型地包括2个3’茎环(总计4个茎环结构，包括重复:抗重复双链体)，而金黄色葡萄球菌和其他物种仅具有一个(总计3个茎环结构)。对根据物种组织化的保守茎环结构(更通常地，和grna结构)的描述于briner中提供。
[0142]
虽然前述说明集中于用于cas9的grna，但应了解，已经(或可能在未来)发现或发明其他rna指导的核酸酶，其利用在一些方面与针对这一点描述的那些grna不同的grna。例如，cpf1(“来自普雷沃菌属和弗朗西斯菌属1的crispr”)是最近发现的rna指导的核酸酶，其发挥功能不需要tracrrna。(zetsche等人,2015,cell[细胞]163,759
‑
771 2015年10月22日(“zetsche i”)，通过引用并入本文)。用于cpf1基因组编辑系统的grna通常包括靶向结
构域和互补性结构域(替代性地称为“把手”)。还应注意，在用于cpf1的grna中，靶向结构域通常存在于3’端处或附近，而不是如上文结合cas9 grna所述的5’端(把手位于cpf1 grna的5’端处或5’端附近)。
[0143]
本领域技术人员将了解，虽然在来自不同原核物种的grna之间或在cpf1与cas9 grna之间可能存在结构差异，但grna的操作原理通常是一致的。因为这种操作一致性，grna可在广义上通过其靶向结构域序列来定义，并且技术人员将了解，可将给定靶向结构域序列并入任何适宜grna中，包括单分子或嵌合grna，或包括一种或多种化学修饰和/或序列修饰(取代、另外的核苷酸、截短等)的grna。因此，为了便于呈现本披露，grna可仅在其靶向结构域序列方面加以描述。
[0144]
更通常地，技术人员将了解，本披露的一些方面涉及可以使用多种rna指导的核酸酶实施的系统、方法和组合物。为此，除非另外指定，否则术语grna应理解为不仅涵盖那些与cas9或cpf1的特定种类相容的grna，还涵盖可以用于任何rna指导的核酸酶的任何适宜grna。通过说明，在某些实施例中，术语grna可以包括与存在于2类crispr系统(例如ii型或v型或crispr系统)中的任何rna指导的核酸酶或从其衍生或改适的rna指导的核酸酶一起使用的grna。
[0145]
在一些实施例中，与标准grna支架相比，使用的指导rna包含修饰。这种修饰可以包括例如grna的一部分(例如核碱基或骨架部分)的化学修饰。在一些实施例中，这种修饰还可以包括grna内dna核苷酸的存在，例如在靶向结构域的内部或外部。在一些实施例中，修饰可以包括grna支架的延伸，例如，通过在指导rna的3’或5’末端添加1
‑
100个核苷酸，包括rna和/或dna核苷酸，例如在靶向结构域的远端。
[0146]
通常，grna包括糖基核糖，其为具有氧的5元环。示例性的经修饰grna可以包括但不限于核糖中氧的替代(例如，经硫(s)、硒(se)或亚烷基，例如亚甲基或亚乙基)；双键的添加(例如，以用环戊烯基或环己烯基替代核糖)；核糖的缩环(例如，以形成环丁烷或氧杂环丁烷的4元环)；核糖的扩环(例如，以形成具有另外的碳或杂原子的6元环或7元环，例如脱水己糖醇、阿卓糖醇、甘露醇、环己烷基、环己烯基以及吗啉代，其也具有氨基磷酸酯骨架)。尽管大多数的糖类似物改变位于2’位，但其他位点也适于修饰，包括4’位。在某些实施例中，grna包含4
’‑
s、4
’‑
se或4
’‑
c
‑
氨基甲基
‑2’‑
o
‑
me修饰。
[0147]
在某些实施例中，可以将脱氮核苷酸(例如，7
‑
脱氮
‑
腺苷)并入grna中。在某些实施例中，可以将o
‑
烷基化和n
‑
烷基化核苷酸(例如，n6
‑
甲基腺苷)并入grna中。在某些实施例中，grna分子中的一个或多个或所有核苷酸是脱氧核苷酸。
[0148]
在某些实施例中，本文使用的grna可以是经修饰的或未修饰的grna。在某些实施例中，grna可以包括一个或多个修饰。在某些实施例中，一个或多个修饰可包括硫代磷酸酯键修饰、二硫代磷酸酯(ps2)键修饰、2
’‑
o
‑
甲基修饰或其组合。在某些实施例中，一个或多个修饰可以在grna的5’端、在grna的3’端或其组合。
[0149]
在某些实施例中，grna修饰可包含一个或多个二硫代磷酸酯(ps2)键修饰。
[0150]
在一些实施例中，本文使用的grna包括一个或多个或一段脱氧核糖核酸(dna)碱基，在本文中也称为“dna延伸”。在一些实施例中，本文使用的grna在grna的5’端、grna的3’端或其组合处包括dna延伸。在某些实施例中，dna延伸可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、
37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个dna碱基长。例如，在某些实施例中，dna延伸可以是1、2、3、4、5、10、15、20或25个dna碱基长。在某些实施例中，dna延伸可以包括一个或多个选自腺嘌呤(a)、鸟嘌呤(g)、胞嘧啶(c)或胸腺嘧啶(t)的dna碱基。在某些实施例中，dna延伸包括相同的dna碱基。例如，dna延伸可以包括一段腺嘌呤(a)碱基。在某些实施例中，dna延伸可以包括一段胸腺嘧啶(t)碱基。在某些实施例中，dna延伸包括不同dna碱基的组合。在某些实施例中，dna延伸可包含表3所示的序列。在某些实施例中，本文使用的grna包括dna延伸以及一个或多个硫代磷酸酯键修饰、一个或多个二硫代磷酸酯(ps2)键修饰、一个或多个2
’‑
o
‑
甲基修饰或其组合。在某些实施例中，一个或多个修饰可以在grna的5’端、在grna的3’端或其组合。在某些实施例中，包括dna延伸的grna可包含表3所示的包括dna延伸的序列。不希望被理论所束缚，可以预期的是，本文中可以使用任何dna延伸，只要它不与grna靶向的靶核酸杂交并且还相对于不包含此类dna延伸的grna在靶核酸位点处表现出编辑增加。
[0151]
在一些实施例中，本文使用的grna包括一个或多个或一段核糖核酸(rna)碱基，在本文中也称为“rna延伸”。在一些实施例中，本文使用的grna在grna的5’端、grna的3’端或其组合处包括rna延伸。在某些实施例中，rna延伸可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个rna碱基长。例如，在某些实施例中，rna延伸可以是1、2、3、4、5、10、15、20或25个rna碱基长。在某些实施例中，rna延伸可以包括一个或多个选自腺嘌呤(ra)、鸟嘌呤(rg)、胞嘧啶(rc)或尿嘧啶(ru)的rna碱基，其中“r”代表rna，2
’‑
羟基。在某些实施例中，rna延伸包括相同的rna碱基。例如，rna延伸可以包括一段腺嘌呤(ra)碱基。在某些实施例中，rna延伸包括不同rna碱基的组合。在某些实施例中，rna延伸可包含表3所示的序列。在某些实施例中，本文使用的grna包括rna延伸以及一个或多个硫代磷酸酯键修饰、一个或多个二硫代磷酸酯(ps2)键修饰、一个或多个2
’‑
o
‑
甲基修饰或其组合。在某些实施例中，一个或多个修饰可以在grna的5’端、在grna的3’端或其组合。在某些实施例中，包含rna延伸的grna可包括包含rna延伸的在表3中所阐述的序列。在grna的5’端包含rna延伸的grna可包含本文披露的序列。在grna的3’端包含rna延伸的grna可包含本文披露的序列。
[0152]
预期本文中使用的grna也可以包括rna延伸和dna延伸。在某些实施例中，rna延伸和dna延伸两者可以都在grna的5’端、grna的3’端或其组合处。在某些实施例中，rna延伸在grna的5’端，并且dna延伸在grna的3’端。在某些实施例中，rna延伸在grna的3’端，并且dna延伸在grna的5’端。
[0153]
在一些实施例中，包含修饰(例如在5’端的dna延伸)的grna与rna指导的核酸酶(例如，ascpf1核酸酶)复合，以形成rnp，然后将其用于编辑靶细胞，例如nk细胞。
[0154]
下表中提供了用于cpf1指导rna的示例性的适合5’延伸：
[0155]
表3：grna 5’延伸
[0156]
基于本披露，另外的适合grna修饰对本领域普通技术人员而言是显而易见的。适合的grna修饰包括例如以下中描述的那些：2018年10月2日提交且标题为“modified cpf1 guide rna[经修饰的cpf1指导rna]”的pct申请pct/us 2018/054027；2015年12月3日提交且标题为“guide rna with chemical modifications[具有化学修饰的指导rna]”的pct申请pct/us2015/000143；2016年4月5日提交且标题为“chemically modified guide rnas for crispr/cas
‑
mediated gene regulation[关于crispr/cas介导的基因调节的经化学修饰的指导rna]”的pct申请pct/us 2016/026028；以及2016年9月23日提交且标题为“nuclease
‑
mediated genome editing of primary cells and enrichment thereof[原代细胞的核酸酶介导的基因组编辑及其富集]”的pct申请pct/us 2016/053344；其每一项的全部内容通过引用并入本文。grna设计
[0157]
先前已经描述了用于靶序列的选择和验证以及脱靶分析的方法(例如，mali；hsu；fu等人,2014nat biotechnol[自然生物技术]32(3):279
‑
84，heigwer等人,2014nat methods[自然方法]11(2):122
‑
3；bae等人(2014)bioinformatics[生物信息学]30(10):
1473
‑
5；和xiao a等人(2014)bioinformatics[生物信息学]30(8):1180
‑
1182。这些参考文献中的每一篇都是通过引用并入本文。作为非限制性实例，grna设计可包括使用软件工具来优化对应于使用者的靶序列的潜在靶序列的选择，例如以使全基因组的总脱靶活性降至最低。虽然脱靶活性不限于裂解，但每个脱靶序列处的裂解效率可以例如使用实验衍生的加权方案来预测。这些和其他指导选择方法详细描述于maeder和cotta
‑
ramusino中。
[0158]
在某些实施例中，grna分子中的一个或多个或所有核苷酸是经修饰的。在2019年8月8日公开的wo 2019/152519中描述了用于修饰grna的策略，这些的全部内容明确地通过引用并入本文。
[0159]
在本文中提供(例如，在下表中)了适合于本披露包括的某些实施例的指导rna的非限制性实例。本领域普通技术人员将能够以作为dna或rna序列的靶向结构域序列的披露内容设想用于特异性核酸酶(例如cas9或cpf
‑
1核酸酶)的适合的指导rna序列。例如，包含由rna核苷酸组成的靶向序列的指导rna将包含对应于作为dna序列提供的靶向结构域序列的rna序列，并且这含有尿嘧啶，代替胸苷核苷酸。例如，包含由rna核苷酸组成并由dna序列tctgcagaaatgttccccgt(seq id no:__)描述的靶向结构域序列的指导rna将具有相应rna序列ucugcagaaauguuccccgu(seq id no:__)的靶向结构域。如对于本领域技术人员而言显而易见的，这种靶向序列将与适合的指导rna支架(例如，crrna支架序列或嵌合crrna/tracerrna支架序列)连接。适合的grna支架序列是本领域普通技术人员已知的。对于ascpf1，例如，适合的支架序列包含序列uaauuucuacucuuguagau(seq id no:__)，添加到靶向结构域的5’末端。在上文的实例中，这将得到具有序列uaauuucuacucuuguagauucugcagaaauguuccccgu(seq id no:__)的cpf1指导rna。本领域技术人员将进一步了解如何修饰这种指导rna，例如，通过添加dna延伸(例如，在上文的实例中，添加如本文所述的25
‑
mer dna延伸将得到例如具有序列atgtgtttttgtcaaaagaccttttrurararurururcrurarcrurcrururgrurargrarururcrurgrcrargrarararurgrururcrcrcrcrgru(seq id no:__)的指导rna。应当理解，本文提供的示例性靶向序列不是限制性的，并且基于本披露，鉴于本领域的一般知识，另外的适合序列(例如本文所披露的特定序列的变体)对于本领域技术人员而言是显而易见的。
[0160]
在一些实施例中，用于本披露的grna是靶向tigit的grna(tigit grna)。在一些实施例中，靶向tigit的grna是表4中描述的grna中的一种或多种。表4：tigit grna
[0161]
在一些实施例中，用于本披露的grna是靶向adora2a的grna(adora2a grna)。在一些实施例中，靶向adora2a的grna是表5中描述的grna中的一种或多种。表5.adora2a grna
[0162]
在一些实施例中，用于本披露的grna是靶向tgfβr2的grna(tgfβr2 grna)。在一些实施例中，靶向tgfβr2的grna是表6中描述的grna中的一种或多种。表6.tgfbetar2 grna
[0163]
在一些实施例中，用于本披露的grna是靶向cish的grna(cish grna)。在一些实施例中，靶向cish的grna是表7中描述的grna中的一种或多种。表7.cish grna
[0164]
在一些实施例中，用于本披露的grna是靶向b2m的grna(b2m grna)。在一些实施例中，靶向b2m的grna是表8中描述的grna中的一种或多种。表8：b2m grna
[0165]
在一些实施例中，用于本披露的grna是靶向nkg2a的grna(nkg2a grna)。在一些实施例中，靶向nkg2a的grna是表9中描述的grna中的一种或多种。表9：nkg2a grna
[0166]
在一些实施例中，用于本披露的grna是靶向pd1的grna。在一些实施例中，用于本披露的grna是靶向pd1的grna。用于本披露的装饰有b2m和pd1的grna进一步描述于welstead等人(“welstead”)的wo 2015161276和wo 2017152015中；两者均通过引用以其整体并入本文。rna指导的核酸酶
[0167]
根据本披露的rna指导的核酸酶包括但不限于天然存在的2类的crispr核酸酶，如cas9和cpf1，以及由其衍生或获得的其他核酸酶。在功能方面，rna指导的核酸酶被定义为如下的那些核酸酶：(a)与grna相互作用(例如复合)；和(b)与grna一起缔合或任选地切割或修饰dna的靶区域，所述靶区域包括(i)与grna的靶向结构域互补的序列，以及任选地，
(ii)称为“原型间隔子邻近基序”或“pam”的另一序列，其更详细地描述于下文中。在说明以下实例时，rna指导的核酸酶可以在广义上依据其pam特异性和切割活性来定义，即使在共享相同pam特异性或切割活性的个别rna指导的核酸酶之间可能存在变异。技术人员将了解，本披露的一些方面涉及可以使用具有某种pam特异性和/或切割活性的任何适宜rna指导的核酸酶实施的系统、方法和组合物。为此，除非另外指明，否则术语rna指导的核酸酶应理解为通用术语，并不限于rna指导的核酸酶的任何特定类型(例如，cas9与cpf1)、种类(例如，化脓链球菌与金黄色葡萄球菌)或变体(例如，全长与截短或分裂；天然存在的pam特异性与工程化pam特异性等)。
[0168]
pam序列的名称来源于其与“原型间隔子”序列的顺序关系，所述原型间隔子与grna靶向结构域(或“间隔序列”)互补。与原型间隔子一起，pam序列定义特定rna指导的核酸酶/grna组合的靶区域或序列。
[0169]
多种rna指导的核酸酶可能需要pam与原型间隔子之间的不同顺序关系。例如，cas9核酸酶识别原型间隔子3’的pam序列，而。
[0170]
另一方面，cpf1通常识别原型间隔子5’的pam序列。
[0171]
除了识别pam和原型间隔子的特定顺序定向以外，rna指导的核酸酶还可以识别特定pam序列。例如，金黄色葡萄球菌cas9识别nngrrt或nngrrv的pam序列，其中n个残基紧靠由grna靶向结构域所识别区域的3’。化脓链球菌cas9识别ngg pam序列。并且新凶手弗朗西斯菌(f.novicida)cpf1识别ttn pam序列。已鉴定多种rna指导的核酸酶的pam序列，并且鉴定新颖pam序列的策略已描述于shmakov等人,2015,molecular cell[分子细胞]60,385
‑
397，2015年11月5日中。还应注意，工程改造的rna指导的核酸酶可具有与参考分子的pam特异性不同的pam特异性(例如，在工程改造的rna指导的核酸酶的情形中，参考分子可以是衍生出rna指导的核酸酶的天然存在的变体，或与工程改造的rna指导的核酸酶具有最大氨基酸序列同源性的天然存在的变体)。
[0172]
除了其pam特异性以外，rna指导的核酸酶可通过其dna切割活性来表征：天然存在的rna指导的核酸酶典型地在靶核酸中形成dsb，但是已产生仅生成ssb的工程化变体(上文所讨论)(ran和hsu等人,cell[细胞]154(6),1380
‑
1389,2013年9月12日(“ran”)，通过引用并入本文)，或完全不切割的工程化变体。cas9
[0173]
已确定化脓链球菌cas9的晶体结构(jinek 2014)以及与单分子指导rna和靶dna复合的金黄色葡萄球菌cas9的晶体结构(nishimasu 2014；anders 2014；和nishimasu 2015)。
[0174]
天然存在的cas9蛋白包含两个叶：识别(rec)叶和核酸酶(nuc)叶；每一叶包含特定的结构和/或功能域。rec叶包含富精氨酸桥螺旋(bh)结构域，以及至少一个rec结构域(例如rec1结构域和任选地rec2结构域)。rec叶与其他已知蛋白不共享结构相似性，指示其是独特的功能域。不希望受限于任何理论，突变分析提出bh和rec域的特殊功能作用：bh结构域显现在grna:dna识别中发挥作用，而rec结构域被认为与grna的重复:抗重复双链体相互作用并介导cas9/grna复合物的形成。
[0175]
nuc叶包含ruvc结构域、hnh结构域和pam相互作用(pi)结构域。ruvc结构域与逆转录病毒整合酶超家族成员共享结构相似性，并且切割靶核酸的非互补(即底部)链。其可从
biotechnol.[自然生物技术]2015年2月；33(2):139
‑
42(zetsche ii)，通过引用并入)和fine等人(sci rep.[科学报告]2015年7月1日；5:10777(fine)，通过引用并入)所描述。
[0183]
在某些实施例中，rna指导的核酸酶可以是尺寸经优化的或截短的，例如通过一个或多个缺失来进行，所述缺失减小核酸酶的尺寸，同时仍保留grna关联、靶标和pam识别以及切割活性。在某些实施例中，rna指导的核酸酶以共价或非共价方式，任选地通过接头结合至另一多肽、核苷酸或其他结构。示例性结合的核酸酶和接头描述于guilinger等人,nature biotechnology[自然生物技术]32,577
‑
582(2014)中，所述文献出于所有目的通过引用并入本文中。
[0184]
rna指导的核酸酶还任选地包括标签，例如但不限于核定位信号，以促进rna指导的核酸酶蛋白移动至细胞核中。在某些实施例中，rna指导的核酸酶可以并入c末端和/或n末端核定位信号。核定位序列是本领域中已知的并且描述于maeder和其他文献中。
[0185]
前述修饰列表旨在具有示例性，并且技术人员根据本披露将了解，在某些应用中，其他修饰可以是可能的或期望的。因此，为简洁起见，参考特定rna指导的核酸酶呈现本披露的示例性系统、方法和组合物，但应理解，所用rna指导的核酸酶可以不改变其操作原理的方式经修饰。此类修饰在本披露的范围内。
[0186]
示例性的适合核酸酶变体包括但不限于包含m537r取代、h800a取代和/或f870l取代或其任何组合(根据ascpf1野生型序列的编号方案)的ascpf1变体。ascpf1氨基酸序列的其他适合修饰是本领域普通技术人员已知的。下面提供了野生型ascpf1和ascpf1变体的一些示例性序列。
[0187]
his
‑
ascpf1
‑
snls
‑
snls h800a氨基酸序列(seq id no:[xx])
[0188]8][0189]
cpf1变体1氨基酸序列(seq id no：[xx])
[0190]
[0191]
cpf1变体2氨基酸序列(seq id no：[xx])
[0192][0192][0193]
cpf1变体3氨基酸序列(seq id no：1096)
[0194]
[0195]
cpf1变体4氨基酸序列(seq id no：1097)
[0196][0196][0197]
cpf1变体5氨基酸序列(seq id no：1107)
[0198]
[0199]
cpf1变体6氨基酸序列(seq id no：1108)
[0200][0200][0201]
cpf1变体7氨基酸序列(seq id no：[[xx]])
[0202]
[0203]
示例性ascpf1野生型氨基酸序列(seq id no：[[xx]])：
[0204][0204]
编码rna指导的核酸酶的核酸
[0205]
本文提供编码rna指导的核酸酶(例如cas9、cpf1或其功能片段)的核酸。先前已描述编码rna指导的核酸酶的示例性核酸(参见，例如，cong 2013；wang 2013；mali 2013；jinek 2012)。
[0206]
在一些情形中，编码rna指导的核酸酶的核酸可以是合成的核酸序列。例如，合成核酸分子可以经化学修饰。在某些实施例中，编码rna指导的核酸酶的mrna将具有一种或多
种(例如，所有)以下特性：其可以被加帽；多聚腺苷酸化；以及经5
‑
甲基胞苷和/或假尿苷取代。
[0207]
合成的核酸序列也可以经密码子优化，例如，至少一个非常见密码子或较不常见的密码子已经常见密码子替代。例如，合成的核酸可以指导优化的信使mrna的合成(例如，针对在哺乳动物表达系统(例如，本文描述的)中的表达进行优化)。密码子优化的cas9编码序列的实例呈现于cotta
‑
ramusino中。
[0208]
另外，或可替代地，编码rna指导的核酸酶的核酸可包含核定位序列(nls)。核定位序列是本领域中已知的。候选分子的功能分析
[0209]
候选rna指导的核酸酶、grna和其复合物可以通过本领域中已知的标准方法来评估。参见，例如cotta
‑
ramusino。rnp复合物的稳定性可通过差示扫描荧光法来评估，如下文所述。差示扫描荧光法(dsf)
[0210]
包含grna和rna指导的核酸酶的核糖核蛋白(rnp)复合物的热稳定性可以通过dsf来测量。dsf技术测量蛋白质的热稳定性，所述热稳定性可以在有利条件下(如添加结合rna分子，例如grna)增加。
