一种合成多官能团苯胺类化合物的光促酶催化方法与流程

1.本发明涉及一种合成多官能团苯胺类化合物的光促酶催化方法，属于生物催化技术领域。


背景技术：

2.多官能团苯胺在有机合成、医药、工业化学等方面都是一种重要的结构单元。例如，5
‑
氨基水杨酸(5
‑
asa药物名称为马沙拉嗪，masalazine)是重要的医药和染料化工原料，也是一种治疗慢性结肠炎药物柳氨磺吡啶的主要原料，其本身也具有相似的治疗作用。5
‑
氨基水杨酸由于环上具有氨基、羟基和羧基三个活泼的反应性基团，可以进行多种反应，因此在染料工业，它可以用来制造多种质量优异的活性染料。也用于光敏纸的制造。这一领域的发展已有几十余年，关于取代苯胺类化合物的合成方法也层出不穷。例如，2009年，hideo nagashima课题组报道了在h2存在下，使用pt负载的新型聚硅氧烷凝胶，成功将官能化硝基芳烃还原成相应的取代苯胺(doi:org/10.1021/ol9001366)。2019年，yachana jain课题组所制备的fe3o4‑
glu
‑
ag纳米材料在nabh4存在下，使用水作为绿色溶剂，成功实现将硝基芳烃或杂硝基芳烃还原为相应的苯胺(doi:10.1002/aoc.5223)。2019年，luigi vaccaro课题组报道了使用一种金负载的磷酸氨乙基膦酸锆新型材料，在硼氢化钠作用下，将硝基芳烃还原为苯胺(doi:10.1039/c8gc03513j)。但以上方法中，使用到贵金属，以及硼氢化钠强还原剂，条件要求苛刻，操作复杂、且绝大多数催化体系一次性只能引入一个官能团。因此，研发多官能团苯胺的新型绿色合成方法，特别是基于一锅一步的合成方法，在合成官能团分子方面具有重要意义。


技术实现要素：

3.本