[0211]
dsf测定可以根据任何适合的方案来进行，并且可以用于任何适合的环境中，包括但不限于(a)测试不同条件(例如grna:rna指导的核酸酶蛋白的不同化学计量比，不同缓冲溶液等)以鉴定rnp形成的最佳条件；和(b)测试rna指导的核酸酶和/或grna的修饰(例如，化学修饰、序列改变等)以鉴定改进rnp形成或稳定性的那些修饰。dsf测定的一个读出是rnp复合物的熔融温度的位移；相对高的位移表明，相对于特征为较低位移的参考rnp复合物，rnp复合物更稳定(并且可能因此具有更高活性或更有利的形成动力学、降解动力学或另一功能特征)。在作为筛选工具布置dsf测定时，可指定阈值熔融温度位移，使得输出是熔融温度位移等于或高于阈值的一种或多种rnp。例如，阈值可以是5℃
‑
10℃(例如5
°
、6
°
、7
°
、8
°
、9
°
、10
°
)或更高，并且输出可以是一种或多种特征为熔融温度位移大于或等于所述阈值的rnp。
[0212]
dsf测定条件的两个非限制性实例陈述于下文中：
[0213]
为了确定形成rnp复合物的最佳溶液，将水 10x sypro(生命技术公司(life techonologies)目录号s
‑
6650)中固定浓度(例如，2μm)的cas9分配至384孔板中。然后添加稀释于具有不同ph和盐的溶液中的等摩尔量的grna。在室温下孵育10分钟并短暂离心以移除任何气泡后，使用bio
‑
rad cfx384
tm
real
‑
time system c1000 touch
tm
热循环仪和bio
‑
rad cfx manager软件运行从20℃至90℃的梯度，每10秒温度增加1℃。
[0214]
第二测定由以下步骤组成：在来自上文测定1的最适缓冲液中混合不同浓度的grna与固定浓度(例如2μm)的cas9，并在384孔板中孵育(例如，在室温下10分钟)。添加等体积的最适缓冲液 10x sypro(生命技术公司目录号s
‑
6650)，并且将板用b粘合剂(msb
‑
1001)密封。在短暂离心以移除任何气泡后，使用bio
‑
rad cfx384
tm
real
‑
time system c1000 touch
tm
热循环仪和bio
‑
rad cfx manager软件运行从20℃至90℃的梯度，每10秒温度增加1℃。
基因组编辑策略
[0215]
在本披露的各个实施例中，上述基因组编辑系统用于在细胞内或从细胞获得的dna的靶向区中产生编辑(即改变)。本文描述产生特定编辑的各种策略，并且这些策略通常是在所需修复结果、个别编辑(例如，ssb或dsb)的数目和定位以及此类编辑的靶位点方面加以描述。
[0216]
涉及ssb或dsb的形成的基因组编辑策略是通过修复结果来表征，这些修复结果包括：(a)所靶向区域的全部或部分的缺失；(b)所靶向区域的全部或部分中的插入或其替代；或(c)所靶向区域的全部或部分的中断。此分组并不旨在具有限制性，或结合于任何具体理论或模型，而仅是为了便于呈现而提供。技术人员将了解，所列结果不会相互排斥，并且一些修复可导致其他结果。除非另外指定，否则对特定编辑策略或方法的描述不应理解为需要特定的修复结果。
[0217]
所靶向区域的替代通常涉及用同源序列替代所靶向区域内现有序列的全部或部分，例如通过基因修正或基因转变来进行，两种修复结果是通过hdr路径介导。hdr是通过使用供体模板来促进，所述供体模板可以是单链或双链的，如下文更详细地描述。单链或双链模板可以是外源的，在这种情形中其将促进基因修正，或者所述模板可以是内源的(例如细胞基因组内的同源序列)，以促进基因转变。外源模板可以具有不对称悬突(即，模板中与dsb位点互补的部分可在3’或5’方向上偏移，而不是位于供体模板内的中心)，例如如richardson等人所述(nature biotechnology[自然生物技术]34,339
‑
344(2016)(richardson)，通过引用并入)。在模板为单链的情况下，其可以对应于所靶向区域的互补(顶部)或非互补(底部)链。基因构建体
[0218]
在一些方面，本披露提供了复杂的编辑策略，以及得到的具有复杂的基因组改变的经修饰的细胞，这些复杂的基因组改变允许产生用于临床应用(例如，用于免疫肿瘤学治疗方法)的先进的nk细胞产品。
[0219]
在一些实施例中，基因组改变通过使用一种或多种hdr表达构建体引入。在一些实施例中，基因组改变通过使用一种或多种hdr表达构建体引入。在一些实施例中，一种或多种hdr表达构建体包含一种或多种供体hdr模板。在一些实施例中，一种或多种供体hdr模板包括编码一个或多个cdna的一个或多个表达盒。在一些实施例中，供体hdr模板包含一个表达盒。在一些实施例中，供体hdr模板包含两个表达盒。在一些实施例中，供体hdr模板包含三个表达盒。在一些实施例中，供体hdr模板包含四个表达盒。在一些实施例中，供体hdr模板包含五个表达盒。在一些实施例中，供体hdr模板包含六个表达盒。在一些实施例中，供体hdr模板包含七个表达盒。在一些实施例中，供体hdr模板包含八个表达盒。在一些实施例中，供体hdr模板包含九个表达盒。在一些实施例中，供体hdr模板包含十个表达盒。在一些实施例中，一个或多个表达盒是单顺反子的。在一些实施例中，一个或多个表达盒是双顺反子的。
[0220]
在一些实施例中，一个或多个表达盒包含一个cdna。在一些实施例中，一种或多种表达盒包含两个cdna。在一些实施例中，一种或多种表达盒包含三个cdna。在一些实施例中，一种或多种表达盒包括四个cdna。在一些实施例中，一种或多种表达盒包含五个cdna。在一些实施例中，一种或多种表达盒包含六个cdna。在一些实施例中，一种或多种表达盒包
含七个cdna。在一些实施例中，一种或多种表达盒包括八个cdna。在一些实施例中，一种或多种表达盒包含九个cdna。在一些实施例中，一种或多种表达盒包含十个cdna。在一些实施例中，一种或多种表达盒包含由2a序列分离的一个或多个cdna。在一些实施例中，一种或多种表达盒包含由2a序列分离的两个cdna。在一些实施例中，一种或多种表达盒包含由2a序列分离的三个cdna。
[0221]
在一些实施例中，hdr表达构建体包含由异源启动子驱动的一个或多个cdna。
[0222]
在一些实施例中，一种或多种表达盒包含用于表达表10中列出的一种或多种基因的cdna。
[0223]
在一些实施例中，hdr表达构建体包含用于在靶基因中插入灭活突变的一种或多种供体模板，其中基因产物具有较少或没有功能(部分或全部灭活)。在一些实施例中，hdr表达构建体包含用于在靶基因中插入灭活突变的一种或多种供体模板，其中基因产物没有功能(全部灭活)。
[0224]
在一些实施例中，本披露的经修饰的细胞包含至少一种编码表10中列出的一种或多种基因的cdna的外源核酸构建体。在一些实施例中，本披露的经修饰的细胞包含两种或更多种编码表10中列出的一种或多种基因的cdna的外源核酸构建体的任何组合。在一些实施例中，本披露的经修饰的细胞包含三种或更多种编码表10中列出的一种或多种基因的cdna的外源核酸构建体的任何组合。在一些实施例中，本披露的经修饰的细胞包含四种或更多种编码表10中列出的一种或多种基因的cdna的外源核酸构建体的任何组合。在一些实施例中，本披露的经修饰的细胞包含五种或更多种编码表10中列出的一种或多种基因的cdna的外源核酸构建体的任何组合。在一些实施例中，本披露的经修饰的细胞包含六种或更多种编码表10中列出的一种或多种基因的cdna的外源核酸构建体的任何组合。在一些实施例中，本披露的经修饰的细胞包含七种或更多种编码表10中列出的一种或多种基因的cdna的外源核酸构建体的任何组合。在一些实施例中，本披露的经修饰的细胞包含八种或更多种编码表10中列出的一种或多种基因的cdna的外源核酸构建体的任何组合。在一些实施例中，本披露的经修饰的细胞包含九种或更多种编码表10中列出的一种或多种基因的cdna的外源核酸构建体的任何组合。在一些实施例中，本披露的经修饰的细胞包含十种或更多种编码表10中列出的一种或多种基因的cdna的外源核酸构建体的任何组合。
[0225]
在一些实施例中，本披露的经修饰的nk细胞包含至少一种编码表10中列出的一种或多种基因的cdna的外源核酸构建体。在一些实施例中，本披露的经修饰的细胞包含两种或更多种编码表10中列出的一种或多种基因的cdna的外源核酸构建体的任何组合。在一些实施例中，本披露的经修饰的细胞包含三种或更多种编码表10中列出的一种或多种基因的cdna的外源核酸构建体的任何组合。在一些实施例中，本披露的经修饰的细胞包含四种或更多种编码表10中列出的一种或多种基因的cdna的外源核酸构建体的任何组合。在一些实施例中，本披露的经修饰的细胞包含五种或更多种编码表10中列出的一种或多种基因的cdna的外源核酸构建体的任何组合。在一些实施例中，本披露的经修饰的细胞包含六种或更多种编码表10中列出的一种或多种基因的cdna的外源核酸构建体的任何组合。在一些实施例中，本披露的经修饰的细胞包含七种或更多种编码表10中列出的一种或多种基因的cdna的外源核酸构建体的任何组合。在一些实施例中，本披露的经修饰的细胞包含八种或更多种编码表10中列出的一种或多种基因的cdna的外源核酸构建体的任何组合。在一些实
施例中，本披露的经修饰的细胞包含九种或更多种编码表10中列出的一种或多种基因的cdna的外源核酸构建体的任何组合。在一些实施例中，本披露的经修饰的细胞包含十种或更多种编码表10中列出的一种或多种基因的cdna的外源核酸构建体的任何组合。
[0226]
在一些实施例中，本披露的经修饰的细胞表现出表11中列出的至少一种或多种基因的功能丧失，或其两种或更多种的任何组合。在一些实施例中，本披露的经修饰的细胞表现出表11中列出的至少两种或更多种基因的功能丧失。在一些实施例中，本披露的经修饰的细胞表现出表11中列出的至少三种或更多种基因的功能丧失。在一些实施例中，本披露的经修饰的细胞表现出表11中列出的至少四种或更多种基因的功能丧失。在一些实施例中，本披露的经修饰的细胞表现出表11中列出的至少五种或更多种基因的功能丧失。在一些实施例中，本披露的经修饰的细胞表现出表11中列出的至少六种或更多种基因的功能丧失。在一些实施例中，本披露的经修饰的细胞表现出表11中列出的至少七种或更多种基因的功能丧失。在一些实施例中，本披露的经修饰的细胞表现出表11中列出的至少八种或更多种基因的功能丧失。在一些实施例中，本披露的经修饰的细胞表现出表11中列出的至少九种或更多种基因的功能丧失。在一些实施例中，本披露的经修饰的细胞表现出表11中列出的至少十种或更多种基因的功能丧失。
[0227]
在一些实施例中，本披露的经修饰的nk细胞表现出表11中列出的至少一种或多种基因的功能丧失，或其两种或更多种的任何组合。在一些实施例中，本披露的经修饰的细胞表现出表11中列出的至少两种或更多种基因的功能丧失。在一些实施例中，本披露的经修饰的细胞表现出表11中列出的至少三种或更多种基因的功能丧失。在一些实施例中，本披露的经修饰的细胞表现出表11中列出的至少四种或更多种基因的功能丧失。在一些实施例中，本披露的经修饰的细胞表现出表11中列出的至少五种或更多种基因的功能丧失。在一些实施例中，本披露的经修饰的细胞表现出表11中列出的至少六种或更多种基因的功能丧失。在一些实施例中，本披露的经修饰的细胞表现出表11中列出的至少七种或更多种基因的功能丧失。在一些实施例中，本披露的经修饰的细胞表现出表11中列出的至少八种或更多种基因的功能丧失。在一些实施例中，本披露的经修饰的细胞表现出表11中列出的至少九种或更多种基因的功能丧失。在一些实施例中，本披露的经修饰的细胞表现出表11中列出的至少十种或更多种基因的功能丧失。
[0228]
在一些实施例中，本披露的经修饰的细胞包含至少一种编码表10中列出的一种或多种基因的cdna的外源核酸构建体，并且表现出表11中列出的至少一种基因的功能丧失。在一些实施例中，本披露的经修饰的细胞包含两种或更多种编码表10中列出的一种或多种基因和表11中列出的至少一种基因的cdna的外源核酸构建体的任何组合。在一些实施例中，本披露的经修饰的细胞包含至少一种编码表10中列出的一种或多种基因的cdna的外源核酸构建体和表11中列出的两种或更多种基因的功能丧失。在一些实施例中，本披露的经修饰的细胞包含两种或更多种编码表10中列出的一种或多种基因的cdna的外源核酸构建体和表11中列出的两种或更多种基因的功能丧失。
[0229]
在一些情形中，通过在所靶向区域中或周围形成一个或多个切口来促进基因转变和基因修正，如在ran和cotta
‑
ramusino中所述。在一些情形中，双重切口酶策略用于形成两个偏移ssb，其又形成具有悬突(例如5’悬突)的单一dsb。
[0230]
所靶向序列的全部或部分的中断和/或缺失可通过多种修复结果来实现。作为一
个实例，可通过同时产生两个或更多个侧接所靶向区域的dsb使序列缺失，然后在修复dsb时切除所述所靶向区域，如在maeder中针对lca10突变所述。作为另一实例，可在修复前通过以下方式产生的缺失来中断序列：形成具有单链悬突的双链断裂，之后对悬突进行核酸外切加工。
[0231]
靶序列中断的一个特定子集是通过在所靶向序列内形成插缺来介导，其中修复结果典型地是通过nhej路径(包括alt
‑
nhej)来介导。nhej由于其与插缺突变的关联而称为“错误倾向”修复路径。然而，在一些情形中，dsb是通过nhej修复，并且不改变其周围的序列(所谓的“完美”或“无瘢痕”修复)；这通常需要dsb的两端完美连接。同时，插缺被认为是从dna游离端在连接前的酶加工产生，其在一个或两个游离端的一条或两条链中添加和/或移除核苷酸。
[0232]
由于游离dsb端的酶加工可具有随机性，插缺突变往往是可变的，沿分布发生，并且可能受到多种因素影响，包括特定靶位点、所用细胞类型、所用基因组编辑策略等。即使如此，有可能引起关于插缺形成的有限泛化：通过修复单一dsb形成的缺失最常在1
‑
50bp范围内，但是可能达到大于100
‑
200bp。通过修复单一dsb形成的插入往往较短，并且常包括紧密围绕断裂位点的序列的短重复。然而，有可能获得大的插入，并且在这些情形中，插入的序列通常已经被追溯至基因组的其他区域或追溯至存在于细胞中的质粒dna。
[0233]
插缺突变和经配置以产生插缺的基因组编辑系统可用于例如在不需要产生特定的最终序列时和/或在可耐受移码突变的情况下中断靶序列。其还可以用于偏好特定序列的环境中，只要某些所需序列往往优先通过给定位点处的ssb或dsb的修复而发生即可。插缺突变还是可用于评估或筛选特定基因组编辑系统和其组分的活性的工具。在这些和其他环境中，插缺可以通过以下各项来表征：(a)其在与基因组编辑系统接触的细胞的基因组中的相对和绝对频率，和(b)相对于未编辑序列的数值差异的分布，例如
±
1、
±
2、
±
3等。作为一个实例，在先导发现(lead
‑
finding)环境中，可基于在受控条件下的插缺读出筛选多种grna，以鉴定最有效驱动靶位点处的切割的那些grna。可以选择以阈值频率或以高于阈值的频率产生插缺或产生插缺的特定分布的指导以供进一步研究和开发。插缺频率和分布还可以用作读出，用于评估不同的基因组编辑系统实施或配置和递送方法，例如通过保持grna不变并改变某些其他反应条件或递送方法。多重策略
[0234]
虽然上文讨论的示例性策略集中于通过单一dsb介导的修复结果，但根据本披露的基因组编辑系统还可用于产生在相同基因座中或在不同基因座中的两个或更多个dsb。涉及形成多个dsb或ssb的编辑策略描述于例如cotta
‑
ramusino中。在一些实施例中，在nk细胞或衍生nk细胞的细胞的基因组中进行多种编辑的情况下，这些编辑在同一时间或密切接近的时间进行。在一些此类实施例中，通过两种或更多种不同的rna指导的核酸酶实现两种或更多种基因组编辑。例如，这些基因组编辑中的一种可以通过sacas9(结合对应的sacas9指导rna)来实现，并且可以通过cpf1(结合对应的cpf1指导rna)来实现不同的基因组编辑。在一些实施例中，在多重基因组编辑方法的背景下，与使用相同的rna指导的核酸酶进行两种或更多种编辑相比，使用不同的rna指导的核酸酶是有利的，例如，它允许降低不希望的影响(例如像脱靶切割)的可能性或频率，以及基因组易位的发生。供体模板设计
[0235]
供体模板设计详细描述于文献中，例如cotta
‑
ramusino中。dna寡聚体供体模板(寡脱氧核苷酸或odn)可以是单链(ssodn)或双链(dsodn)的，可以用于促进基于hdr的dsb修复，并且尤其可用于将改变引入靶dna序列中、将新序列插入靶序列中、或完全替代靶序列。
[0236]
不论是单链或双链，供体模板通常包括与待裂解的靶序列内或附近(例如，侧接或邻近)的dna区域同源的区域。这些同源区域在本文中称作“同源臂”，并且示意性地示于下文中：[5’同源臂]
‑
[替代序列]
‑
[3’同源臂]。
[0237]
同源臂可具有任何适宜长度(如果仅使用一个同源臂，包括0个核苷酸)，并且3’和5’同源臂可以具有相同长度或可以具有不同长度。适当同源臂长度的选择可能受到多种因素影响，例如对避免与某些序列(例如alu重复序列或其他极为常见的元件)的同源性或微同源性的期望。例如，可以缩短5’同源臂以避免序列重复元件。在其他实施例中，可以缩短3’同源臂以避免序列重复元件。在一些实施例中，可以同时缩短5’和3’同源臂以避免包括某些序列重复元件。另外，一些同源臂设计可以改进编辑效率或增加所需修复结果的频率。例如，richardson等人(nature biotechnology[自然生物技术]34,339
‑
344(2016)(richardson)，通过引用并入)发现，单链供体模板的3’和5’同源臂的相对不对称性影响修复率和/或结果。
[0238]
供体模板中的替代序列已描述于其他文献(包括cotta
‑
ramusino等人)中。替代序列可以是任何适宜长度(如果所需修复结果是缺失，那么包括0个核苷酸)，并且相对于需要编辑的细胞内的天然存在的序列，典型地包括1、2、3或更多个序列修饰。一种常见序列修饰涉及改变天然存在的序列以修复突变，所述突变与需要治疗的疾病或病症相关。另一常见序列修饰涉及改变一个或多个序列，所述序列与rna指导的核酸酶的pam序列或用于产生ssb或dsb的一个或多个grna的靶向结构域互补或编码所述pam序列或靶向结构域，以在将替代序列并入靶位点中之后减少或消除靶位点的重复裂解。
[0239]
如果使用线性ssodn，其可以经配置以(i)退火至靶核酸的带切口链，(ii)退火至靶核酸的完整链，(iii)退火至靶核酸的正链，和/或(iv)退火至靶核酸的负链。ssodn可具有任何适合的长度，例如约、至少或不超过150
‑
200个核苷酸(例如，150、160、170、180、190或200个核苷酸)。
[0240]
应注意，模板核酸也可以是核酸载体，例如病毒基因组或环状双链dna，例如质粒。包含供体模板的核酸载体可以包括其他编码或非编码元件。例如，模板核酸可以作为病毒基因组的部分来递送(例如在aav或慢病毒基因组中)，其包括某些基因组骨架元件(例如在aav基因组情形中，末端反向重复序列)并且任选地包括编码grna和/或rna指导的核酸酶的另外的序列。在某些实施例中，供体模板可以邻近或侧接由一种或多种grna识别的靶位点，以促进在供体模板的一端或两端上形成游离dsb，所述供体模板可以参与使用相同grna修复在细胞dna中形成的相应ssb或dsb。适合用作供体模板的示例性核酸载体描述于cotta
‑
ramusino中。
[0241]
不论使用何种形式，模板核酸都可以设计为避免不期望的序列。在某些实施例中，可以缩短一个或两个同源臂以避免与某些序列重复元件(例如，alu重复、line元件等)重叠。
中靶基因编辑的定量测量
[0242]
应当注意，本披露的基因组编辑系统允许检测和定量测量中靶基因编辑结果，包括靶向整合。本文所述的组合物和方法可以依赖于包含5’同源臂、负荷物、一个或多个引发位点、3’同源臂和任选地填充序列的供体模板的使用。例如，通过引用以其整体并入本文的ramusino等人(ramusino)的国际专利公开号wo2019/014564描述了通过将与存在于靶向基因组dna基因座(即靶核酸)的引发位点基本相同的一个或多个引物结合位点(即，引发位点)嵌入供体模板来定量分析中靶基因编辑结果(包括靶向整合事件)的组合物和方法。将引发位点嵌入供体模板中，使得当发生供体模板与靶核酸的同源重组时，供体模板的成功靶向整合将来自供体模板的引发位点整合到靶核酸中，使得至少可以产生一个扩增子，以便定量地确定中靶编辑结果。
[0243]
在一些实施例中，靶核酸包含第一引发位点(p1)和第二引发位点(p2)，并且供体模板包含负荷序列、第一引发位点(p1’)、和第二引发位点(p2’)，其中p2’位于负荷序列的5’，其中p1’位于负荷序列的3’(即，a1
‑‑
p2
’‑‑
n
‑‑
p1
’‑‑
a2)，其中p1’基本上与p1相同，并且其中p2’基本上与p2相同。在准确的同源驱动的靶向整合之后，用两个寡核苷酸引物使用单pcr反应产生三个扩增子。从最初存在于基因组dna中的引物结合位点(p1和p2)产生第一扩增子，扩增子x，并且可以进行测序，以分析未导致靶向整合的中靶编辑事件(例如，插入、缺失、基因转变)。在同源驱动的靶向整合之后，剩余的两个扩增子被映射到5’和3’连接。第二扩增子，扩增子y，产生自靶核酸处靶向整合事件后p1和p2’之间的核酸序列扩增，从而扩增5’连接。第三扩增子，扩增子z，产生自靶核酸处靶向整合事件后p1’和p2之间的核酸序列扩增，从而扩增3’连接。除关于靶向整合的保真性的信息之外，这些扩增子的测序还提供了对靶核酸处的靶向整合的定量评估。为避免扩增子尺寸固有的任何偏差，可以任选地在供体模板中包含填充序列以保持所有三个预期的扩增子长度相同。基因组编辑系统的实施：递送、配制和施用途径
[0244]
如上文所讨论的，本披露的基因组编辑系统可以用任何适宜方式来实施，意味着此类系统的组分(包括但不限于rna指导的核酸酶、grna和可选供体模板核酸)可以用任何适宜形式或形式的组合来递送、配制或施用，从而在细胞、组织或受试者中导致基因组编辑系统的转导、表达或引入和/或引起所需的修复结果。根据本披露的基因组编辑系统可以并入多种grna、多种rna指导的核酸酶以及其他组分，例如蛋白质，并且基于本披露的系统中所示的原理，多种实施将为技术人员所了解。在一些实施例中，本披露的基因组编辑系统作为核糖核蛋白(rnp)复合物递送到细胞中。在一些实施例中，一种或多种rnp复合物以任何顺序依次或同时递送到细胞中。
[0245]
可以通过本领域已知的方法或如本文所述将编码根据本披露的基因组编辑系统的各种元件的核酸施用给受试者或递送至细胞。例如，可以通过例如载体(例如，病毒或非病毒载体)、非载体基方法(例如，使用裸dna或dna复合物)或其组合递送编码rna指导的核酸酶的dna和/或编码grna的dna、以及供体模板核酸。在一些实施例中，本披露的基因组编辑系统由aav递送。
[0246]
编码基因组编辑系统或其组分的核酸可以作为裸dna或rna直接递送至细胞，例如借助转染或电穿孔来递送，或者可以缀合至促进靶细胞(例如，红血球、hsc)摄取的分子(例如，n
‑
乙酰半乳糖胺)。在一些实施例中，本披露的基因组编辑系统通过电穿孔递送到细胞
中。
[0247]
改进细胞疗法过程的一个有希望的解决方案包括将活性蛋白直接递送到人细胞中。蛋白质递送剂feldan shuttle是一种基于蛋白质的递送剂，其专为细胞疗法设计(del’guidice等人,plos one[公共科学图书馆
·
综合].2018年4月4日；13(4):e0195558；通过引用以其整体并入本文)。在一些实施例中，本披露的基因组编辑系统通过feldan shuttle递送到细胞中。
[0248]
本披露的经修饰的细胞可以通过在提交本技术时本领域中已知的任何已知施用途径施用。在一些实施例中，本披露的经修饰的细胞是静脉内(iv)施用的。在一些实施例中，本披露的经修饰的nk细胞是静脉内(iv)施用的。
[0249]
如本文所用，“剂量”是指持续给定时间施用给受试者的药理活性材料的特定量。除非另有说明，否则叙述的剂量是指具有复杂基因组改变的nk细胞，其允许产生用于临床应用的先进的nk细胞产品。在一些实施例中，经修饰的nk细胞的剂量是指经修饰的nk细胞的有效量。例如，在一些实施例中，经修饰的nk细胞的剂量或有效量是指每剂量约1x109‑
5x109个经修饰的nk细胞或约2x109‑
5x109个经修饰的nk细胞。在一些实施例中，经修饰的nk细胞的剂量或有效量是指每剂量约3x109‑
5x109个经修饰的nk细胞或约4x109‑
5x109个经修饰的nk细胞。经修饰的ink细胞的产生
[0250]
本披露的一些方面涉及衍生自干细胞(例如多能细胞例如像hsc，或多潜能干细胞例如像es细胞或ips细胞)的经遗传修饰的nk细胞的产生。在一些实施例中，在经遗传修饰的ink细胞衍生自ips细胞的情况下，ips细胞衍生自体细胞供体细胞。在一些实施例中，在经遗传修饰的ink细胞衍生自ips细胞的情况下，ips细胞衍生自多能供体细胞，例如hsc。
[0251]
最终ink细胞中存在的基因组编辑可以在将供体细胞重编程为ips细胞状态的过程的任何阶段、在ips细胞状态期间、和/或在将ips细胞分化为ink状态的过程的任何阶段(例如中间状态，例如像ips细胞衍生的hsc状态，或甚至直到或在最终ink细胞状态)进行。在一些实施例中，本文提供的经修饰的ink细胞中存在的一种或多种基因组编辑在将供体细胞重编程为ips细胞状态之前进行。在一些实施例中，本文提供的经修饰的ink细胞中存在的所有编辑都是在重编程/分化过程中的同时、密切接近的时间、和/或相同细胞阶段(例如在供体细胞阶段、重编程过程期间、ips细胞阶段或在分化过程期间)进行的。在一些实施例中，本文提供的经修饰的ink细胞中存在的两种或更多种编辑在重编程/分化过程的不同时间和/或不同细胞阶段进行的。例如，在一些实施例中，在供体细胞阶段进行一种编辑，并且在ips细胞阶段进行不同的编辑；在一些实施例中，在重编程阶段进行一种编辑，并且在ips细胞阶段进行不同的编辑。这些实例是提供来说明本文提供的一些策略，并且不是限制性的。
[0252]
多种细胞类型可以用作供体细胞，该供体细胞可以经受本文提供的用于衍生经修饰的ink细胞的重编程、分化和基因组编辑策略。将要经受本文提供的重编程、分化和基因组编辑策略的供体细胞可以是任何适合的细胞类型。例如，供体细胞可以是多潜能干细胞或分化的细胞，例如体细胞，例如像成纤维细胞或t淋巴细胞。
[0253]
在一些实施例中，供体细胞是人类细胞。在一些实施例中，供体细胞是非人灵长类动物细胞。在一些实施例中，供体细胞是哺乳动物细胞。在一些实施例中，供体细胞是体细
胞。在一些实施例中，供体细胞是干细胞或祖细胞。在某些实施例中，供体细胞不是人胚胎的一部分，并且其衍生不涉及破坏人胚胎。
[0254]
在一些实施例中，本文提供了ink细胞和衍生这种ink细胞的方法，这些ink细胞具有一种或多种基因组改变(例如，对于免疫肿瘤学治疗方法而言不希望的基因的敲除，和/或外源核酸的敲入，例如编码对于免疫肿瘤学治疗方法而言希望的基因产物的表达构建体)。在一些实施例中，ink细胞衍生自ips细胞，其又衍生自体细胞供体细胞。任何适合的体细胞都可用于产生ips细胞，然后其又产生ink细胞。已经描述了从各种体细胞供体细胞类型衍生ips细胞并且本领域已知的适合策略。在一些实施例中，体细胞供体细胞是成纤维细胞。在一些实施例中，体细胞供体细胞是成熟t细胞。
[0255]
例如，在一些实施例中，衍生ips细胞和随后衍生ink细胞的体细胞供体细胞是发育成熟的t细胞(经历过胸腺选择的t细胞)。发育成熟的t细胞的一个标志是重排的t细胞受体基因座。在t细胞成熟期间，tcr基因座经历v(d)j重排以产生完整的v
‑
结构域外显子。这些重排在将t细胞重编程为诱导性多潜能干(ips)细胞的整个过程中以及在将得到的ips细胞分化为体细胞的整个过程中保留。
[0256]
在某些实施例中，供体体细胞是cd8
t细胞，cd8
天然t细胞、cd4
中枢记忆t细胞、cd8
中枢记忆t细胞、cd4
效应记忆t细胞、cd4
效应记忆t细胞、cd4
t细胞、cd4
干细胞记忆t细胞、cd8
干细胞记忆t细胞、cd4
辅助t细胞、调节性t细胞、细胞毒性t细胞、自然杀伤t细胞、cd4 幼稚t细胞、th17 cd4
t细胞、th1 cd4
t细胞、th2 cd4
t细胞、th9 cd4
t细胞、cd4
foxp3
t细胞、cd4
cd25
cd127
‑
t细胞或cd4
cd25
cd127
‑
foxp3
t细胞。
[0257]
使用t细胞用于产生ips细胞的一个优点是可以相对容易地编辑t细胞，例如，通过基于crispr的方法或其他基因编辑方法。使用t细胞生成ips细胞的另一个优点是重排的tcr基因座允许对单个细胞及其子细胞进行遗传跟踪。如果重编程、扩增、培养和/或分化策略在nk细胞产生中涉及单个细胞的克隆扩增，则重排的tcr基因座可用作明确地鉴定细胞及其子细胞的遗传标记。这进而允许表征细胞群为真实克隆，或允许鉴定混合群或克隆群中的污染细胞。
[0258]
在产生携带多种编辑的ink细胞时使用t细胞的第三个优点是在t细胞培养物中选择与染色体易位相关的某些核型畸变。当通过crispr技术编辑细胞时，特别是在产生携带多种编辑的细胞时，这种畸变造成了问题。
[0259]
使用t细胞衍生的ips细胞作为衍生治疗性淋巴细胞的起点的第四个优点是，它允许在淋巴细胞中表达预筛选的tcr，例如通过针对特定抗原(例如肿瘤抗原)的结合活性选择t细胞，将所选择的t细胞重编程为ips细胞，然后由这些ips细胞衍生表达tcr的淋巴细胞(例如，t细胞)。该策略还允许在其他细胞类型中激活tcr，例如，通过遗传或表观遗传策略。
[0260]
使用t细胞衍生的ips细胞作为ink分化的起点的第五个优点是，t细胞在整个重编程过程中保留其“表观遗传记忆”的至少一部分，因此随后的相同或密切相关的细胞类型(如ink细胞)的分化与使用非相关细胞(如成纤维细胞)作为ink衍生的起点的方法相比将更有效和/或得到更高质量的细胞群。
[0261]
在某些实施例中，正操纵的供体细胞，例如正进行重编程的细胞和/或正对基因组进行编辑的细胞，是长期造血干细胞、短期造血干细胞、多能祖细胞、谱系限制性祖细胞、淋巴样祖细胞、髓样祖细胞、普通髓样祖细胞、红系祖细胞、巨核细胞红系祖细胞、视网膜细
胞、感光细胞、视杆细胞、视锥细胞、视网膜色素上皮细胞、小梁细胞、耳蜗毛细胞、外毛细胞、内毛细胞、肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞、肺上皮祖细胞、横纹肌细胞、心肌细胞、肌卫星细胞、神经元、神经元干细胞、间充质干细胞、诱导性多潜能干细胞(ips)、胚胎干细胞、成纤维细胞、单核细胞源性巨噬细胞或树突细胞、巨核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、网织红细胞、b细胞例如祖b细胞(progenitor b cell)、前b细胞、祖b细胞(pro b cell)、记忆b细胞、血浆b细胞、胃肠上皮细胞、胆管上皮细胞、胰腺导管上皮细胞、肠干细胞、肝细胞、肝星形细胞、库普弗细胞、成骨细胞、破骨细胞、脂肪细胞、前脂肪细胞、胰岛细胞(例如，β细胞、α细胞、δ细胞)、胰腺外分泌细胞、施旺细胞或少突胶质细胞。
[0262]
在某些实施例中，供体细胞是循环血细胞，例如，网织红细胞、巨核细胞红系祖细胞(mep)、髓样祖细胞(cmp/gmp)、淋巴样祖细胞(lp)、造血干细胞/祖细胞(hsc)、或内皮细胞(ec)。在某些实施例中，供体细胞是骨髓细胞(例如，网织红细胞、红系细胞(例如，成红细胞)、mep细胞、髓样祖细胞(cmp/gmp)、lp细胞、红系祖细胞(ep)、hsc、多能祖细胞(mpp)、内皮细胞(ec)、生血内皮(he)细胞、或间充质干细胞)。在某些实施例中，供体细胞是髓样祖细胞(例如，普通髓样祖细胞(cmp)或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子祖细胞(gmp))。在某些实施例中，供体细胞是淋巴样祖细胞，例如，淋巴共同祖细胞(clp)。在某些实施例中，供体细胞是红系祖细胞(例如，mep细胞)。在某些实施例中，供体细胞是造血干细胞/祖细胞(例如，长期hsc(lt
‑
hsc)、短期hsc(st
‑
hsc)、mpp细胞、或谱系限制性祖细胞(lrp))。在某些实施例中，供体细胞是cd34
细胞、cd34
cd90
细胞、cd34
cd38
‑
细胞、cd34
cd90
cd49f
cd38
‑
cd45ra
‑
细胞、cd105
细胞、cd31
、或cd133
细胞、或cd34
cd90
cd133
细胞。在某些实施例中，供体细胞是脐血cd34
hspc、脐带静脉内皮细胞、脐带动脉内皮细胞、羊水cd34
细胞、羊水内皮细胞、胎盘内皮细胞或胎盘造血cd34
细胞。在某些实施例中，供体细胞是动员的外周血造血cd34
细胞(在患者用动员剂例如，g
‑
csf或普乐沙福(plerixafor)治疗之后)。在某些实施例中，供体细胞是外周血内皮细胞。
[0263]
在一些实施例中，供体细胞是分裂细胞。在其他实施例中，供体细胞是非分裂细胞。
[0264]
在一些实施例中，将由本文提供的重编程、分化和编辑的方法和策略产生的经修饰ink细胞施用给有需要的受试者，例如，在免疫肿瘤学治疗方法的背景下。在一些实施例中，可以使用本领域已知的任何适合的方法，将供体细胞或本文提供的重编程、分化和编辑策略的任何阶段的细胞维持在培养基中或储存(例如，在液氮中)，例如，用于后续表征或施用给有需要的受试者。细胞重编程
[0265]
与非重编程状态的相同细胞相比，具有增加的细胞潜能的细胞具有更多的发育可塑性(即，可以分化为更多细胞类型)。换句话说，重编程细胞是处于比在非重编程状态下相同细胞更低分化状态的细胞。
[0266]
可以通过利用几种方法进行本披露的细胞的重编程。用于重编程本披露的体细胞的一些方法的实例描述于(但不限于)特此通过引用以其整体并入的valamehr等人,wo 2017/078807(“valamehr”)和mendlein等人wo 2010/108126(“mendlein”)。
[0267]
简而言之，用于使多潜能干细胞的分化指向确定性造血谱系的细胞的方法可包
括：(i)使多潜能干细胞与包含bmp激活剂和任选地bfgf的组合物接触，以启动由多潜能干细胞分化和扩增中胚层细胞；(ii)使这些中胚层细胞与包含bmp激活剂、bfgf和gsk3抑制剂的组合物接触，其中该组合物任选地不含tgfβ受体/alk抑制剂，以启动由这些中胚层细胞分化和扩增具有确定性he潜力的中胚层细胞；(iii)使这些具有确定性he潜力的中胚层细胞与以下的组合物接触，该组合物包含rock抑制剂；选自由bfgf、vegf、scf、igf、epo、il6和il11组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子；以及任选地wnt路径激活剂，其中该组合物任选地不含tgfβ受体/alk抑制剂，以启动由具有确定性生血内皮潜力的多潜能干细胞衍生的中胚层细胞分化和扩增确定性生血内皮；以及任选地使多潜能干细胞、多潜能干细胞衍生的中胚层细胞、具有生血内皮的中胚层细胞、和/或确定性生血内皮经受约2％至约10％之间的低氧张力。
[0268]
在用于使多潜能干细胞的分化指向确定性造血谱系的细胞的方法的一些实施例中，该方法进一步包括使多潜能干细胞与包含mek抑制剂、gsk3抑制剂和rock抑制剂的组合物接触，其中该组合物不含tgfβ受体/alk抑制剂，以接种和扩增多潜能干细胞。在一些实施例中，多潜能干细胞是ipsc。在一些实施例中，ipsc是幼稚ipsc。在一些实施例中，ipsc包含一种或多种遗传印记，并且其中包含在ipsc中的一种或多种遗传印记被保留在由其分化的多潜能干细胞衍生的造血细胞中。
[0269]
在用于使多潜能干细胞的分化指向确定性造血谱系的细胞的方法的一些实施例中，多潜能干细胞分化为造血谱系的细胞没有产生拟胚体，并且是单层培养形式。
[0270]
在上述方法的一些实施例中，所获得的多潜能干细胞衍生的确定性生血内皮细胞是cd34 。在一些实施例中，所获得的确定性生血内皮细胞是cd34 cd43
‑
。在一些实施例中，确定性生血内皮细胞是cd34 cd43
‑
cxcr4
‑
cd73
‑
。在一些实施例中，确定性生血内皮细胞是cd34 cxcr4
‑
cd73
‑
。在一些实施例中，确定性生血内皮细胞是cd34 cd43
‑
cd93
‑
。在一些实施例中，确定性生血内皮细胞是cd34 cd93
‑
。
[0271]
在上述方法的一些实施例中，该方法进一步包括(i)使多潜能干细胞衍生的确定性生血内皮与以下的组合物接触，该组合物包含rock抑制剂；选自由vegf、bfgf、scf、flt3l、tpo和il7组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子；和任选地bmp激活剂；以启动确定性生血内皮向前t细胞祖细胞的分化；以及任选地(ii)使这些前t细胞祖细胞与以下的组合物接触，该组合物包含选自由scf、flt3l和il7组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子，但不含vegf、bfgf、tpo、bmp激活剂和rock抑制剂中的一种或多种，以启动这些前t细胞祖细胞向t细胞祖细胞或t细胞的分化。在该方法的一些实施例中，多潜能干细胞衍生的t细胞祖细胞是cd34 cd45 cd7 。在该方法的一些实施例中，多潜能干细胞衍生的t细胞祖细胞是cd45 cd7 。
[0272]
在上述用于使多潜能干细胞的分化指向造血谱系的细胞的方法的又一些实施例中，该方法进一步包括：(i)使多潜能干细胞衍生的确定性生血内皮与以下的组合物接触，该组合物包含rock抑制剂；选自由vegf、bfgf、scf、flt3l、tpo、il3、il7和il15组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子；以及任选地bmp激活剂，以启动确定性生血内皮向前nk细胞祖细胞的分化；以及任选地(ii)使多潜能干细胞衍生的前nk细胞祖细胞与以下的组合物接触，该组合物包含选自由scf、flt3l、il3、il7和il15组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子，其中培养基不含vegf、bfgf、tpo、bmp激活剂和rock抑制剂中的一种或多种，以启
动前nk细胞祖细胞向nk细胞祖细胞或nk细胞的分化。在一些实施例中，多潜能干细胞衍生的nk祖细胞是cd3
‑
cd45 cd56 cd7 。在一些实施例中，多潜能干细胞衍生的nk细胞是cd3
‑
cd45 cd56 ，并且任选地进一步由nkp46 、cd57 和cd16 定义。
[0273]
在上述用于使多潜能干细胞的分化指向nk细胞的方法的又一些实施例中，该方法进一步包括敲除多潜能干细胞中的基因nrg1。
[0274]
在一些实施例中，本披露提供了一种用于产生多潜能干细胞衍生的t谱系细胞的方法，其包括：(i)使多潜能干细胞与包含bmp激活剂和任选地bfgf的组合物接触，以启动由多潜能干细胞分化和扩增中胚层细胞；(ii)使这些中胚层细胞与以下的组合物接触，该组合物包含bmp激活剂、bfgf和gsk3抑制剂，但不含tgfβ受体/alk抑制剂，以启动由中胚层细胞分化和扩增具有确定性he潜力的中胚层细胞；(iii)使具有确定性he潜力的中胚层细胞与以下的组合物接触，该组合物包含rock抑制剂；选自由bfgf、vegf、scf、igf、epo、il6和il11组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子；以及任选地wnt路径激活剂；其中该组合物不含tgfβ受体/alk抑制剂，以启动由具有确定性he潜力的中胚层细胞分化和扩增确定性生血内皮；(iv)使确定性生血内皮与以下的组合物接触，该组合物包含rock抑制剂；选自由vegf、bfgf、scf、flt3l、tpo和il7组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子；和任选地bmp激活剂；以启动确定性生血内皮向前t细胞祖细胞的分化；以及(v)使这些前t细胞祖细胞与以下的组合物接触，该组合物包含选自由scf、flt3l和il7组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子，其中该组合物不含vegf、bfgf、tpo、bmp激活剂和rock抑制剂中的一种或多种；以启动这些前t细胞祖细胞向t细胞祖细胞或t细胞的分化；并且任选地使接种的多潜能干细胞、中胚层细胞、具有确定性he潜力的中胚层细胞、和/或确定性生血内皮经受约2％至约10％之间的低氧张力。在一些实施例中，上述方法的组ii进一步包括：使ipsc与包含mek抑制剂、gsk3抑制剂和rock抑制剂但不含tgfβ受体/alk抑制剂的组合物接触，以接种和扩增多潜能干细胞；和/或其中这些多潜能干细胞。在一些实施例中，多潜能干细胞是ipsc。在一些实施例中，ipsc是幼稚ipsc。在该方法的一些实施例中，多潜能干细胞向t细胞谱系的分化没有产生拟胚体，并且是单层培养形式。
[0275]
在一些实施例中，本披露提供了一种用于产生多潜能干细胞衍生的nk谱系细胞的方法，其包括：(i)使多潜能干细胞与包含bmp激活剂和任选地bfgf的组合物接触，以启动由多潜能干细胞分化和扩增中胚层细胞；(ii)使中胚层细胞与如下的组合物接触，该组合物包含bmp激活剂、bfgf和gsk3抑制剂，并且任选地不含tgfβ受体/alk抑制剂，以启动由中胚层细胞分化和扩增具有确定性he潜力的中胚层细胞；(iii)使具有确定性he潜力的中胚层细胞与以下的组合物接触，该组合物包含选自由bfgf、vegf、scf、igf、epo、il6和il11组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子；rock抑制剂；任选地wnt路径激活剂；并且任选地不含tgfβ受体/alk抑制剂，以启动由具有确定性he潜力的多潜能干细胞衍生的中胚层细胞分化和扩增多潜能干细胞衍生的确定性生血内皮；(iv)使多潜能干细胞衍生的确定性生血内皮与以下的组合物接触，该组合物包含rock抑制剂；选自由vegf、bfgf、scf、flt3l、tpo、il3、il7和il15组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子，以及任选地bmp激活剂，以启动多潜能干细胞衍生的确定性生血内皮向前nk细胞祖细胞的分化；以及(v)使多潜能干细胞衍生的前nk细胞祖细胞与以下的组合物接触，该组合物包含选自由scf、flt3l、il3、il7和il15组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子，但不含vegf、bfgf、tpo、bmp激活剂和
rock抑制剂中的一种或多种，以启动多潜能干细胞衍生的前nk细胞祖细胞向多潜能干细胞衍生的nk细胞祖细胞或nk细胞的分化；以及任选地使接种的多潜能干细胞、多潜能干细胞衍生的中胚层细胞、和/或确定性生血内皮经受约2％至约10％之间的低氧张力。在一些实施例中，用于产生组ii的多潜能干细胞衍生的nk谱系细胞的方法进一步包括使ipsc与包含mek抑制剂、gsk3抑制剂和rock抑制剂但不含tgfβ受体/alk抑制剂的组合物接触，以接种和扩增ipsc。在一些实施例中，ipsc是幼稚ipsc。在一些实施例中，用于产生多潜能干细胞衍生的nk谱系细胞的方法没有产生拟胚体，并且是单层培养形式。
[0276]
在一些实施例中，本披露提供了一种用于产生多潜能干细胞衍生的确定性生血内皮的方法，该方法包括：(i)使ipsc与包含bmp激活剂和任选地bfgf的组合物接触，以启动由多潜能干细胞分化和扩增多潜能干细胞衍生的中胚层细胞；(ii)使多潜能干细胞衍生的中胚层细胞与如下的组合物接触，该组合物包含bmp激活剂、bfgf和gsk3抑制剂，并且任选地不含tgfβ受体/alk抑制剂，以启动由多潜能干细胞衍生的中胚层细胞分化和扩增具有确定性he潜力的多潜能干细胞衍生的中胚层细胞；(iii)使具有确定性he潜力的多潜能干细胞衍生的中胚层细胞与以下的组合物接触，该组合物包含选自由bfgf、vegf、scf、igf、epo、il6和il11组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子；rock抑制剂；以及任选地wnt路径激活剂，并且任选地不含tgfβ受体/alk抑制剂，以启动由具有确定性he潜力的多潜能干细胞衍生的中胚层细胞分化和扩增多潜能干细胞衍生的确定性生血内皮；以及任选地使接种的多潜能干细胞、多潜能干细胞衍生的中胚层细胞、和/或确定性生血内皮经受约2％至约10％之间的低氧张力。在一些实施例中，用于产生多潜能干细胞衍生的确定性生血内皮的上述方法进一步包括：将ipsc与包含mek抑制剂、gsk3抑制剂和rock抑制剂但不含tgfβ受体/alk抑制剂的组合物接触，以接种和扩增ipsc；和/或其中ipsc是幼稚ipsc。在一些实施例中，ipsc包含一种或多种遗传印记，并且其中包含在ipsc中的一种或多种遗传印记被保留在由其分化的多潜能干细胞衍生的确定性生血内皮细胞中。在一些实施例中，将ipsc分化为确定性生血内皮细胞的上述方法没有产生拟胚体，并且是单层培养形式。
[0277]
在一些实施例中，本披露提供了一种用于产生造血谱系的多潜能干细胞衍生的多能祖细胞的方法，该方法包括：(i)使ipsc与包含bmp激活剂和任选地bfgf的组合物接触，以启动由ipsc分化和扩增多潜能干细胞衍生的中胚层细胞；(ii)使多潜能干细胞衍生的中胚层细胞与以下的组合物接触，该组合物包含bmp激活剂、bfgf和gsk3抑制剂，但不含tgfβ受体/alk抑制剂，以启动由中胚层细胞分化和扩增具有确定性he潜力的中胚层细胞；(iii)使具有确定性he潜力的中胚层细胞与以下的组合物接触，该组合物包含rock抑制剂；选自由bfgf、vegf、scf、igf、epo、il6和il11组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子；以及任选地wnt路径激活剂，其中该组合物不含tgfβ受体/alk抑制剂，以启动由具有确定性he潜力的中胚层细胞分化和扩增确定性生血内皮；(iv)使确定性生血内皮与以下的组合物接触，该组合物包含bmp激活剂，rock抑制剂，选自由tpo、il3、gmcsf、epo、bfgf、vegf、scf、il6、flt3l和il11组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子，以启动确定性生血内皮向前hsc的分化；以及(v)使前hsc与以下的组合物接触，该组合物包含bmp激活剂，选自由tpo、il3、gmcsf、epo、bfgf、vegf、scf、il6和il11组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子，但不含rock抑制剂，以启动前hsc向造血多能祖细胞的分化；以及任选地使接种的多潜能干细胞、中胚层细胞、和/或确定性生血内皮经受约2％至约10％之间的低氧张力。在一些实施例
中，用于产生多潜能干细胞衍生的造血多能祖细胞的上述方法进一步包括使多潜能干细胞与包含mek抑制剂、gsk3抑制剂和rock抑制剂但不含tgfβ受体/alk抑制剂的组合物接触，以接种和扩增多潜能干细胞。在一些实施例中，多潜能干细胞是ipsc。在一些实施例中，ipsc是幼稚ipsc。在一些实施例中，ipsc包含一种或多种遗传印记，并且其中包含在ipsc中的一种或多种遗传印记被保留在由其分化的多潜能干细胞衍生的造血多能祖细胞中。在一些实施例中，使用上述方法将多潜能干细胞分化为造血多能祖细胞没有产生拟胚体，并且是单层培养形式。
[0278]
在一些实施例中，本披露提供了一种组合物，其包含：由本文披露的培养平台产生的一个或多个细胞群：多潜能干细胞衍生的(i)cd34 确定性生血内皮(icd34)，其中icd34细胞具有分化为多能祖细胞、t细胞祖细胞、nk细胞祖细胞、t细胞、nk细胞、nkt细胞和b细胞的能力，并且其中icd34细胞是cd34 cd43
‑
；(ii)确定性生血内皮(ihe)，其中ihe细胞是cd34 ，以及cd43
‑
、cd93
‑
、cxcr4
‑
、cd73
‑
和cxcr4
‑
cd73
‑
中至少一种；(iii)多潜能干细胞衍生的确定性hsc，其中ihsc是cd34 cd45 ；(iv)造血多能祖细胞，其中impp细胞是cd34 cd45 ；(v)t细胞祖细胞，其中t细胞祖细胞是cd34 cd45 cd7 或cd34
‑
cd45 cd7 ；(vi)t细胞，其中t细胞是cd45 cd3 cd4 或cd45 cd3 cd8 ；(vii)nk细胞祖细胞，其中nk细胞祖细胞是cd45 cd56 cd7 ；(viii)nk细胞，其中nk细胞是cd3
‑
cd45 cd56 ，并且任选地进一步由nkp46 、cd57 和cd16 定义；(ix)nkt细胞，其中nkt细胞是cd45 vα24jα18 cd3 ；和(x)b细胞，其中b细胞是cd45 cd19 。
[0279]
在一些实施例中，本披露提供了使用本文披露的方法产生的如下一种或多种细胞系或者克隆细胞：多潜能干细胞衍生的(i)cd34 确定性生血内皮(icd34)，其中icd34细胞具有分化为多能祖细胞、t细胞祖细胞、nk细胞祖细胞、t细胞、nk细胞和nkt细胞的能力，并且其中icd34细胞是cd34 cd43
‑
；(ii)确定性生血内皮(ihe)，其中ihe细胞系或克隆细胞是cd34 ，以及cd43
‑
、cd93
‑
、cxcr4
‑
、cd73
‑
和cxcr4
‑
cd73
‑
中至少一种；(iii)确定性hsc，其中ihsc是cd34 cd45 ；(iv)造血多能祖细胞(impp)，其中impp细胞是cd34 cd45 ；(v)t细胞祖细胞，其中t细胞祖细胞是cd34 cd45 cd7 或cd34
‑
cd45 cd7 ；(vi)t细胞，其中t细胞是cd45 cd3 cd4 或cd45 cd3 cd8 ；(vii)nk细胞祖细胞，其中nk细胞祖细胞是cd45 cd56 cd7 ；(viii)nk细胞，其中nk细胞是cd3
‑
cd45 cd56 ，并且任选地进一步由nkp46 、cd57 和cd16 定义；(ix)nkt细胞，其中nkt细胞是cd45 vα24jα18 cd3 ；和(x)b细胞，其中b细胞是cd45 cd19 。
[0280]
在一些实施例中，本披露提供了使用所披露的方法产生的如下细胞群、细胞系或克隆细胞中的一种或多种促进造血自我更新、重构或植入的方法：多潜能干细胞衍生的(i)cd34 确定性生血内皮(icd34)，其中icd34细胞具有分化为多能祖细胞、t细胞祖细胞、nk细胞祖细胞、t细胞、nk细胞和nkt细胞的能力，并且其中icd34细胞是cd34 cd43
‑
；(ii)确定性生血内皮(ihe)，其中ihe细胞系或克隆细胞是cd34 ，以及cd43
‑
、cd93
‑
、cxcr4
‑
、cd73
‑
和cxcr4
‑
cd73
‑
中至少一种；(iii)确定性hsc，其中ihsc是cd34 cd45 ；(iv)造血多能祖细胞，其中impp细胞是cd34 cd45 ；(v)t细胞祖细胞，其中t细胞祖细胞是cd34 cd45 cd7 或cd34
‑
cd45 cd7 ；(vi)t细胞，其中t细胞是cd45 cd3 cd4 或cd45 cd3 cd8 ；(vii)nk细胞祖细胞，其中nk细胞祖细胞是cd45 cd56 cd7 ；(viii)nk细胞，其中nk细胞是cd3
‑
cd45 cd56 ，并且任选地进一步由nkp46 、cd57 和cd16 定义；(ix)nkt细胞，其中nkt细胞是cd45
vα24jα18 cd3 ；和(x)b细胞，其中b细胞是cd45 cd19 。
[0281]
在一些实施例中，本披露提供了一种产生具有增强的治疗特性的造血谱系细胞的方法，并且该方法包括：获得包含一个或多个遗传印记的ipsc；并使ipsc的分化指向造血谱系细胞。分化指向的步骤进一步包括：(i)使多潜能干细胞与包含bmp路径激活剂和任选地bfgf的组合物接触，以获得中胚层细胞；以及(ii)使这些中胚层细胞与包含bmp路径激活剂、bfgf和wnt路径激活剂的组合物接触，以获得具有确定性生血内皮(he)潜力的中胚层细胞，其中这些具有确定性生血内皮(he)潜力的中胚层细胞能够提供造血谱系细胞。优选地，没有形成拟胚体的步骤，在步骤(i)和(ii)中获得中胚层细胞和具有确定性he潜力的中胚层细胞，并且所获得的造血谱系细胞包含确定性生血内皮细胞、造血干细胞和祖细胞(hsc)、造血多能祖细胞(mpp)、前t细胞祖细胞、前nk细胞祖细胞、t细胞祖细胞、nk细胞祖细胞、t细胞、nk细胞、nkt细胞或b细胞。此外，造血谱系细胞保留在ipsc中包含的用于分化指向的遗传印记。
[0282]
在一些实施例中，上述方法的分化指向步骤进一步包括：(i)使这些具有确定性he潜力的中胚层细胞与包含bfgf和rock抑制剂的组合物接触，以获得确定性he细胞；(ii)使这些确定性he细胞与以下的组合物接触，该组合物包含bmp激活剂和任选地rock抑制剂以及选自由tpo、il3、gmcsf、epo、bfgf、vegf、scf、il6、flt3l和il11组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子，以获得造血多能祖细胞(mpp)；(iii)使这些确定性he细胞与以下的组合物接触，该组合物包含选自由scf、flt3l和il7组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子；以及任选地bmp激活剂、rock抑制剂、tpo、vegf和bfgf中的一种或多种，以获得前t细胞祖细胞、t细胞祖细胞和/或t细胞；或(iv)使这些确定性he细胞与以下的组合物接触，以获得前nk细胞祖细胞、nk细胞祖细胞和/或nk细胞，该组合物包含选自由scf、flt3l、tpo、il7和il15组成的组的一种或多种生长因子和细胞因子，以及任选地bmp激活剂、rock抑制剂、vegf和bfgf中的一种或多种。
[0283]
简而言之，该方法可以包括重编程成熟源t或b细胞以获得诱导性多潜能干细胞(ipsc)；以及检测ipsc或由其衍生的造血谱系细胞中特定v(d)j重组的存在，该重组与用于产生ipsc的成熟t或b细胞中包含的那种相同。在一些实施例中，上述方法进一步包括将包含与成熟源t或b细胞相同的v(d)j重组的ipsc或造血谱系细胞分离。在一些实施例中，上述方法包括在重编程源细胞之前，获得用于重编程的成熟源t或b细胞；以及测定免疫球蛋白(ig)或t细胞受体(tcr)中包含的对成熟源t或b细胞而言具有特异性的v(d)j重组。
[0284]“多潜能性因子”或“重编程因子”是指能够增加细胞的发育潜能的剂，单独或与其他剂组合。多潜能性因子包括但不限于能够增加细胞发育潜能的多核苷酸、多肽和小分子。示例性多潜能性因子包括例如转录因子和小分子重编程剂。
[0285]
已经显示出许多来自所有三个胚层的各种细胞类型适合于体细胞重编程，包括但不限于肝脏和胃(aoi等人,2008)；胰腺β细胞(stadtfeld等人,2008)；成熟b淋巴细胞(hanna等人,2008)；人皮肤成纤维细胞(takahashi等人,2007；yu等人,2007；lowry等人,2008；aasen等人,2008)；脑膜细胞(qin等人,2008)；神经干细胞(disteffano等人,2008)；和神经祖细胞(eminli等人,2008)。因此，本披露部分地设想了用以从任何细胞谱系重编程和/或编程细胞的方法。
[0286]
本披露部分地设想了通过使细胞与一种或多种阻遏物和/或激活剂接触来改变细
胞的潜能，以调节表观遗传状态、染色质结构、转录、mrna剪接、转录后修饰、mrna稳定性和/或半衰期、翻译、翻译后修饰、蛋白质稳定性和/或半衰期、和/或与测定或影响细胞潜能相关的细胞路径的组分的半衰期和/或蛋白质活性。
[0287]
因此，在各个实施例中，本披露使用可预测和高度受控的基因表达方法，如本文其他地方所讨论的，其使得能够进行体细胞的离体或体内重编程或脱分化和编程或分化。如上所述，然而，细胞的有意遗传工程是不是优选的，因为它改变细胞基因组，并且可能导致遗传或表观遗传异常。相比之下，本披露的组合物和方法提供了阻遏物和/或激活剂，其通过模拟细胞的内源发育潜能路径以实现细胞的重编程和/或编程来非遗传地改变细胞的潜能。重编程中的小分子
[0288]
已通过所定义基因(例如，oct
‑
3/4、sox
‑
2、klf
‑
4、c
‑
myc和lin28等)与小分子组合的逆转录病毒感染实现了将体细胞重编程为诱导性多潜能干细胞。
[0289]
在一些实施例中，本披露提供了改变细胞的潜能的方法，该方法包括使细胞与一种或多种阻遏物和/或激活剂或包含其的组合物接触，其中所述一种或多种阻遏物和/或激活剂调节与细胞的潜能相关的细胞路径的至少一种组分，从而改变细胞的潜能。在特定实施例中，一种或多种阻遏物和/或激活剂调节与细胞的潜能相关的细胞路径的一种或多种组分，从而改变细胞的潜能。在某些实施例中，一种或多种阻遏物和/或激活剂调节与细胞的潜能相关的一种或多种细胞路径的一种或多种组分，从而改变细胞的潜能。在某些相关实施例中，该一种或多种组分的调节是协同的，并增加改变细胞的潜能的整体功效。与基础潜能状态相比，细胞的潜能可以改变为较多潜能状态(例如，从分化的细胞到多能、多潜能或全能细胞)或较少潜能状态(例如，从全能、多潜能或多能细胞到分化的体细胞)。在仍又其他实施例中，细胞的潜能可以改变多于一次。例如，可以首先将细胞重编程为较多潜能状态，然后编程为特定的体细胞。
[0290]
在另一个实施例中，本披露的方法提供了增加细胞的潜能，其中细胞被重编程或脱分化为全能状态，包括使细胞与包含一种或多种阻遏物和/或激活剂的组合物接触，其中一种或多种阻遏物和/或激活剂调节与细胞的全能性相关的细胞路径的至少一种组分，从而将细胞的潜能增加至全能状态。
[0291]
在特定实施例中，将细胞的潜能增加至多潜能状态的方法包括使细胞与一种或多种阻遏物和/或激活剂接触，其中一种或多种阻遏物和/或激活剂调节与细胞的潜能相关的细胞路径的至少一种组分，从而将细胞的潜能增加至多潜能状态。
[0292]
在另一个特定实施例中，将细胞的潜能增加至多能状态的方法包括使细胞与一种或多种阻遏物和/或激活剂接触，其中一种或多种阻遏物和/或激活剂调节与细胞的潜能相关的细胞路径的至少一种组分，从而将细胞的潜能增加至多能状态。
[0293]
在某些实施例中，增加细胞的潜能的方法进一步包括使全能细胞、多潜能细胞或多能细胞与第二组合物接触的步骤，其中第二组合物调节细胞潜能路径的至少一种组分以降低细胞的全能性、多潜能性或多能性，并将细胞分化为成熟的体细胞。
[0294]
在另一个相关实施例中，本披露提供了一种重编程细胞的方法，该方法包括使细胞与包含一种或多种阻遏物和/或激活剂的组合物接触，其中一种或多种阻遏物和/或激活剂调节与细胞重编程相关的一个或多个细胞路径的至少一种组分，从而重编程细胞。
[0295]
在其他实施例中，本披露提供了一种将细胞分化为较多潜能状态的细胞的方法，该方法包括使细胞与包含一种/或多种激活剂的组合物接触，其中一种或多种阻遏物和/或激活剂调节与将细胞脱分化为较多潜能状态相关的一种或多种细胞路径的至少一种组分，从而将细胞脱分化为无潜能状态。
[0296]
根据本披露的各个实施例，阻遏物可以是抗体或抗体片段、内抗体、反式体(transbody)、dna酶、ssrna、dsrna、mrna、反义rna、核酶、反义寡核苷酸、初级mirna、shrna、拮抗剂(antagomir)、适体、sirna、dsdna、ssdna；多肽或其活性片段、肽模拟物、类肽或小有机分子。基于多肽的阻遏物包括但不限于融合多肽。基于多肽的阻遏物还包括转录阻遏物，其可以进一步是如本文其他地方所述的融合多肽和/或人工设计的转录阻遏物。
[0297]
根据其他各个实施例，激活剂可以是抗体或抗体片段、mrna、双功能反义寡核苷酸、dsdna、多肽或其活性片段、肽模拟物、类肽或小有机分子。
[0298]
在一些实施例中，阻遏物通过以下来调节细胞潜能路径的至少一种组分：a)阻遏该至少一种组分；b)脱阻遏该至少一种组分的阻遏物；或c)阻遏该至少一种组分的激活剂。在相关的实施例中，一种或多种阻遏物可以通过以下来调节与细胞潜能相关的路径的至少一种组分：a)脱阻遏该至少一种组分；b)阻遏该至少一种组分的阻遏物；或c)脱阻遏该至少一种组分的激活剂。
[0299]
在某些实施例中，一种或多种阻遏物通过以下来调节与细胞潜能相关的细胞路径的至少一种组分：a)阻遏组蛋白甲基转移酶或阻遏该至少一种组分的表观遗传状态、染色质结构、转录、mrna剪接、翻译后修饰、mrna稳定性和/或半衰期、翻译、翻译后修饰、蛋白质稳定性和/或半衰期和/或蛋白质活性；或b)脱阻遏去甲基酶或激活该至少一种组分的表观遗传状态、染色质结构、转录、mrna剪接、转录后修饰、mrna稳定性和/或半衰期、翻译、翻译后修饰、蛋白质稳定性和/或半衰期和/或蛋白质活性。
[0300]
在相关的实施例中，激活剂通过以下来调节与细胞潜能相关的细胞路径的至少一种组分：a)激活该至少一种组分；b)激活该至少一种组分的阻遏物的阻遏物；或c)激活该至少一种组分的激活剂。
[0301]
在某些实施例中，一种或多种激活剂通过以下来调节至少一种组分：a)激活组蛋白去甲基酶或激活该至少一种组分的表观遗传状态、染色质结构、转录、mrna剪接、翻译后修饰、mrna稳定性和/或半衰期、翻译、翻译后修饰、蛋白质稳定性和/或半衰期和/或蛋白质活性；或b)激活组蛋白甲基转移酶的阻遏物或激活该至少一种组分的表观遗传状态、染色质结构、转录、mrna剪接、转录后修饰、mrna稳定性和/或半衰期、翻译、翻译后修饰、蛋白质稳定性和/或半衰期和/或蛋白质活性的阻遏物。
[0302]
在各个其他实施例中，本披露部分地设想了一种重编程细胞的方法，该方法包括使细胞与一种或多种阻遏物接触，其中一种或多种阻遏物调节与细胞重编程相关的细胞路径的至少一种组分，从而重编程细胞。
[0303]
在各个其他实施例中，本披露部分地设想了一种重编程细胞的方法，该方法包括使细胞与包含一种或多种激活剂的组合物接触，其中一种或多种激活剂调节与细胞重编程相关的细胞路径的至少一种组分，从而重编程细胞。
[0304]
虽然本文提供了一些用于重编程/nk细胞分化的示例性方法，但是这些是示例性的，并且不是意味着限制本披露的范围。基于本披露，鉴于本领域的知识，用于重编程/nk细
胞分化的另外的适合方法对本领域技术人员而言是显而易见的。用于在饲养层上或用饲养细胞培养nk细胞的方法在例如通过引用以其整体并入本文的valamehr等人(“valamehr”)的ep3184109中进行了详细描述。
[0305]
通常，可以使用多种方法和装置培养任何类型的nk细胞群。培养设备的选择通常基于培养的规模和目的。细胞培养的按比例放大优选地涉及使用专用装置。例如，在spanholtz等人(plos one[公共科学图书馆
·
综合]2010；5:e9221)和sutlu等人(cytotherapy[细胞疗法]2010,在线预览1
‑
12)中详细说明了用于大规模临床级nk细胞生产的装置。
[0306]
上文描述的用于离体培养nk细胞群的方法可以尤其得到经培养的nk细胞群。编辑的类型
[0307]
本披露的一些方面提供了复杂的编辑策略，以及得到的具有复杂的基因组改变的nk细胞，这些复杂的基因组改变允许产生用于临床应用(例如，用于免疫肿瘤学治疗方法)的先进的nk细胞产品。在一些实施例中，本文提供的经修饰的nk细胞可以用作用于患有或已被诊断出过度增殖性疾病(例如癌症)的患者的现成临床解决方案。在一些实施例中，与未修饰的nk细胞相比，经修饰的nk细胞表现出增强的存活率、增殖、nk细胞应答水平、nk细胞应答持续时间、对nk细胞耗尽的抵抗和/或靶标识别。例如，本文提供的经修饰的nk细胞可以包含导致经修饰的nk细胞中的以下情况的基因组编辑：目的嵌合抗原受体(car)的表达，例如，靶向间皮素、egfr、her2和/或mica/b的car；可以表达cd16变体，例如hncd16；il15/il15ra融合体的表达；tgfβ受体2(tgfβr2)的功能丧失；和/或显性负性tgfβr2变体的表达；adora2a的功能丧失；b2m的功能丧失；hla
‑
g的表达；ciita的功能丧失；pd1的功能丧失；tigit的功能丧失；和/或cish的功能丧失；或其两种或更多种的任何组合。
[0308]
在一些实施例中，本文提供的经修饰的nk细胞可以包含导致经修饰的nk细胞中的以下情况的基因组编辑：外源cd16变体的表达，例如hncd16；外源il15/il15ra融合体的表达；外源hla
‑
g的表达；外源dn
‑
tgfβr2的表达；tgfβr2的功能丧失；b2m的功能丧失；pd1的功能丧失；tigit的功能丧失；和/或adora2a的功能丧失。
[0309]
在一些实施例中，本文提供的经修饰的nk细胞可以包含导致经修饰的nk细胞中的以下情况的基因组编辑：外源cd16变体的表达，例如hncd16；外源il15/il15ra融合体的表达；外源hla
‑
g的表达；外源dn
‑
tgfβr2的表达；可溶性mica和/或micb的表达；tgfβr2的功能丧失；b2m的功能丧失；pd1的功能丧失；tigit的功能丧失；和/或adora2a的功能丧失。
[0310]
在一些实施例中，本文提供的经修饰的nk细胞可以包含导致经修饰的nk细胞中的以下情况的基因组编辑：外源cd16变体的表达，例如hncd16；外源il15/il15ra融合体的表达；外源hla
‑
g的表达；外源dn
‑
tgfβr2的表达；可溶性mica和/或micb的表达；外源il
‑
12的表达；外源il
‑
18的表达；tgfβr2的功能丧失；b2m的功能丧失；pd1的功能丧失；tigit的功能丧失；和/或adora2a的功能丧失。
[0311]
在一些实施例中，本文提供的经修饰的nk细胞可以包含导致经修饰的nk细胞中的以下情况的基因组编辑：外源cd16变体的表达，例如hncd16；外源il15/il15ra融合体的表达；外源hla
‑
g的表达；外源dn
‑
tgfβr2的表达；外源il
‑
12的表达；外源il
‑
18的表达；tgfβr2的功能丧失；b2m的功能丧失；pd1的功能丧失；tigit的功能丧失；和/或adora2a的功能丧失。
[0312]
经修饰的nk细胞可以在其基因组中表现出导致靶基因的功能丧失的一种或多种编辑和/或来自外源核酸构建体(例如表达构建体)的导致基因产物(例如蛋白质)的功能获得或过表达的一个或多个修饰，该外源核酸构建体包含被整合到经修饰的nk细胞的基因组中或以染色体外方式提供(例如，以游离型表达构建体的形式)的编码该基因产物的cdna。
[0313]
靶基因的功能丧失的特征在于基于基因组修饰(例如，在靶基因中rna指导的核酸酶介导的切割)，靶基因的表达降低，该基因组修饰导致编码的基因产物的灭活或者其表达或功能减少。
[0314]
基因产物的功能获得的特征在于细胞中基因产物(例如蛋白质)的表达增加(本文中也称为过表达)，其可包括例如基因产物的表达水平增加，或者不会从例如内源基因内源表达基因产物的细胞中该基因产物的表达。
[0315]
在一些实施例中，通过将编码基因产物的外源核酸构建体引入细胞中来实现基因产物的增加，例如，包含在异源启动子的控制下编码基因产物的cdna的外源核酸构建体。在一些实施例中，外源核酸构建体通过例如hdr介导的基因编辑整合到特定基因座中，如本文其他地方更详细描述的。实现功能丧失编辑的方法以及实现基因产物表达增加的方法，例如通过rna指导的核酸酶技术，是本领域普通技术人员所熟知的。
[0316]
如下表10提供了一些示例性基因产物，其中一种或多种可以在本披露的一些实施例中提供的经修饰的nk细胞中过表达：表10：表10：
[0317]
如下表11提供了一些示例性靶基因，在本披露的一些实施例中提供的经修饰的nk细胞中表现出其中一种或多种的功能丧失。表11：
[0318]
本披露包括表现出组合的表7和表8中列出的任何编辑和/或基因产物的表达增加
的经修饰nk细胞，以及这些表中列出的这类编辑和/或基因产物的表达增加的任何组合。例如，应当理解，本披露包括其中提供了经修饰的nk细胞的实施例，这些经修饰的nk细胞包含表10或表11中列出的单一编辑，例如，adora2a的功能丧失，或b2m的功能丧失，或hla
‑
g的表达增加等。应当理解，本披露内容包括其中提供了经修饰的nk细胞的实施例，这些经修饰的nk细胞包含表11中列出的单一编辑以及表10中列出的基因产物的表达增加，例如，adora2a的功能丧失或b2m的功能丧失；以及hla
‑
g的表达增加。还应理解，本披露包括其中提供了经修饰的nk细胞的实施例，这些经修饰的nk细胞包含表11中列出的两种或更多种编辑，以及表10中列出的单一基因产物的表达增加。还应理解，本披露包括其中提供了经修饰的nk细胞的实施例，这些经修饰的nk细胞包含表11中列出的单一编辑，以及表10中列出的两种或更多种基因产物的表达增加。还应理解，本披露包括其中提供了经修饰的nk细胞的实施例，这些经修饰的nk细胞包含表11中列出的两种或更多种编辑，以及表10中列出的两种或更多种基因产物的表达增加。
[0319]
为了说明本披露包括的经修饰的nk细胞的一些配置，在下文和本文其他地方提供了一些示例性的非限制性实施例。在一些实施例中，提供了经修饰的nk细胞，其表现出adora2a的功能丧失。在一些实施例中，提供了经修饰的nk细胞，其表现出b2m的功能丧失。在一些实施例中，提供了经修饰的nk细胞，其表现出tgfbrii的功能丧失。在一些实施例中，提供了经修饰的nk细胞，其表现出adora2a和b2m的功能丧失。在一些实施例中，提供了经修饰的nk细胞，其表现出hncd16的功能获得。在一些实施例中，提供了经修饰的nk细胞，其表现出car的功能获得，例如car结合her2、egfr、α叶酸受体、cea、cmet、muc1、间皮素、ror1或不同靶标，例如，如本文所披露的或本领域中另外已知的。在一些实施例中，提供了经修饰的nk细胞，其表现出hla
‑
g的功能获得。在一些实施例中，提供了经修饰的nk细胞，其表现出单链il
‑
15/il
‑
15r融合蛋白的功能获得。在一些实施例中，提供了经修饰的nk细胞，其表现出adora2a和b2m的功能丧失以及hncd16的功能获得。在一些实施例中，提供了经修饰的nk细胞，其表现出adora2a和b2m的功能丧失以及car的功能获得，例如car结合her2、egfr、α叶酸受体、cea、cmet、muc1、间皮素、ror1或不同靶标，例如，如本文所披露的或本领域中另外已知的。在一些实施例中，提供了经修饰的nk细胞，其表现出adora2a和b2m的功能丧失以及hla
‑
g的功能获得。在一些实施例中，提供了经修饰的nk细胞，其表现出adora2a和b2m的功能丧失以及单链il
‑
15/il
‑
15r融合蛋白的功能获得。在一些实施例中，提供了经修饰的nk细胞，其表现出adora2a和b2m的功能丧失，以及hncd16和显性负性tgfbrii变体的功能获得。在一些实施例中，提供了经修饰的nk细胞，其表现出adora2a和b2m的功能丧失，以及car(例如car结合her2、egfr、α叶酸受体、cea、cmet、muc1、间皮素、ror1或不同靶标，例如，如本文所披露的或本领域中另外已知的)和显性负性tgfbrii变体的功能获得。在一些实施例中，提供了经修饰的nk细胞，其表现出adora2a和b2m的功能丧失，以及hla
‑
g和显性负性tgfbrii变体的功能获得。在一些实施例中，提供了经修饰的nk细胞，其表现出adora2a和b2m的功能丧失，以及单链il
‑
15/il
‑
15r融合蛋白和显性负性tgfbrii变体的功能获得。在一些实施例中，提供了经修饰的nk细胞，其表现出adora2a、cish和b2m的功能丧失，以及hncd16和hla
‑
g的功能获得。在一些实施例中，提供了经修饰的nk细胞，其表现出adora2a和b2m的功能丧失，以及单链il
‑
15/il
‑
15r融合蛋白、hla
‑
g和显性负性tgfbrii变体的功能获得。在一些实施例中，提供了经修饰的nk细胞，其表现出tigit和b2m的功能丧失，以及
hncd16和显性负性tgfbrii变体的功能获得。在一些实施例中，提供了经修饰的nk细胞，其表现出tigit和b2m的功能丧失，以及car(例如car结合her2、egfr、α叶酸受体、cea、cmet、muc1、间皮素、ror1或不同靶标，例如，如本文所披露的或本领域中另外已知的)和显性负性tgfbrii变体的功能获得。在一些实施例中，提供了经修饰的nk细胞，其表现出tigit和b2m的功能丧失，以及hla
‑
g和显性负性tgfbrii变体的功能获得。在一些实施例中，提供了经修饰的nk细胞，其表现出tigit和b2m的功能丧失，以及单链il
‑
15/il
‑
15r融合蛋白和显性负性tgfbrii变体的功能获得。在一些实施例中，提供了经修饰的nk细胞，其表现出tigit、cish和b2m的功能丧失，以及hncd16和hla
‑
g的功能获得。在一些实施例中，提供了经修饰的nk细胞，其表现出tigit和b2m的功能丧失，以及单链il
‑
15/il
‑
15r融合蛋白、hla
‑
g和显性负性tgfbrii变体的功能获得。在一些实施例中，提供了经修饰的nk细胞，其表现出adora2a、tigit、pd
‑
1和b2m的功能丧失，以及单链il
‑
15/il
‑
15r融合蛋白、hla
‑
g和显性负性tgfbrii变体的功能获得。
[0320]
应当理解，本文提供的示例性实施例意在说明本披露包括的nk细胞的一些实例。为了简洁起见，这里没有详细描述另外的配置，但是基于本披露，对于本领域的技术人员而言，此类实施例将即刻显而易见。嵌合抗原受体(car)
[0321]
如本文所用，术语“嵌合抗原受体”或“car”是指受体蛋白已经被修饰，以向表达car的细胞给出靶向特定蛋白质的新能力。在本披露的背景下，经修饰以包含car的nk细胞可用于针对靶标的免疫疗法并破坏与疾病或障碍相关的细胞，例如癌细胞。
[0322]
目的car包括但不限于靶向间皮素、egfr、her2和/或mica/b的car。迄今为止，靶向间皮素的car t细胞疗法已显示了在患有间皮瘤、非小细胞肺癌和乳腺癌的受试者的i期临床试验中的早期疗效证据(nct02414269)。类似地，靶向egfr、her2和mica/b的car在早期研究显示了前景(参见，例如，li等人(2018),cell death&disease[细胞死亡和疾病],9(177)；han等人(2018)am.j.cancer res.[美国癌症研究期刊],8(1):106
‑
119；和demoulin 2017)future oncology[未来肿瘤学],13(8)；其每一项的全部内容明确地通过引用并入本文)。
[0323]
car为本领域普通技术人员所熟知，并包括例如以下中描述的那些：wo 13/063419(间皮素)、wo 15/164594(egfr)、wo 13/063419(her2)、wo 16/154585(mica和micb)，其每一项的全部内容明确地通过引用并入本文。靶向细胞(例如nk细胞，例如与疾病或障碍相关的细胞)的任何适合的car、nk
‑
car或其他结合剂可以在本文提供的经修饰的nk细胞中表达。示例性car和结合剂包括但不限于结合以下的car和粘合剂：bcma、cd19、cd22、cd20、cd33、cd123、雄激素受体、psma、psca、muc1、hpv病毒肽(即e7)、ebv病毒肽、cd70、wt1、cea、egfrviii、il13rα2、和gd2、ca125、cd7、epcam、muc16、cd30。基于本披露和本领域的一般知识，用于本文提供的经修饰的nk细胞的另外的适合car和结合剂对于本领域技术人员而言是显而易见的。这些另外的适合car包括davies和maher,adoptive t
‑
cell immunotherapy of cancer using chimeric antigen receptor
‑
grafted t cells[使用嵌合抗原受体接枝t细胞的癌症过继性t细胞免疫疗法],archivum immunologiae et therapiae experimentalis 58(3):165
‑
78(2010)的图3中描述的那些，该文献的全部内容通过引用并入本文。
[0324]
在一些实施例中，经修饰的nk细胞可以包含car和cd16变体(例如hncd16)，或包含car且无cd16变体。表达cd16或其变体的任何细胞将适合于连同单克隆抗体(例如在癌症治疗中使用的单克隆抗体)或靶向病理性细胞的fc融合蛋白进行的组合疗法。敲入和敲除
[0325]
在一些实施例中，经修饰的细胞可以表达以下中的一种或多种：外源hncd16、外源il
‑
15、外源il
‑
15ra、tgfβr2的功能丧失、外源dn
‑
tgfβr2、和/或adora2a的功能丧失。在又另一个实施例中，经修饰的细胞可以包含b2m的功能丧失、外源hla
‑
g、ciita的功能丧失、pd1的功能丧失、tigit的功能丧失、或cish的功能丧失。
[0326]
在一些实施例中，经修饰的细胞可以表达以下中的一种或多种：外源hncd16、外源il
‑
15、外源il
‑
15ra、外源hla
‑
g、外源dn
‑
tgfβr2、tgfβr2的功能丧失、b2m的功能丧失、pd1的功能丧失、tigit的功能丧失、和/或adora2a的功能丧失。
[0327]
在一些实施例中，经修饰的细胞可以表达以下中的一种或多种：外源hncd16、外源il
‑
15、外源il
‑
15ra、外源hla
‑
g、外源dn
‑
tgfβr2、可溶性mica和/或micb、tgfβr2的功能丧失、b2m的功能丧失、pd1的功能丧失、tigit的功能丧失、和/或adora2a的功能丧失。
[0328]
在一些实施例中，经修饰的细胞可以表达以下中的一种或多种：外源hncd16、外源il
‑
15、外源il
‑
15ra、外源hla
‑
g、外源dn
‑
tgfβr2、外源il
‑
12、外源il
‑
18、tgfβr2的功能丧失、b2m的功能丧失、pd1的功能丧失、tigit的功能丧失、和/或adora2a的功能丧失。
[0329]
在一些实施例中，经修饰的细胞可以表达以下中的一种或多种：外源hncd16、外源il
‑
15、外源il
‑
15ra、外源hla
‑
g、外源dn
‑
tgfβr2、外源il
‑
12、外源il
‑
18、可溶性mica和/或micb、tgfβr2的功能丧失、b2m的功能丧失、pd1的功能丧失、tigit的功能丧失、和/或adora2a的功能丧失。
[0330]
如本文所用，术语“表达(express/expression)”是指产生多肽的过程，包括转录和翻译。表达可以通过例如多种方法增加，包括：增加编码多肽的基因数量、增加基因的转录(例如通过将基因放置在组成型启动子的控制下)、增加基因的翻译、敲除竞争性基因、或这些的组合和/或其他方法。
[0331]
如本文所用，术语“敲入”是指将靶基因添加到细胞的遗传基因座中。
[0332]
如本文所用，术语“敲除”是指靶基因中的灭活突变，其中靶基因的产物包含功能丧失。
[0333]
如本文所用，术语“功能丧失”是指靶基因中的灭活突变，其中基因产物具有较少或没有功能(部分或全部灭活)。如本文所用，术语“功能丧失”是指靶基因中的灭活突变，其中基因产物没有功能(全部灭活)。
[0334]
如本文所用，术语“hncd16a”是指cd16的高亲和力、不可裂解变体(抗体依赖性细胞的细胞毒性(adcc)所涉及的低亲和力fcγ受体)。典型地，cd16在adcc期间裂解
‑
hncd16 car不会经历这种裂解，从而将adcc信号维持更久。在一些实施例中，blood[血液]2016 128:3363中披露了hncd16a，其全部内容明确地通过引用并入本文。
[0335]
如本文所用，术语“mica/b”是指mhc i类链相关蛋白a(mica)和b(micb)是在细胞应激、损伤或(恶性)转化期间诱导的多态蛋白，并通过在细胞毒性淋巴细胞上表达的天然杀伤组2成员d受体充当
‘
杀死我(kill me)’信号。mica/b被认为非由健康的正常细胞组成性表达，但针对大多数肿瘤类型都报道了表达。ng_034139.1中提供了mica的示例性序列，
并且ng_021405.1中提供了micb的示例性序列。
[0336]
如本文所用，术语“aavsi”是指腺相关整合位点1。
[0337]
如本文所用，术语“2a”是指自裂解2a肽。
[0338]
如本文所用，术语“tgfβrii”或“tgfβr2”是指具有蛋白激酶结构域的跨膜蛋白，与tgf
‑
β受体类型
‑
1形成异二聚体复合物，并结合tgf
‑
β。该受体/配体复合物磷酸化蛋白质，其然后进入核并调节与细胞增殖、细胞周期骤停、伤口愈合、免疫抑制和肿瘤发生相关的基因的转录。kr 710923.1、nm_001024847.2和nm_003242.5中列出了tgfβrii的示例性序列。
[0339]
如本文所用，术语“dn
‑
tgfβrii”是指显性负性tgfβ受体ii(可以由nk特异性启动子表达)tgfβrii在t细胞分化中起重要作用，并且ipsc中的ko将阻止cd34 分化；ko将必须稍后进行，但dn可以由nk特异性启动子表达(在cd34 分化后打开)。在一些实施例中，以下中披露了dn
‑
tgfβrii：immunity[免疫].2000年2月；12(2):171
‑
81，其全部内容明确地通过引用并入本文。
[0340]
可以操纵肿瘤细胞用以保护自己免受tgf
‑
β的影响的策略，以掩蔽肿瘤特异性细胞毒性t淋巴细胞(ctl)使其免受肿瘤分泌的tgf
‑
β的抑制作用。表达显性负性tgfβ受体ii(例如，tgfβriidnr序列)的肿瘤特异性ctl在tgf
‑
β分泌肿瘤存在下相对未修饰的ctl具有选择性功能和存活优势(bollard等人,2002blood[血液].2002年5月1日；99(9):3179
‑
87；通过引用以其整体并入本文)。因此，在一些实施例中，本披露的经修饰的细胞表达dn
‑
tgfβrii构建体。在一些实施例中，dn
‑
tgfβrii构建体由ef1a长启动子驱动。在一些实施例中，dn
‑
tgfβrii构建体通过使用化脓链球菌grna敲入adora2a基因座中。在一些实施例中，dn
‑
tgfβrii构建体包含tgfβriidnr序列，其后紧跟2a序列，并进一步后跟截短的egfr序列(egfrt)，以使得能够跟踪有效表达构建体的细胞。在一些实施例中，dn
‑
tgfβrii构建体作为长单链dna分子产生。在一些实施例中，将dn
‑
tgfβrii构建体在rnp中递送至细胞。在一些实施例中，dn
‑
tgfβrii构建体通过aav递送而递送至细胞(例如，通过aav6)。
[0341]
如本文所用，术语“神经细胞粘附分子”(ncam)，也称为cd56，是指在神经元、神经胶质和骨骼肌以及造血系统的某些细胞的表面上表达的同嗜性结合糖蛋白。cd56的表达与自然杀伤细胞相关，但不限于此。ncam的示例性序列在nm_000615.6、nm_181351.4、nm_001076682.3、nm_001242608.1和nm_001242607.1中提供。
[0342]
如本文所用，术语“cish”是指细胞因子诱导型含sh2蛋白，例如，参见delconte等人,nat immunol.[自然免疫学]2016年7月；17(7):816
‑
24；通过引用以其整体并入本文。cish的示例性序列阐述为ng_023194.1。
[0343]
如本文所用，术语“il
‑
15/il15ra”或“白细胞介素
‑
15”(il
‑
15)是指与白细胞介素
‑
2(il
‑
2)具有结构相似性的细胞因子。与il
‑
2一样，il
‑
15与由il
‑
2/il
‑
15受体β链(cd122)和常见的γ链(γ
‑
c，cd132)组成的复合物结合和通过其发出信号。在一种或多种病毒感染后，单核吞噬细胞(和一些其他细胞)分泌il
‑
15。这种细胞因子诱导自然杀伤细胞的细胞增殖；即主要作用是杀死病毒感染细胞的先天免疫系统的细胞。il
‑
15受体α(il15ra)以非常高的亲和力特异性结合il15，并且能够独立于其他亚基结合il
‑
15。表明该特性允许il
‑
15由一个细胞产生，被另一个细胞内吞，然后呈递给第三方细胞。据报道il15ra提高凋亡抑制剂bcl2l1/bcl2
‑
xl和bcl2的细胞增殖和表达。ng_029605.2中提供了il
‑
15的示例性序列，并且nm_002189.4中提供了il
‑
15ra的示例性序列。
[0344]
il
‑
15是促进nk细胞生长和记忆t细胞的稳态维持的关键细胞因子。il
‑
15及其受体链il
‑
15ra对nk存活至关重要，并且不刺激调节性t细胞。il
‑
15/il
‑
15ra与il
‑
2受体的β和γ亚基结合，从而激活jak1/3和stat5。在一些实施例中，本披露的经修饰的细胞(例如，nk细胞)表达外源il
‑
15/il
‑
15ra。在一些实施例中，外源il
‑
15/il
‑
15ra表达为膜结合的il15.il15ra复合物，如描述于imamura等人,blood[血液].2014年8月14日；124(7):1081
‑
8和hurton lv等人,pnas,2016；通过引用以其整体并入本文。在一些实施例中，外源il
‑
15/il
‑
15ra表达为可溶性il15ra.il15复合物，如描述于mortier e等人,jbc 2006；bessard a,mol cancer ther[分子癌症治疗学]2009；和desbois m,ji 2016；通过引用以其整体并入本文。在一些实施例中，本披露的经修饰的细胞(例如，nk细胞)表达膜结合的il15.il15ra复合物和可溶性il15ra.il15复合物。在一些实施例中，本披露的经修饰的细胞(例如，nk细胞)表达具有可裂解的接头的il15.il15ra复合物的膜结合形式。cish的敲除与进一步促进il
‑
15信号传导相关，如描述于delconte p,nat immunol[自然免疫学]2016；通过引用以其整体并入本文。在一些实施例中，本披露的经修饰的细胞(例如，nk细胞)表达cish的功能丧失。在一些实施例中，本披露的经修饰的细胞(例如，nk细胞)表达外源il
‑
15/il
‑
15ra和cish的功能丧失。
[0345]
如本文所用，术语“adora2a”是指腺苷a2a受体编码鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(g蛋白)偶联受体(gpcr)的超家族的成员，其被细分为类别和亚型。这些受体是七程跨膜蛋白，其响应细胞外提示并激活细胞内信号转导路径。该蛋白质是a2a亚型的腺苷受体，用腺苷作为优选的内源激动剂，优先与g蛋白的g(s)和g(olf)家族相互作用，以增加细胞内camp水平。它在许多生物学功能中起着重要作用，如心脏节律和循环、脑和肾血流、免疫功能、疼痛调控和睡眠。它与病理生理学病症有牵连，如炎症性疾病和神经变性障碍。ng_052804.1中提供了adora2a的示例性序列。
[0346]
如本文所用，术语“b2m”(β2微球蛋白)是指发现与几乎全部有核细胞表面的主要组织相容性复合体(mhc)i类重链相关的血清蛋白。该蛋白质具有主要的β
‑
折叠片结构，可在一些病理条件下形成淀粉样蛋白原纤维。编码的抗微生物蛋白在羊水中显示抗菌活性。b2m的示例性序列阐述为ng_012920.2。
[0347]
如本文所用，术语“cd32b”是指低亲和力免疫球蛋白γfc区受体ii
‑
b蛋白，在人体中由fcgr2b基因编码。参见，例如，rankin
‑
ct等人,cd32b,the human inhibitory fc
‑
gamma receptor iib,as a target for monoclonal antibody therapy of b
‑
cell lymphoma[cd32b，人抑制性fc
‑
γ受体iib，作为b细胞淋巴瘤的单克隆抗体疗法的靶标].blood[血液]2006 108(7):2384
‑
91，其全部内容通过引用并入本文。
[0348]
如本文所用，术语“cd47”有时也称为“整联蛋白相关蛋白”(iap)，是指在人体中由cd47基因编码的跨膜蛋白。cd47属于免疫球蛋白超家族，与膜整联蛋白为配偶体，并且还结合配体血小板反应蛋白
‑
1(tsp
‑
1)和信号调节蛋白α(sirpα)。cd47用作巨噬细胞的信号，允许cd47表达细胞逃避巨噬细胞攻击。参见，例如，deuse
‑
t等人,nature biotechnology[自然生物技术]2019 37:252
‑
258，其全部内容通过引用并入本文。
[0349]
如本文所用，术语“hla
‑
e”是指hla i类组织相容性抗原，α链e，有时也称为mhc i类抗原e。在人体中hla
‑
e蛋白由hla
‑
e基因编码。人hla
‑
e是一种非经典的mhc i类分子，其特征在于有限的多态性和比其经典旁系同源物低的细胞表面表达。该i类分子是由重链和
轻链(β
‑
2微球蛋白)组成的异二聚体。重链锚固在膜中。hla
‑
e结合由其他i类分子的前导肽衍生的限制性肽子集。hla
‑
e表达细胞逃避同种异体应答和nk细胞的裂解。参见，例如，geornalusse
‑
g等人,nature biotechnology[自然生物技术]2017 35(8)，其全部内容通过引用并入本文。nm_005516.6中提供了hla
‑
e蛋白的示例性序列。
[0350]
在一些实施例中，在本文提供的经修饰的淋巴细胞中两种或更多种hla ii类组织相容性抗原α链基因和/或两种或更多种hla ii类组织相容性抗原α链基因被敲除，例如通过基因组编辑。例如，在一些实施例中，选自hla
‑
dqa1、hla
‑
dra、hla
‑
dpa1、hla
‑
dma、hla
‑
dqa2、和hla
‑
doa的两种或更多种hla ii类组织相容性抗原α链基因被敲除。再如，在一些实施例中，选自hla
‑
dmb、hla
‑
dob、hla
‑
dpb1、hla
‑
dqb1、hla
‑
dqb3、hla
‑
dqb2、hla
‑
drb1、hla
‑
drb3、hla
‑
drb4、和hla
‑
drb5的两种或更多种hla ii类组织相容性抗原β链基因被敲除。参见，例如，crivello等人,j immunol[免疫学杂志]2019年1月,ji1800257；doi:https://doi.org/10.4049/jimmunol.1800257，其全部内容通过引用并入本文。
[0351][0352]
如本文所用，术语“hla
‑
g”是指hla非经典的i类重链旁系同源物。该i类分子是由重链和轻链(β
‑
2微球蛋白)组成的异二聚体。重链锚固在膜中。hla
‑
g在胎源胎盘细胞上表达。hla
‑
g是nk细胞抑制性受体kir2dl4的配体，因此通过滋养层，这种hla的表达使其防御nk细胞介导的死亡。参见，例如favier等人,tolerogenic function of dimeric forms of hla
‑
g recombinant proteins:a comparative study in vivo[hla
‑
g重组蛋白二聚体形式的耐受原功能：体内比较性研究]plos one[公共科学图书馆
·
综合]2011，其全部内容通过引用并入本文。hla
‑
g的示例性序列阐述为ng_029039.1。
[0353]
如本文所用，术语“ciita”是指位于核中的蛋白质，其充当ii类主要组织相容性复合体基因转录的正调节子，并且被称为表达这些基因的“主控制因子”。该蛋白质还结合gtp并使用gtp结合促进其自身运输进入核中。一旦在核中，它就不会结合dna，而是使用固有乙酰转移酶(at)活性以共激活物样方式起作用。该基因中的突变已与裸淋巴细胞综合征ii型(也称为遗传性mhc ii类缺乏或hla ii类缺乏联合免疫缺陷)相关，对类风湿性关节炎、多发性硬化和可能的心肌梗死的易感性增加。参见，例如，chang等人,j exp med[实验医学杂志]180:1367
‑
1374；和chang等人,immunity[免疫力].1996年2月；4(2):167
‑
78，其每一项的全部内容通过引用并入本文。ciita的示例性序列阐述为ng_009628.1。
[0354]
如本文所用，术语“pd1”程序性细胞死亡蛋白1，也称为cd279(分化簇279)，是指在细胞表面上发现的蛋白质，其具有以下作用：通过下调免疫系统来调节免疫系统对人体细胞的应答，以及通过抑制t细胞炎症活性来促进自身耐受。这可以预防自身免疫疾病，但也可阻止免疫系统杀死癌细胞。pd
‑
1是免疫检查点，通过两种机制来防范自身免疫性。首先，它促进淋巴结中抗原特异性t细胞的凋亡(程序性细胞死亡)。其次，它减少了调节性t细胞(抗炎性、抑制性t细胞)的凋亡。pd1的示例性序列阐述为nm_005018.3。
[0355]
如本文所用，术语“tigit”是指蛋白质免疫球蛋白的pvr(脊髓灰质炎病毒受体)家族的一种成员。该基因的产物在几类t细胞上表达，包括滤泡b辅助t细胞(tfh)。已显示该蛋白质以高亲和力结合pvr；认为这种结合有助于协助tfh和树突细胞之间的相互作用，以调节t细胞依赖性b细胞应答。nm_173799.4中阐述了tigit的示例性序列。
[0356]
如本文所用，术语“nlrc5”是指含card结构域的nod样受体家族5细胞内蛋白，其在
免疫系统中起作用。nlrc5是通过调节干扰素活性潜在地与对病毒的先天免疫牵连的模式识别受体。nlrc5的示例性序列阐述为nm_032206.4。
[0357]
如本文所用，术语“ctla4”是指免疫球蛋白超家族的成员，其将抑制信号传递给t细胞。该蛋白质含有v结构域、跨膜结构域和细胞质尾。ctla4的示例性序列阐述为af414120.1。
[0358]
如本文所用，术语“lag3”是指淋巴细胞激活蛋白3，其属于ig超家族，并含有4个细胞外ig样结构域。lag3的示例性序列阐述为nm_002286.6。
[0359]
如本文所用，术语“cblb”是指通过将泛素从e2泛素缀合酶转移到底物中促进蛋白质体介导的蛋白质降解的e3泛素
‑
蛋白质连接酶。编码的蛋白质通过限制t细胞受体、b细胞受体和高亲和力免疫球蛋白ε受体激活而涉及在免疫应答的调节中。cblb的示例性序列阐述为kr 709533.1。
[0360]
如本文所用，术语“nkg2a”是指属于杀伤细胞凝集素样受体家族的蛋白质，该受体家族也称为nkg2家族，是优先在nk细胞中表达的一组跨膜蛋白。该蛋白质家族的特征在于ii型膜取向和c型凝集素结构域的存在。该蛋白质与另一个家庭成员klrd1/cd94形成复合物，并与识别nk细胞中的mhc i类hla
‑
e分子有牵连。参见，例如，kamiya
‑
t等人,j clin invest[临床研究杂志]2019https://doi.org/10.1172/jci123955，其全部内容通过引用并入本文。nkg2a的示例性序列阐述为af461812.1。
[0361]
如本文所用，术语“ccr5”是指β趋化因子受体家族的成员，其被预测是类似于g蛋白偶联受体的七重跨膜蛋白。该蛋白质由t细胞和巨噬细胞表达，并且已知是巨噬细胞嗜性病毒(包括hiv)进入宿主细胞的重要共受体。ccr5的示例性序列阐述为u54994.1。
[0362]
如本文所用，术语“socs”是指抑制jak
‑
stat信号传导路径所涉及的基因家族。
[0363]
如本文所用，术语“bim”是指bcl
‑
2蛋白家族的促凋亡成员，其与bcl
‑
2蛋白家族的其他成员(包括bcl2、bcl2l1/bcl
‑
x(l)和mcl1)相互作用，并充当凋亡激活剂。
[0364]
如本文所用，术语“fas”是指tnf受体超家族的成员。该受体含有死亡结构域。已经显示它在程序性细胞死亡的生理调节中发挥核心作用。
[0365]
如本文所用，术语“gitr”是指肿瘤坏死因子受体超家族成员18(tnfrsf18)，也称为激活诱导型tnfr家族受体(aitr)或糖皮质激素诱导的tnfr相关蛋白。它涉及于激活的t淋巴细胞和内皮细胞之间的相互作用以及t细胞受体介导的细胞死亡调节中。
[0366]
如本文所用，术语“分拣蛋白”是指vps10相关的蛋白质分拣蛋白家族。
[0367]
如本文所用，术语“tim3”是指t细胞含免疫球蛋白和粘蛋白结构域蛋白
‑
3(tim
‑
3)，在人体中由havcr2基因编码。
[0368]
如本文所用，术语“cd96”或“tactile”是指i型膜蛋白，其在免疫应答的后期期间在激活的t和nk细胞的粘附相互作用中发挥作用。
[0369]
如本文所用，术语“il1r8”是指白细胞介素1受体家族的成员，并且类似于白细胞介素1辅助蛋白。
[0370]
如本文所用，术语“kir2dl1”、“kir2dl2”和“kir2dl3”是指杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kir)，其是由自然杀伤细胞和t细胞亚群表达的跨膜糖蛋白。
[0371]
如本文所用，术语“cdk8”是指细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(cdk)家族的成员，其用作细胞周期进展的调节子。
[0372]
如本文所用，术语“cxcr3”是指对称为cxcl9/mig(干扰素
‑
g诱导的单核因子)、cxcl10/ip10(干扰素
‑
g诱导型10kda蛋白)和cxcl11/i
‑
tac(干扰素诱导型t细胞a
‑
化学引诱物)的三种趋化因子具有选择性的g蛋白偶联受体。
[0373]
如本文所用，术语“ccr7”是指g蛋白偶联受体家族的成员。该受体在各种淋巴组织中表达并激活b和t淋巴细胞。
[0374]
如本文所用，术语“ep4”是指g
‑
蛋白偶联受体家族的成员。该蛋白质是针对前列腺素e2(pge2)鉴定的四种受体之一。该受体可以激活t细胞因子信号传导。
[0375]
如本文所用，术语“il
‑
2”是指白细胞介素
‑
2，对于t和b淋巴细胞的增殖而言重要的一种分泌的细胞因子。
[0376]
如本文所用，术语“il
‑
12”是指白细胞介素
‑
12，作用于t细胞和自然杀伤细胞的一种细胞因子。
[0377]
如本文所用，术语“il
‑
18”是指白细胞介素
‑
18，主要涉及于极化的t辅助细胞1(th1)和自然杀伤细胞(nk)免疫应答中的一种促炎性细胞因子。
[0378][0379]
如本文所用，术语“cxcr1”是指g
‑
蛋白偶联受体家族的成员。该蛋白质是白细胞介素8(il8)的受体。
[0380]
如本文所用，术语“cx3cr1”是指白细胞粘附和迁移所涉及的一种跨膜蛋白和趋化因子。
[0381]
如本文所用，术语“mtrail”是指属于肿瘤坏死因子(tnf)配体家族的细胞因子。该蛋白质优先诱导转化和肿瘤细胞中的凋亡。
[0382]
如本文所用，术语“toso”是指igm受体的fc片段
[0383]
如本文所用，术语“cd16”是指免疫球蛋白g的fc部分的受体，并且涉及于从循环中去除抗原抗体复合物以及其他抗体依赖性应答中。
[0384]
在一些实施例中，本文提供了经修饰的细胞，其表现出trac的功能丧失。术语“trac”是指由trac基因座编码的t细胞受体α亚基(恒定区)。表现出trac的功能丧失的细胞不表达t细胞受体(tcr)。在一些实施例中，本文提供了经修饰的细胞，例如，多潜能或多能干细胞或其分化子细胞(例如，ink细胞)，其衍生自表达tcr的细胞或衍生自具有重排的内源tcr基因座的细胞，例如，衍生自t细胞。在一些实施例中，这种细胞包含实现trac的功能丧失的修饰，因此不表达功能性tcr。基于本披露，用于实现trac的功能丧失的适合的方法和组合物对本领域普通技术人员而言是显而易见的。这些方法和组合物包括但不限于以下中披露的那些：pct申请pct/us 2015/026504，标题为“crispr
‑
cas
‑
related methods,compositions and components for cancer immunotherapy[用于癌症免疫疗法的crispr
‑
cas相关方法、组合物和组分]”；pct申请pct/us 2016/024353，标题为“crispr
‑
cas
‑
related methods,compositions and components[crispr
‑
cas相关方法、组合物和组分]”；和pct申请pct/us 2017/020598，标题为“crispr
‑
cpf1
‑
related methods,compositions and components for cancer immunotherapy[用于癌症免疫疗法的crispr
‑
cpf1相关方法、组合物和组分]”；其每一项的全部内容通过引用并入本文。
[0385]
本披露具体包括上述基因和car的变体，包括与上述鉴定的基因序列具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％百分比同一性
的变体。如本文所用，术语“百分比(％)序列同一性”或“百分比(％)同一性”(也包括“同源性”)定义为在用以实现最大百分比序列一致性并且不将任何保守取代视为序列一致性的一部分而比对序列和引入缺口(如果需要)后，候选序列中与参考序列中的氨基酸残基或核苷酸相同的氨基酸残基或核苷酸的百分比。除了手动进行，还可以通过以下来产生比较序列的最佳比对：smith和waterman,1981,ads app.math.[应用数学进展]2,482的局部同源算法；neddleman和wunsch,1970,j.mol.biol.[分子生物学杂志]48,443的局部同源算法；pearson和lipman,1988,proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]85,2444的相似性搜索方法；或使用这些算法的计算机程序(威斯康星州麦迪逊科学路575号遗传学计算机组的威斯康星遗传学软件包(wisconsin genetics software package,genetics computer group,575science drive,madison,wis.)中的gap、bestfit、fasta、blast p、blast n和tfasta)。
[0386]
敲入和敲除可以通过本领域技术人员已知的基因组编辑技术进行，包括crispr/cas技术。单切割以及多重编辑策略适合于实现本文提供的所需产物配置，并且这种策略在本文中描述或另外为本领域普通技术人员所知。
[0387]
在一些实施例中，评估示例性的经修饰的细胞(例如经修饰的多潜能细胞或其分化后代，例如ink细胞或其他经修饰的淋巴细胞类型)逃避非自体宿主(例如需要免疫疗法的患者)的免疫系统的能力。在一些实施例中，这种评估包括体外测定。用于这种评估的适合的体外测定是相关领域普通技术人员已知的，并且包括但不限于混合淋巴细胞反应性(mlr)测定。该测定和其他适合的测定描述于例如abbas等人,cellular and molecular immunology[细胞和分子免疫学],第7版,isbn 9781437735734，其全部内容通过引用并入本文。鉴于本披露，其他适合的测定对技术人员而言将是显而易见的。使用方法
[0388]
通过将本发明的经修饰的细胞引入受试者可以改善多种疾病。疾病的实例包括但不限于癌症，包括但不限于实体瘤，包括但不限于脑、前列腺、乳腺、肺、结肠、子宫、皮肤、肝脏、骨、胰腺、卵巢、睾丸、膀胱、肾、头、颈、胃、宫颈、直肠、喉或食道的肿瘤；和恶性血液病，包括但不限于急性和慢性白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤和骨髓发育异常综合征。
[0389]
本发明的特定实施例涉及通过向受试者施用包含本文所述的任何细胞的组合物来治疗有需要的受试者的方法。在特定实施例中，本文使用的术语“治疗(treating/treatment)”等通常意指获得所需的药理学和/或生理学效果。在完全或部分地预防疾病方面，效果可以是预防性的，并且在疾病和/或归因于疾病的不良影响的部分或完全治愈方面，可以是治疗性的。如本文所用，“治疗”涵盖哺乳动物中的任何疾病的治疗，并且包括：预防该疾病发生在可能易患该疾病但尚未被诊断患有该疾病的受试者中；抑制该疾病，即阻止其发展；或缓解疾病，即引起疾病消退。治疗剂或组合物可以在疾病或损伤开始之前、期间或之后施用。对正在发生的疾病进行的稳定或减少患者的不良临床症状的治疗是特别感兴趣的。
[0390]
在特定实施例中，受试者患有可通过细胞疗法治疗、改善和/或改进的疾病、病症和/或损伤。一些实施例涵盖以下，需要细胞疗法的受试者是患有损伤、疾病或病症的受试者，而细胞疗法(例如将细胞材料施用于受试者的疗法)可以治疗、改善、改进、和/或减少与该损伤、疾病或病症相关的至少一种症状的严重程度。某些实施例涵盖以下，需要细胞疗法
的受试者包括但不限于骨髓或干细胞移植的候选者、接受化疗或照射疗法的受试者、患有过度增殖性障碍或癌症(例如过度增殖性障碍或造血系统的癌症)或者有患此的风险的受试者、患有肿瘤(例如实体肿瘤)或有发展此的风险的受试者、患有病毒感染或与病毒感染相关的疾病或者有患此的风险的受试者。
[0391]
因此，本发明进一步提供了包含通过本文披露的方法和组合物制备的多潜能细胞衍生的造血谱系细胞的药物组合物，其中药物组合物进一步包含药学上可接受的介质。在一些实施例中，药物组合物包含通过本文披露的方法和组合物制备的多潜能细胞衍生的t细胞。在一些实施例中，药物组合物包含通过本文披露的方法和组合物制备的多潜能细胞衍生的nk细胞。在一些实施例中，药物组合物包含通过本文披露的方法和组合物制备的多潜能细胞衍生的cd34 he细胞。在一些实施例中，药物组合物包含通过本文披露的方法和组合物制备的多潜能细胞衍生的hsc。
[0392]
另外，本发明提供了上述药物组合物的治疗用途，是通过将组合物引入适合于过继性细胞疗法的受试者，其中受试者患有自身免疫障碍；恶性血液病；实体瘤；或与hiv、rsv、ebv、cmv、腺病毒或bk多瘤病毒相关的感染。
[0393]
分离的多潜能干细胞衍生的造血谱系细胞可具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％t细胞、nk细胞、nkt细胞、cd34 he细胞或hsc。在一些实施例中，分离的多潜能干细胞衍生的造血谱细胞具有约95％至约100％t细胞、nk细胞、nkt细胞、cd34 he细胞或hsc。在一些实施例中，本发明提供了具有纯化的t细胞、nk细胞、nkt细胞、cd34 he细胞或hsc的药物组合物，如具有约95％t细胞、nk细胞、nkt细胞、cd34 he细胞或hsc的分离的细胞群的组合物，用以治疗需要细胞疗法的受试者。
[0394]
在一些实施例中，药物组合物包含多潜能干细胞衍生的造血谱系细胞的分离的细胞群，其中的细胞群具有少于约0.1％、0.5％、1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、或30％ipsc衍生的t细胞、nk细胞、nkt细胞、cd34 he细胞或hsc。在一些实施例中，衍生的造血谱系细胞的分离的细胞群可具有超过约0.1％、0.5％、1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％或30％t细胞、nk细胞、nkt细胞、cd34 he细胞或hsc。在其他实施例中，衍生的造血谱系细胞的分离的细胞群可具有约0.1％至约1％、约1％至约3％、约3％至约5％、约10％
‑
约15％、约15％
‑
20％、约20％
‑
25％、约25％
‑
30％、约30％
‑
35％、约35％
‑
40％、约40％
‑
45％、约45％
‑
50％、约60％
‑
70％、约70％
‑
80％、约80％
‑
90％、约90％
‑
95％、或约95％至约100％t细胞、nk细胞、nkt细胞、cd34 he细胞或hsc。
[0395]
在特定实施例中，衍生的造血谱系细胞可具有约0.1％、约1％、约3％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约98％、约99％或约100％t细胞、nk细胞、nkt细胞、cd34 he细胞或hsc。
[0396]
如本领域普通技术人员将理解的，自体和同种异体的免疫细胞均可用于细胞疗法。自体细胞疗法可减少感染、降低gvhd的概率并快速免疫重建。同种异体细胞疗法可具有免疫介导的移植物抗恶性病(gvm)效应并降低复发率。基于需要细胞疗法的患者或受试者的特定状况，本领域普通技术人员将能够确定施用哪种特定疗法。
[0397]
在特定实施例中，本发明的药物组合物的衍生的造血谱系细胞对受试者而言是同种异体的。在特定实施例中，本发明的药物配制品的衍生的造血谱系细胞对受试者而言是
自体的。对于自体移植，衍生的造血谱系细胞的分离的细胞群与患者完全或部分hla匹配。在另一个实施例中，衍生的造血谱系细胞并非与受试者hla匹配。
[0398]
可以将通过本发明提供的衍生的造血谱系细胞向受试者施用而不在施用之前离体或体外扩增。在特定实施例中，使用一种或多种处理剂调节和离体处理衍生的造血谱系细胞的分离的细胞群，以获得具有改进的治疗潜力的免疫细胞。可以洗涤经调节的衍生的造血谱系细胞以除去一种或多种处理剂，并将经改进的细胞群施用给患者，而不进一步体外扩增该细胞群。
[0399]
在其他实施例中，本发明提供了衍生的造血谱系细胞的分离的细胞群，该细胞群在用一种或多种处理剂调节t淋巴细胞的分离的细胞群或子群之前进行了扩增。可以重组产生衍生的造血谱系细胞的分离的细胞群，以表达tcr、car或其他蛋白质。
[0400]
对于表达重组tcr或car的基因工程化的衍生的造血谱系细胞，无论在细胞的遗传修饰之前或之后，这些细胞可以使用例如在以下文献中描述的方法激活和扩增：美国专利号6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美国专利申请公开号20060121005。癌症
[0401]
作为本披露的适合的治疗靶标的癌症包括来自膀胱、血液、骨、骨髓、脑、乳腺、结肠、食道、眼睛、胃肠、牙龈、头、肾、肝脏、肺、鼻咽、颈、卵巢、前列腺、皮肤、胃、睾丸、舌或子宫的癌细胞。此外，癌症可以具体是以下组织学类型，尽管它不限于这些：恶性赘生物；癌；未分化癌；巨细胞癌和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛母质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；恶性胃泌素瘤；胆管癌；肝细胞癌；混合性肝细胞癌和胆管癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉的腺癌；家族性息肉病的腺癌；实体癌；恶性类癌；细支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌(chromophobe carcinoma)；嗜酸细胞癌(acidophil carcinoma)；嗜酸性细胞腺癌(oxyphilic adenocarcinoma)；嗜碱性粒细胞癌；透明细胞腺癌；粒细胞癌；滤泡状腺癌；乳头状和滤泡状腺癌；非包裹性硬化性癌(nonencapsulating sclerosing carcinoma)；肾上腺皮质癌；内膜样癌；皮肤附属器癌；大汗腺腺癌(apocrine adenocarcinoma)；皮脂腺癌；耵聍腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；黏液性囊腺癌；黏液性腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；乳腺佩吉特氏病；腺泡细胞癌；腺鳞癌；伴有鳞状化生的腺癌；恶性胸腺瘤；恶性卵巢基质肿瘤；恶性泡膜细胞瘤；恶性粒细胞瘤；恶性男性母细胞瘤；支持细胞癌(sertoli cell carcinoma)；恶性莱迪希细胞瘤；恶性脂质细胞瘤(lipid cell tumor)；恶性副神经节瘤；恶性乳腺外副神经节瘤；嗜铬细胞瘤；血管球瘤；恶性黑素瘤；无黑素性黑素瘤；浅表扩散性黑素瘤；巨色素痣的恶性黑素瘤；上皮样细胞黑素瘤；恶性蓝痣；肉瘤；纤维肉瘤；恶性纤维组织细胞瘤；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；肺泡型横纹肌肉瘤；间质肉瘤；恶性混合瘤；缪勒混合瘤；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；恶性间质瘤；恶性布伦纳瘤；恶性乳腺叶状肿瘤；滑膜肉瘤；恶性间皮瘤；无性细胞瘤；胚胎性癌；恶性畸胎瘤；恶性卵巢甲状腺瘤；绒毛膜癌；恶性中肾瘤；血管肉瘤；恶性血管内皮瘤；卡波西肉瘤；恶性血管外皮细胞瘤；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质旁成骨肉瘤；软骨肉瘤；恶性成软骨细胞瘤；间充质软骨肉瘤；骨巨细胞肿瘤；
尤因肉瘤；恶性牙源性肿瘤；成釉细胞牙肉瘤；恶性成釉细胞瘤；成釉细胞纤维肉瘤；恶性松果体瘤；脊索瘤；恶性胶质瘤；室管膜细胞瘤；星形细胞瘤；原生质性星形细胞瘤；纤维型星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突神经胶质瘤；成少突神经胶质瘤；原始神经外胚层瘤；小脑肉瘤；节细胞性神经母细胞瘤；神经母细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；恶性脑膜瘤；神经纤维肉瘤；恶性神经鞘瘤；恶性粒细胞瘤；恶性淋巴瘤；霍奇金氏病；霍奇金氏淋巴瘤；副肉芽肿；恶性小淋巴细胞性淋巴瘤；恶性弥漫性大细胞淋巴瘤；恶性滤泡状淋巴瘤；蕈样肉芽肿；其他指定的非霍奇金氏淋巴瘤；恶性组织细胞增多症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增殖性小肠疾病；白血病；淋巴性白血病；浆细胞性白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；骨髓性白血病；嗜碱性粒细胞白血病；嗜酸性粒细胞白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血病；成巨核细胞白血病；髓样肉瘤；和毛细胞白血病。
[0402]
在一些实施例中，癌症是乳腺癌。在另一个实施例中，癌症是结肠癌。在另一个实施例中，癌症是胃癌。在另一实施例中，癌症是rcc。在另一个实施例中，癌症是非小细胞肺癌(nsclc)。
[0403]
在一些实施例中，可以用本文提供的经修饰的nk细胞(单独或与一种或多种另外的癌症治疗方式组合)治疗的实体癌症适应症包括：膀胱癌、肝细胞癌、前列腺癌、卵巢癌/子宫癌、胰腺癌、间皮瘤、黑素瘤、胶质母细胞瘤、hpv相关和/或hpv阳性癌症如宫颈癌和hpv 头颈癌、口腔癌、咽癌、甲状腺癌、胆囊癌和软组织肉瘤；
[0404]
在一些实施例中，可以用本文提供的经修饰的nk细胞治疗的血液学癌症适应症(单独或与一种或多种另外的癌症治疗方式组合)包括：all、cll、nhl、dlbcl、aml、cml、多发性骨髓瘤(mm)。
[0405]
如本文所用，术语“癌症”(也可与术语“过度增殖”和“赘生”互换使用)是指具有自主生长能力的细胞，即由快速增殖细胞生长表征的异常状态或病症。癌性疾病状态可以分类为病理性，即表征或构成疾病状态，例如恶性肿瘤生长，或者可以被分类为非病理性，即偏离正常但与疾病状态无关，例如与伤口修复相关的细胞增殖。该术语意在包括所有类型的癌性生长或致癌过程，转移组织或恶性转化细胞、组织或器官，而不论组织病理学类型或侵袭性阶段如何。术语“癌症”包括各种器官系统的恶性病，如影响肺、乳腺、甲状腺、淋巴、胃肠道和泌尿道的那些，以及包括以下恶性病的腺癌，如大多数结肠癌、肾细胞癌、前列腺癌和/或睾丸肿瘤、非小细胞肺癌、小肠癌和食道癌。术语“癌”是本领域公认的，并指上皮或内分泌组织的恶性病，包括呼吸系统癌、胃肠系统癌、泌尿生殖系统癌、睾丸癌、乳腺癌、前列腺癌、内分泌系统癌和黑素瘤。示例性癌包括由宫颈、肺、前列腺、乳腺、头和颈、结肠和卵巢的组织形成的癌。术语“癌”还包括癌肉瘤，例如，其包括由癌性和肉瘤性组织组成的恶性肿瘤。“腺癌”是指衍生自腺体组织的癌或其中肿瘤细胞形成可识别的腺体结构的癌。术语“肉瘤”是本领域公认的，并且是指间充质衍生的恶性肿瘤。
[0406]
肺的细胞增殖和/或分化障碍的实例包括但不限于肿瘤，如支气管源性癌，包括副肿瘤综合征、细支气管肺泡癌，神经内分泌肿瘤如支气管癌，混合性肿瘤，转移性肿瘤和胸膜肿瘤，包括孤立性纤维肿瘤(胸膜纤维瘤)和恶性间皮瘤。
[0407]
乳腺细胞增殖和/或分化障碍的实例包括但不限于增殖性乳腺疾病，包括例如上皮增生、硬化性腺病和小导管乳头状瘤(small duct papillomas)；肿瘤，例如基质肿瘤，如纤维腺瘤、乳腺叶状肿瘤和肉瘤，以及上皮肿瘤，如大导管乳头状瘤；乳腺癌，包括原位(非
侵袭性)癌，其包括导管原位癌(包括佩吉特氏病)和原位小叶癌，以及侵袭性(浸润性)癌，包括但不限于侵袭性导管癌、侵袭性小叶癌、髓样癌、胶样(黏液性)癌、小管癌和侵袭性乳头状癌，以及混合性恶性赘生物。雄性乳腺的障碍包括但不限于男性乳房增大和癌。
[0408]
涉及结肠的细胞增殖和/或分化障碍的实例包括但不限于结肠肿瘤，如非赘生性息肉、腺瘤、家族性综合征、结直肠癌发生、结直肠癌和类癌肿瘤。
[0409]
除了上述那些之外，癌症或赘生性病症的实例包括但不限于纤维肉瘤、肌肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮细胞肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、胃癌、食管癌、直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、子宫癌、头颈癌、皮肤癌、脑癌、鳞状细胞癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管源性癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、威尔姆氏肿瘤、宫颈癌、睾丸癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜细胞瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、白血病、淋巴瘤或卡波西肉瘤。
[0410]
在此背景下，考虑到的有用的次要或辅助治疗剂包括但不限于：化学治疗剂包括烷基化剂，如噻替派和环磷酰胺；烷基磺酸酯，如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮杂环丙烷，如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙烯亚胺和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲蜜胺(trimethylomelamine)；多聚乙酰(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；δ
‑9‑
四氢大麻酚(屈大麻酚，)；β
‑
拉帕醌；拉帕醇；秋水仙碱；桦木酸；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康cpt
‑
11(伊立替康，)、乙酰喜树碱、东莨菪碱和9
‑
氨基喜树碱)；苔藓抑素；卡利他汀(callystatin)；cc
‑
1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；鬼臼毒素；鬼臼酸；替尼泊苷；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；尾海兔素；多拉司他汀(duocarmycin)(包括合成类似物、kw
‑
2189和cb1
‑
tm1)；艾榴素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑制素(spongistatin)；氮芥(例如苯丁酸氮芥)、萘氮芥、氯磷酰胺(chlorophosphamide)、雌氮芥、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、盐酸氧化氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑、新恩比兴、苯芥胆甾醇(phenesterine)、松龙苯芥、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲例如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，如烯二炔抗生素(例如，卡奇霉素(calicheamicin)，尤其卡奇霉素γ1i和卡奇霉素ωl1(参见，例如，agnew,chem.intl.ed.engl.,33:183
‑
186(1994))；达内霉素，包括达内霉素a；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素生色团(neocarzinostatin chromophore)和相关的色素蛋白烯二炔抗生素生色团)、阿克拉霉素、放射菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素c(cactinomycin)、卡拉比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌素、色霉素、放线菌素d、道诺霉素、地托比星、6
‑
重氮
‑5‑
氧代
‑
l
‑
正亮氨酸、多柔比星(包括吗啉代
‑
多柔比星、氰基吗啉代
‑
多柔比星、2
‑
吡咯啉代
‑
多柔比星、多柔比星hcl脂质体注射液
和脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素(如丝裂霉素c)、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、紫菜霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢药，如甲氨蝶呤、吉西他滨替加氟卡培他滨埃博霉素和5
‑
氟尿嘧啶(5
‑
fu)；叶酸类似物，如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、曲美沙特；嘌呤类似物，如氟达拉滨、6
‑
巯嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如安西他滨、阿扎胞苷、6
‑
氮尿苷、卡莫氟、阿糖孢苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素，如卡鲁睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺，如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；蒽尿嘧啶；安吖啶；贝拉布昔(bestrabucil)；比生群；伊达曲杀(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛；地吖醌；伊尔福尼辛(elformithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；乙环氧啶；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美登醇，如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；2
‑
乙肼；甲基苄肼；多糖复合物(jhs天然产物公司(jhs natural products)，尤金(eugene)，俄勒冈州)；雷佐生；根霉素；西佐喃；螺旋锗；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三乙撑亚胺苯醌；2,2’,2
”‑
三氯三乙胺；单端孢霉烯族毒素(trichothecene)(尤其是t
‑
2毒素、疣孢菌素a、杆孢菌素a和anguidine)；尿烷；长春地辛达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；甲托辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(“ara
‑
c”)；噻替派；紫杉烷，例如紫杉醇紫杉醇的白蛋白工程化纳米颗粒配制品(abraxanet
tm
)和多西紫杉醇苯丁酸氮芥；6
‑
硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，如顺铂和卡铂；长春花碱铂；依托泊苷(vp
‑
16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱奥沙利铂；亚叶酸(leucovovin)；长春瑞滨诺消灵；依达曲沙；道诺霉素；氨喋呤；环孢霉素、西罗莫司、雷帕霉素、雷帕罗格、伊班膦酸盐；拓扑异构酶抑制剂rfs 2000；二氟甲基鸟氨酸(dmfo)；类维生素a，如视黄酸；chop，即环磷酰胺、多柔比星、长春花碱和泼尼松龙组合疗法的缩写，以及folfox，即奥沙利铂(eloxatin
tm
)与5
‑
fu、亚叶酸组合的治疗方案的缩写；抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(serm)，包括例如他莫昔芬(包括他莫昔芬)、雷洛昔芬屈洛昔芬、4
‑
羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、克沃西芬(keoxifene)、ly117018、奥那司酮和托瑞米芬抗孕激素；雌激素受体下调剂(erd)；雌激素受体拮抗剂，如氟维司群发挥作用以抑制或关闭卵巢的剂，例如，黄体生成素
‑
释放激素(lhrh)激动剂，如醋酸亮丙瑞林(和)、醋酸戈舍瑞林、醋酸布舍瑞林和曲普瑞林；其他抗雄激素，如氟他胺、尼鲁米特和比卡鲁胺；和芳香酶抑制剂，其抑制酶芳香酶，该芳香酶调节肾上腺中的雌激素产生，如例如，4(5)
‑
咪唑、氨鲁米特、醋酸甲地孕酮
依西美坦福美坦、法倔唑、伏氯唑来曲唑和阿那曲唑二膦酸盐，如氯膦酸盐(例如，或)、依替膦酸盐ne
‑
58095，唑来膦酸/唑来膦酸盐阿伦膦酸盐帕米膦酸盐替鲁膦酸盐或利塞膦酸盐曲沙他滨(1,3
‑
二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；适体，例如在通过引用以其整体并入本文的美国专利号6,344,321中描述的；抗hgf单克隆抗体(例如，来自阿韦奥公司(aveo)的av299、来自安进公司(amgen)的amg102)；截短的mtor变体(例如，来自compugen的cgen241)；蛋白激酶抑制剂，其阻断mtor诱导的路径(例如，来自阿库利公司(arqule)的arq197、来自埃克利西斯公司(exelexis)的xl880、来自sgx制药公司(sgx pharmaceuticals)的sgx523、来自超基因公司(supergen)的mp470、来自辉瑞公司(pfizer)的pf2341066)；疫苗，如疫苗和基因疗法疫苗，例如疫苗、疫苗和疫苗；拓扑异构酶1抑制剂(例如，)；rmrh(例如，)；二甲苯磺酸拉帕替尼(erbb
‑
2和egfr双酪氨酸激酶小分子抑制剂，也称为gw572016)；cox
‑
2抑制剂，如塞来昔布(4
‑
(5
‑
(4
‑
甲基苯基)
‑3‑
(三氟甲基)
‑
1h
‑
吡唑
‑1‑
基)苯磺酰胺；以及上述任一项的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
[0411]
有效于治疗癌症的其他化合物在本领域中是已知的，并且本文所述的适合于与本披露的组合物和方法一起使用的其他化合物描述于例如，“physicians desk reference[医生桌面参考],第62版.奥拉德尔,新泽西州:医学经济有限公司(medical economics co.),2008“,goodman&gilman，“the pharmacological basis of therapeutics[治疗剂的药理学基础],第十一版.mcgraw
‑
hill,2005”，“remington:the science and practice of pharmacy[雷明顿：药学科学与实践],第20版.巴尔的摩,马里兰州:lippincott williams&wilkins,2000.”，和“the merck index[默克索引],第十四版.白宫,新泽西州:默克研究实验室(merck research laboratories),2006”，这些文献的相关部分通过引用并入本文
[0412]
本文引用(无论是上文还是下文)的所有出版物、专利和专利申请都通过引用以其整体并入本文。
[0413]
在整个说明书中，除非上下文另有要求，否则单词“包括(comprise/comprises和comprising)”将被理解为暗示包括所述步骤或要素或者步骤或要素的群组，但不排除任何其他步骤或要素或者步骤或要素的群组。“由...组成”意在包括但不限于短语“由以下组成：”之后的任何因此，短语“由...组成”指示所列出的要素是必需的或强制性的，并且没有其他要素可以存在。“基本上由...组成”意在包括该短语之后列出的任何要素，并限于不会干扰或有助于本披露针对所列出的要素指定的活性或作用的其他要素。因此，短语“基本上由...组成”指示所列出的要素是必需的或强制性的，而没有其他元素是可选的，并且根据它们是否影响所列出的要素的活性或作用而可以存在或可以不存在。
[0414]
可以组合上述不同的实施例以提供另外的实施例。将在本说明书中引用的和/或在申请数据表中列举的所有美国专利申请公开案、美国专利申请、外国专利、外国专利申请
和非专利公开案通过引用以其整体并入本文。数据库条目的内容，例如本文提供的ncbi核苷酸或蛋白质数据库条目，以其整体并入本文。如果数据库条目经受随时间的变化，则自本技术的申请日期的内容通过引用并入本文。如果必要的话，可以修改实施例的方面，以采用不同专利、申请和公开案的概念以提供又另外的实施例。
[0415]
根据上文详细说明，可以对实施例作出这些和其他改变。总体上，在以下权利要求书中，所使用的术语不应解读为将权利要求书限制为说明书和权利要求书中披露的具体实施例，而应解读为包括所有可能的实施例连同这些权利要求所享有的等效权利的全部范围。因此，权利要求书不受本披露的限制。实例
[0416]
以下实例仅仅是说明性的，并不旨在以任何方式限制本披露的范围或内容。实例1：由ips细胞产生经修饰的ink细胞
[0417]
使用ips细胞技术实施复杂的编辑策略和后续衍生ink细胞或其他淋巴细胞，例如，使得能够产生表达目的car(如间皮素、egfr、her2和mica/b)和/或具有来自列表a和/或表10的一个或多个编辑以及来自列表b和/或表11的一个或多个编辑的ink细胞。
[0418]
列表a：
·
增强的cd16变体的外源表达，例如hncd16a(cd16的高亲和力、不可裂解变体——抗体依赖性细胞的细胞毒性(adcc)所涉及的低亲和力fcy受体)的外源表达。典型地，cd16在adcc期间被蛋白酶裂解
‑
hncd16 car不会经历这种裂解，从而将adcc信号维持更久。
·
il
‑
15/il 15ra的外源表达
·
tgfbr2的功能丧失，或tgfbr2的显性负性变体的外源表达(显性负性tgfβ受体ii由nk特异性启动子表达，以干扰tgfbrii在可衍生自ips细胞的cd34细胞的分化中的作用，并且典型地用作分化血红素谱系(像nk细胞)的一种细胞类型)
·
adora2a的功能丧失
[0419]
列表b：
·
b2m的功能丧失(例如，通过靶向b2m表达来消除mhc i类表达)hla
‑
g的外源表达
·
ciita的功能丧失(例如，通过靶向ciita来消除mhc ii类表达)
·
pd1的功能丧失
·
tigit的功能丧失
·
cish(细胞因子诱导型含sh2蛋白)的功能丧失
[0420]
功能丧失优选包括完全消除对应蛋白质的表面表达。
[0421]
例如，可以产生具有car和cd16变体(例如，hncd16)的外源表达或具有car的外源表达且无cd16变体的外源表达的ink细胞。也可以产生不表达car但表达cd16变体的细胞。表达cd16或其增强变体(例如，hncd16)的任何细胞将适合于连同单克隆抗体(例如在癌症治疗中使用的)或靶向病理性细胞的fc融合蛋白进行的组合疗法。
[0422]
如果敲入超过两个转基因，则多顺反子表达构建体或2a构建体可能是有利的，以避免必须插入每个转基因的单独构建体。
[0423]
这种ink细胞可用于各种免疫疗法应用，包括但不限于治疗增殖性疾病，例如某些形式的癌症。在使用上述car时，设想了在乳腺癌、结肠癌、胃癌、肾细胞癌和nsclc中的应
用。这种细胞的改变的表面分子库还能够成功地治疗实体瘤，而实体瘤已经被证明对于当前的基于nk细胞的策略而言是困难的。
[0424]
从重编程的体细胞(或其子细胞)中获得的示例性ink细胞包含以下特征中的一项或多项(例如，一项或多项、两项或更多项、三项或更多项、四项或更多项、五项或更多项、或者六项或更多项)：
‑
它们包含重排的内源tcr基因座(例如，tcra vj和/或tcrf3 v(d)j区段重排和完整的v
‑
结构域外显子)；
‑
它们不表达内源t细胞共受体，例如cd3、cd4和/或cd8；
‑
它们表达nk细胞生物标记，例如：
·
cd56(ncam)、cd49和/或cd45；
·
nk细胞受体免疫球蛋白γfc区受体iii(fcγriii，分化簇16(cd16))；
·
自然杀伤组
‑
2成员0(nkg2d，micaib应激配体受体)；
·
cd69；
·
天然细胞毒性受体(例如，nkp30；nkp44；nkp46；和/或cd158b)；或者这些中的两项或更多项的任何组合；
‑
它们可以表达：
·
嵌合抗原受体(car)，
·
非天然存在的免疫球蛋白γfc区受体iii变体(fcyriii，cd16)
·
白细胞介素15(il
‑
15)路径激动剂，例如白细胞介素
‑
15(il
‑
15)、白细胞介素15受体(il
‑
15r)或其变体(例如il
‑
15r的组成型活性变体，例如与il
‑
15r激动剂(il
‑
15ra)融合的il
‑
15r)；还考虑到了其他白细胞介素路径激动剂(与il
‑
15路径激动剂二择一或与其组合)，例如白细胞介素2(il
‑
2)路径激动剂，例如il
‑
2、白细胞介素2受体(il
‑
2r)或其变体(例如il
‑
2r的组成型活性变体，例如与il
‑
2r激动剂(il
‑
2ra)融合的il
‑
2r)；和/或白细胞介素12(il12)路径激动剂，例如il
‑
12、白细胞介素12受体(il
‑
12r)或其变体(例如il
‑
12r的组成型活性变体，例如与il
‑
12r激动剂(il
‑
12ra)融合的il
‑
12r)；还考虑了两种或更多种白细胞介素的组合，例如il
‑
15路径激动剂或il
‑
2激动剂和il
‑
12激动剂的组合，例如与il
‑
15r激动剂(il
‑
15ra)融合的il
‑
15r组合与il
‑
12r激动剂(il
‑
15ra)融合的il
‑
12r。
·
人白细胞抗原g(hla
‑
g)；或其两种或更多种的任何组合；
·
人白细胞抗原e(hla
‑
e)
·
白细胞表面抗原分化簇cd47(cd47)
·
并且
‑
它们可表现出以下的功能丧失：
·
转化生长因子β受体2(tgfbetar2，例如通过修饰编码序列或通过表达显性负性变体)；
·
腺苷a2a受体(adora2a)；
·
具有ig和itim结构域的t细胞免疫受体(tigit)；
·
β
‑
2微球蛋白(b2m)；
·
主要组织相容性复合体ii类反式激活因子(ciita)；
·
程序性细胞死亡蛋白1(pd
‑
1，cd279)，或表达pd
‑
1拮抗剂；
·
细胞因子诱导型含sh2蛋白(cish)；
·
自然杀伤细胞受体nkg2a(自然杀伤组2a)；
·
两种或更多种hla ii类组织相容性抗原α链基因，和/或两种或更多种hla ii类组织相容性抗原β链基因；
·
分化簇32b(cd32b，fcgr2b)；
·
或其两种或更多种的任何组合。
[0425]
期望通过最小化编辑的数量，实现这些特征的特定组合，例如表达car、il
‑
15和hla
‑
g并表现出b2m和pd
‑
1的功能丧失的ink细胞。例如，可以将编码car的表达构建体插入b2m基因座中，并且可以将编码il
‑
15和hla
‑
g的表达构建体插入b2m基因座中。类似的策略将适用于其他组合。
[0426]
ink细胞可以用作单一疗法，并且表达car(例如，car结合间皮素、egfr或her2)的那些将特别适合于特异性靶向表达car结合的表面抗原的细胞的治疗方法。设想的一些ink细胞也可适合于组合治疗方法，例如，与靶向癌细胞的单克隆抗体组合。
[0427]
在一些实施例中，ips细胞的产生将包括从健康供体个体获得供体细胞(例如体细胞)。在一些实施例中，确认供体细胞或细胞群是核型正常的，而不表现出已知与病理状态(例如恶性状态)相关的基因或基因组合的表达。在一些实施例中，对体细胞进行编辑，然后重编程为多潜能状态。在一些实施例中，对体细胞进行重编程，同时进行编辑。在一些实施例中，对体细胞进行重编程，并对得到的多潜能细胞进行编辑。在一些实施例中，ips细胞的产生包括对重编程细胞系的克隆扩增、对多个此类克隆ips细胞系的表征以及对包含所有所需编辑同时核型正常的系的选择。
[0428]
用于临床用途的最终产品是携带对应编辑的ink细胞群。在施用给受试者后，细胞数量将足以引发所需的免疫应答。精确的数量将取决于特定的所需临床结果、待治疗的患者和疾病以及其他因素，并且可能会变化很大。预计施用的适合细胞群的范围可以为从约1,000个细胞至约100,000,000个细胞。用于临床用途的ink细胞群应不含剩余的干细胞，例如表达oct
‑
4和/或sox2的ips细胞，理想地应不含或仅含有最小量的含游离型表达构建体的细胞，例如在t细胞重编程期间使用的游离型表达构建体；应不含或不含有超过1％、5％或10％的不表达所需的细胞标记和过表达的表面分子的组合的细胞。实例2：使用t细胞作为复杂编辑策略和后续衍生ink细胞的细胞来源
[0429]
使用t细胞作为复杂编辑策略和后续衍生ink细胞或其他淋巴细胞的细胞来源，例如，使得能够产生表达目的car(如间皮素、egfr、her2和mica/b)和/或具有来自列表a和/或表10的一个或多个编辑以及来自列表b和/或表11的一个或多个编辑的ink细胞。
[0430]
列表a：
·
增强的cd16变体的外源表达，例如hncd16a(cd16的高亲和力、不可裂解变体——抗体依赖性细胞的细胞毒性(adcc)所涉及的低亲和力fcy受体)的外源表达。典型地，cd16在adcc期间被蛋白酶裂解
‑
hncd16 car不会经历这种裂解，从而将adcc信号维持更久。
·
il
‑
15/il 15ra的外源表达
·
tgfbr2的功能丧失，或tgfbr2的显性负性变体的外源表达(显性负性tgfβ受体ii由nk特异性启动子表达，以干扰tgfbrii在可衍生自ips细胞的cd34细胞的分化中的作
用，并且典型地用作分化血红素谱系(像nk细胞)的一种细胞类型)
·
adora2a的功能丧失
[0431]
列表b：
·
b2m的功能丧失(例如，通过靶向b2m表达来消除mhc i类表达)hla
‑
g的外源表达
·
ciita的功能丧失(例如，通过靶向ciita来消除mhc ii类表达)
·
pd1的功能丧失
·
tigit的功能丧失
·
cish(细胞因子诱导型含sh2蛋白)的功能丧失
[0432]
功能丧失优选包括完全消除对应蛋白质的表面表达。
[0433]
例如，可以产生具有car和cd16变体(例如，hncd16)的外源表达或具有car的外源表达且无cd16变体的外源表达的ink细胞。也可以产生不表达car但表达cd16变体的细胞。表达cd16或其增强变体(例如，hncd16)的任何细胞将适合于连同单克隆抗体(例如在癌症治疗中使用的)或靶向病理性细胞的fc融合蛋白进行的组合疗法。
[0434]
如果敲入超过两个转基因，则多顺反子表达构建体或2a构建体可能是有利的，以避免必须插入每个转基因的单独构建体。
[0435]
这种ink细胞可用于各种免疫疗法应用，包括但不限于治疗增殖性疾病，例如某些形式的癌症。在使用上述car时，设想了在乳腺癌、结肠癌、胃癌、肾细胞癌和nsclc中的应用。这种细胞的改变的表面分子库还能够成功地治疗实体瘤，而实体瘤已经被证明对于当前的基于nk细胞的策略而言是困难的。
[0436]
从重编程/编辑的t细胞(或其子细胞)中获得的示例性ink细胞包含以下特征中的一项或多项(例如，一项或多项、两项或更多项、三项或更多项、四项或更多项、五项或更多项、或者六项或更多项)：
‑
它们包含重排的内源tcr基因座(例如，tcra vj和/或tcrf3 v(d)j区段重排和完整的v
‑
结构域外显子)；
‑
它们不表达内源t细胞共受体，例如cd3、cd4和/或cd8；
‑
它们表达nk细胞生物标记，例如：
·
cd56(ncam)、cd49和/或cd45；
·
nk细胞受体免疫球蛋白γfc区受体iii(fcγriii，分化簇16(cd16))；
·
自然杀伤组
‑
2成员0(nkg2d，micaib应激配体受体)；
·
cd69；
·
天然细胞毒性受体(例如，nkp30；nkp44；nkp46；和/或cd158b)；或者这些中的两项或更多项的任何组合；
‑
它们可以表达：
·
嵌合抗原受体(car)，
·
非天然存在的免疫球蛋白γfc区受体iii变体(fcyriii，cd16)
·
白细胞介素15(il
‑
15)路径激动剂，例如白细胞介素
‑
15(il
‑
15)、白细胞介素15受体(il
‑
15r)或其变体(例如il
‑
15r的组成型活性变体，例如与il
‑
15r激动剂(il
‑
15ra)融合的il
‑
15r)；还考虑到了其他白细胞介素路径激动剂(与il
‑
15路径激动剂二择一或与其组合)，例如白细胞介素2(il
‑
2)路径激动剂，例如il
‑
2、白细胞介素2受体(il
‑
2r)或其变体
(例如il
‑
2r的组成型活性变体，例如与il
‑
2r激动剂(il
‑
2ra)融合的il
‑
2r)；和/或白细胞介素12(il12)路径激动剂，例如il
‑
12、白细胞介素12受体(il
‑
12r)或其变体(例如il
‑
12r的组成型活性变体，例如与il
‑
12r激动剂(il
‑
12ra)融合的il
‑
12r)；还考虑了两种或更多种白细胞介素的组合，例如il
‑
15路径激动剂或il
‑
2激动剂和il
‑
12激动剂的组合，例如与il
‑
15r激动剂(il
‑
15ra)融合的il
‑
15r组合与il
‑
12r激动剂(il
‑
15ra)融合的il
‑
12r。
·
人白细胞抗原g(hla
‑
g)；或其两种或更多种的任何组合；
·
人白细胞抗原e(hla
‑
e)
·
白细胞表面抗原分化簇cd47(cd47)
·
和
‑
它们可表现出以下的功能丧失：
·
转化生长因子β受体2(tgff3r2，例如通过修饰编码序列或通过表达显性负性变体)；
·
腺苷a2a受体(adora2a)；
·
具有ig和itim结构域的t细胞免疫受体(tigit)；
·
β
‑
2微球蛋白(b2m)；
·
主要组织相容性复合体ii类反式激活因子(ciita)；
·
程序性细胞死亡蛋白1(pd
‑
1，cd279)，或表达pd
‑
1拮抗剂；
·
细胞因子诱导型含sh2蛋白(cish)；
·
自然杀伤细胞受体nkg2a(自然杀伤组2a)；
·
两种或更多种hla ii类组织相容性抗原α链基因，和/或两种或更多种hla ii类组织相容性抗原β链基因；
·
分化簇32b(cd32b，fcgr2b)；
·
t细胞受体α恒定区(trac)；
·
或其两种或更多种的任何组合。
[0437]
期望通过最小化编辑的数量，实现这些特征的特定组合，例如表达car、il
‑
15和hla
‑
g并表现出b2m和pd
‑
1的功能丧失的ink细胞。例如，可以将编码car的表达构建体插入b2m基因座中，并且可以将编码il
‑
15和hla
‑
g的表达构建体插入b2m基因座中。类似的策略将适用于其他组合。
[0438]
ink细胞可以用作单一疗法，并且表达car(例如，car结合间皮素、egfr或her2)的那些将特别适合于特异性靶向表达car结合的表面抗原的细胞的治疗方法。设想的一些ink细胞也可适合于组合治疗方法，例如，与靶向癌细胞的单克隆抗体组合。
[0439]
ips细胞的产生将包括对重编程细胞系的克隆扩增、对多个此类克隆ips细胞系的表征以及对包含所有所需编辑同时核型正常的系的选择。
[0440]
用于临床用途的最终产品是携带对应编辑的ink细胞群。在施用给受试者后，细胞数量将足以引发所需的免疫应答。精确的数量将取决于特定的所需临床结果、待治疗的患者和疾病以及其他因素，并且可能会变化很大。预计施用的适合细胞群的范围可以为从约1,000个细胞至约100,000,000个细胞。用于临床用途的ink细胞群应不含剩余的干细胞，例如表达oct
‑
4和/或sox2的ips细胞，理想地应不含或仅含有最小量的含游离型表达构建体的细胞，例如在t细胞重编程期间使用的游离型表达构建体；应不含或不含有超过1％、5％
或10％的不表达所需的细胞标记和过表达的表面分子的组合的细胞。实例3：用于临床应用的ips/ink细胞
[0441]
对于作为免疫治疗剂的临床用途，例如，在免疫肿瘤学应用的背景下，产生经修饰的淋巴细胞(此处为ink细胞)，其包含b2m功能丧失；ciita功能丧失；和包含编码hla
‑
g的核酸序列的外源核酸表达构建体。这些编辑允许经编辑的细胞和/或由其衍生的分化ink细胞逃避非自体宿主的免疫系统。可以进行另外的编辑以增强ink细胞的临床特性。通过重编程来自健康供体的供体体细胞，将该供体细胞重编程为多潜能状态并实现所需的编辑来获得这些ink细胞。一旦编辑，多潜能细胞分化为nk细胞，得到用于临床应用的经修饰的ink细胞群。实例4：用于临床应用的ips/ink细胞
[0442]
对于作为免疫治疗剂的临床用途，例如，在免疫肿瘤学应用的背景下，产生经修饰的淋巴细胞(此处为ink细胞)，其包含b2m功能丧失；ciita功能丧失；和包含编码hla
‑
e的核酸序列的外源核酸表达构建体。在一些实施例中，细胞进一步包含nkg2a的功能丧失。这些编辑允许经编辑的细胞和/或由其衍生的分化ink细胞逃避非自体宿主的免疫系统。可以进行另外的编辑以增强ink细胞的临床特性。通过重编程来自健康供体的供体体细胞，将该供体细胞重编程为多潜能状态并实现所需的编辑来获得这些ink细胞。一旦编辑，多潜能细胞分化为nk细胞，得到用于临床应用的经修饰的ink细胞群。实例5：用于临床应用的ips/ink细胞
[0443]
对于作为免疫治疗剂的临床用途，例如，在免疫肿瘤学应用的背景下，产生经修饰的淋巴细胞(此处为ink细胞)，其包含b2m功能丧失；ciita功能丧失；和包含编码cd47的核酸序列的外源核酸表达构建体。这些编辑允许经编辑的细胞和/或由其衍生的分化ink细胞逃避非自体宿主的免疫系统。可以进行另外的编辑以增强ink细胞的临床特性。通过重编程来自健康供体的供体体细胞，将该供体细胞重编程为多潜能状态并实现所需的编辑来获得这些ink细胞。一旦编辑，多潜能细胞分化为nk细胞，得到用于临床应用的经修饰的ink细胞群。实例6：用于临床应用的ips/ink细胞
[0444]
对于作为免疫治疗剂的临床用途，例如，在免疫肿瘤学应用的背景下，产生经修饰的淋巴细胞(此处为ink细胞)，其包含b2m功能丧失；hla
‑
drb1、hla
‑
drb3、hla
‑
drb4、hla
‑
drb5、hla
‑
dqb1和hla
‑
dpb1的功能丧失；和包含编码hla
‑
g的核酸序列的外源核酸表达构建体。这些编辑允许经编辑的细胞和/或由其衍生的分化ink细胞逃避非自体宿主的免疫系统。可以进行另外的编辑以增强ink细胞的临床特性。通过重编程来自健康供体的供体体细胞，将该供体细胞重编程为多潜能状态并实现所需的编辑来获得这些ink细胞。一旦编辑，多潜能细胞分化为nk细胞，得到用于临床应用的经修饰的ink细胞群。实例7：用于临床应用的ips/ink细胞
[0445]
对于作为免疫治疗剂的临床用途，例如，在免疫肿瘤学应用的背景下，产生经修饰的淋巴细胞(此处为ink细胞)，其包含b2m功能丧失；hla
‑
drb1、hla
‑
drb3、hla
‑
drb4、hla
‑
drb5、hla
‑
dqb1和hla
‑
dpb1的功能丧失；和包含编码hla
‑
e的核酸序列的外源核酸表达构建体。在一些实施例中，细胞进一步包含nkg2a的功能丧失。这些编辑允许经编辑的细胞和/或由其衍生的分化ink细胞逃避非自体宿主的免疫系统。可以进行另外的编辑以增强ink细胞
的临床特性。通过重编程来自健康供体的供体体细胞，将该供体细胞重编程为多潜能状态并实现所需的编辑来获得这些ink细胞。一旦编辑，多潜能细胞分化为nk细胞，得到用于临床应用的经修饰的ink细胞群。实例8：用于临床应用的ips/ink细胞
[0446]
对于作为免疫治疗剂的临床用途，例如，在免疫肿瘤学应用的背景下，产生经修饰的淋巴细胞(此处为ink细胞)，其包含b2m功能丧失；hla
‑
drb1、hla
‑
drb3、hla
‑
drb4、hla
‑
drb5、hla
‑
dqb1和hla
‑
dpb1的功能丧失；和包含编码cd47的核酸序列的外源核酸表达构建体。这些编辑允许经编辑的细胞和/或由其衍生的分化ink细胞逃避非自体宿主的免疫系统。可以进行另外的编辑以增强ink细胞的临床特性。通过重编程来自健康供体的供体体细胞，将该供体细胞重编程为多潜能状态并实现所需的编辑来获得这些ink细胞。一旦编辑，多潜能细胞分化为nk细胞，得到用于临床应用的经修饰的ink细胞群。实例9：用于临床应用的ips/ink细胞
[0447]
对实施例3
‑
8中提供的细胞进行另外的编辑，其增强ink细胞作为治疗剂的有效性。
[0448]
在一些实施例中，这些编辑包括敲入包含编码il
‑
15r变体的核酸序列的外源核酸表达构建体，这里il
‑
15r与其配体(il
‑
15或il
‑
15结合片段)融合，得到ink细胞中的组成型活性il
‑
15路径。
[0449]
在一些实施例中，这些编辑进一步包括在nk细胞特异性启动子(例如cd45启动子)的控制下，敲入包含编码转化生长因子β受体2(tgfβr2)的核酸序列的外源核酸表达构建体。
[0450]
在一些实施例中，这些编辑进一步包括cd32b(fcgr2)的功能丧失。实例10：表现出cish和/或tgfbr2的功能丧失的经基因编辑的nk细胞证明了响应于肿瘤细胞的改进的效应子功能
[0451]
使用crispr
‑
cpf1基因编辑开发了下一代同种异体nk细胞疗法，以通过cish和tgfbr2基因的敲除增强nk细胞功能。
[0452]
在20ng/ml il
‑
15下由cd3
‑
pbmc培养基扩增nk细胞。在不同的nk细胞扩增阶段(第8
‑
21天之间)进行基因编辑。为了编辑cish和tgfbr2，将任一靶标的指导物与cpf1核酸酶以2:1的比率复合，以形成核糖核蛋白(rnp)。在用两种靶标编辑细胞的情况下，分别进行每种靶标的rnp复合，然后在电穿孔之前以1:1的比率混合。
[0453]
对于电穿孔，将nk细胞以80x106个细胞/ml的密度悬浮在hyclone缓冲液中。将90微升nk细胞与10微升的适当rnp混合。然后将细胞和rnp混合物转移到maxcyte oc
‑
100或oc
‑
400盒中以进行电穿孔。在电穿孔后，立即在37℃下在100微升培养基中回收nk细胞，持续10分钟，之后转移到24孔grex板以进行编辑后回收和功能分析。
[0454]
使用以下指导rna序列来编辑cish和tgfbr2：用以下产生两种指导物：由rna组成的靶向结构域，靶向结构域的5’序列uaauuucuacucuuguagau的ascpf1支架以及支架序列的5’末端的序列atgtgtttttgtcaaaagacctttt的25
‑
mer dna延伸。表12：
[0455]
如图1a
‑
1b所证明的，在nk细胞中实现了tgfbr2和cish的稳健单和双基因编辑。使用crispr
‑
cpf1在nk细胞中单独和同时靶向tgfbr2和cish在大于80％的nk细胞中两个靶标处都产生插缺，在编辑后72小时有大于90％的经编辑nk细胞存活。
[0456]
通过3d肿瘤球状体测定体外评估效应细胞的功效
[0457]
为了形成球状体，将5,000个nuclight red标记的pc
‑
3或sk
‑
ov
‑
3肿瘤细胞在超低附着96孔板的单个孔中铺板，以1,000rpm离心10分钟，并在37℃下孵育96小时。在96小时时，在有或没有10ng/ml tgf
‑
β的情况下，将效应细胞(用不同rnp处理的原代人nk细胞)添加到多个效应子:靶细胞比率下的球状体中。持续6天在incucyte成像系统上每两小时测量红色目标强度。在添加效应子时，将所示的数据相对于红色目标强度归一化。球状体曲线的归一化保持与在非归一化数据中观察到的相同的功效模式(图2a
‑
2b)。
[0458]
此外，与未编辑的对照相比，cish ko nk细胞分别将sk
‑
ov
‑
3卵巢肿瘤球状体(图3a
‑
3b和图5a)和pc
‑
3前列腺肿瘤球状体(图4a
‑
4b和图5b)的生长平均减少了23％和12％(在两种情况下均p<0.0001)。但是，添加外源tgf
‑
β抑制了cish ko nk细胞的活性。
[0459]
鉴于这种观察，在cish ko的情况下，产生了tgf
‑
β受体基因tgfbr2的敲除。tgfbr2的单敲除使nk细胞抵抗tgfβ抑制(p<0.0001)。重要的是，在4个独特的供体和7个独立实验中，在补充外源tgf
‑
β(图3a
‑
3b和图4a
‑
4b)和没有补充外源tgf
‑
β(图5a
‑
5b)的情况下，对于两种肿瘤类型，tgfbr2/cish双重敲除(dko)nk细胞都证明了优越的效应子功能并将sk
‑
ov
‑
3和pc
‑
3肿瘤球状体生长减弱超过60％。这些效应子功能在统计学上大于对照nk细胞或tgfbr2和cish单敲除nk细胞(在所有情况下均p<0.0001)。此外，tgfbr2/cish dko nk细胞产生了更高浓度的tnf
‑
α(图6a)和ifn
‑
γ(图6b)，如通过elisa评估的，在两种情况下均p<0.01。
[0460]
与对照nk细胞相比，双ko nk细胞表达了显著较高水平的激活标记cd25和cd69(图6c)。
[0461]
在体内模型中测量了经编辑的nk细胞的抗肿瘤活性。nsg小鼠接受了500,000个用萤光素酶标记的skov3肿瘤细胞的腹膜内注射。肿瘤植入后七天，1000万经编辑的(cish/tgfbr2双敲除)或未编辑的(对照)nk细胞被注射到荷瘤小鼠的腹膜腔中。通过ip施用萤光素和ivis成像每周监测肿瘤负荷。在第34天进行双向anova分析，以确定对照和dko nk细胞组之间的统计学显著性(****，p<0.0001)(图6d)。
[0462]
这些结果证明，可以在两个独特的靶标处用crispr
‑
cpf1同时有效编辑原代人nk细胞。cish/tgfbr2 dko原代人nk细胞在体外和体内相对于单敲除或未编辑的nk细胞的效应子功能的增加指示了cish/tgfbr2 dko的增强和协同作用。实例11：表现出tigit、nkg2a或adora2a的功能丧失的经基因编辑的nk细胞证明了
响应于肿瘤细胞的改进的效应子功能
[0463]
使用crispr
‑
cpf1基因编辑开发了下一代同种异体nk细胞疗法，以通过tigit、nkg2a或adora2a基因的敲除增强nk细胞功能。
[0464]
如前文实例10中所述，扩增nk细胞。简而言之，在il15中将nk细胞离体扩增14天，然后用对应的靶向rnp复合物编辑。在不同的nk细胞扩增阶段(第8
‑
21天之间)进行基因编辑。为了编辑tigit、nkg2a或adora2a，将相应靶标的指导物与cpf1核酸酶以2:1的比率复合，以形成核糖核蛋白(rnp)。在用两种靶标编辑细胞的情况下，分别进行每种靶标的rnp复合，然后在电穿孔之前以1:1的比率混合。如前文实例10中所述，电穿孔nk细胞。
[0465]
使用以下指导rna序列来编辑tigit、nkg2a或adora2a：表13：
[0466]
如图7a
‑
7c所证明的，在nk细胞中实现了tigit、nkg2a和adora2a的稳健单基因编辑。
[0467]
在体外评估效应细胞(用不同rnp处理的原代人nk细胞)的功效，以通过3d肿瘤球状体测定确定tigit单ko(图8a
‑
8b)、nkg2a单ko(图9a
‑
9b)和adora2a单ko(图10a
‑
10b)的功能
[0468]
为了形成球状体，将5,000个nuclight red标记的pc
‑
3或sk
‑
ov
‑
3肿瘤细胞在超低附着96孔板的单个孔中铺板，以1,000rpm离心10分钟，并在37℃下孵育96小时。在96小时时，在有或没有10ng/ml tgf
‑
β的情况下，将效应细胞(用不同rnp处理的原代人nk细胞)添加到多个效应子:靶细胞比率下的球状体中。持续6天在incucyte成像系统上每两小时测量红色目标强度。在添加效应子时，将所示的数据相对于红色目标强度归一化。
[0469]
在2个独特的供体和2个独立实验中，tigit单ko(图8a
‑
8b)、nkg2a单ko(图9a
‑
9b)和adora2a单ko(图10a
‑
10b)nk细胞证明了优越的效应子功能并减弱sk
‑
ov
‑
3和pc
‑
3肿瘤球状体生长。这些数据证明了在三个独立的独特靶标处用crispr
‑
cpf1对原代人nk细胞进行了有效编辑，导致在体外相对于未编辑的nk细胞，tigit单ko、nkg2a单ko和adora2a单ko原代人nk细胞的效应子功能增加。实例12：表现出cish、tgfbr2和tigit的功能丧失的经基因编辑的nk细胞证明了响应于肿瘤细胞的改进的效应子功能
[0470]
使用crispr
‑
cpf1基因编辑开发了下一代同种异体nk细胞疗法，以通过cish、tgfbr2和tigit基因的敲除增强nk细胞功能。
[0471]
如前文实例10中所述，扩增nk细胞。简而言之，在il15中将nk细胞离体扩增14天，
然后用对应的靶向rnp复合物编辑。在不同的nk细胞扩增阶段(第8
‑
21天之间)进行基因编辑。为了编辑cish、tgfbr2和tigit，将靶标的指导物与cpf1核酸酶复合，以形成核糖核蛋白(rnp)，分别进行每种靶标的rnp复合，然后在电穿孔之前以1:1的比率混合。如前文实例10中所述，电穿孔nk细胞。
[0472]
用于编辑cish、tgfbr2和tigit的指导rna序列在下表14中示出：表14
[0473]
如图11所证明的，在nk细胞中实现了tgfbr2、cish和tigit的稳健三重基因编辑。
[0474]
通过3d肿瘤球状体测定体外评估效应细胞的功效。
[0475]
为了形成球状体，将5,000个nuclight red标记的pc
‑
3或sk
‑
ov
‑
3肿瘤细胞在超低附着96孔板的单个孔中铺板，以1,000rpm离心10分钟，并在37℃下孵育96小时。在96小时时，在有或没有10ng/ml tgf
‑
β的情况下，将效应细胞(用不同rnp处理的原代人nk细胞)添加到多个效应子:靶细胞比率下的球状体中。持续6天在incucyte成像系统上每两小时测量红色目标强度。在添加效应子时，将所示的数据相对于红色目标强度归一化。球状体曲线的归一化保持与在非归一化数据中观察到的相同的功效模式。
[0476]
tgfbr2/cish/tigit三重敲除(tko)nk细胞证明了优越的效应子功能并减弱sk
‑
ov
‑
3和pc
‑
3肿瘤球状体生长(图12a
‑
12b)。这些效应子功能在统计学上大于对照nk细胞。这些结果证明，可以在三个独特的靶标处用crispr
‑
cpf1同时有效编辑原代人nk细胞。cish/tgfbr2/tigit tko原代人nk细胞在体外相对于未编辑的nk细胞的效应子功能的增加指示了cish/tgfbr2/tigit tko的增强作用。
再多了解一些
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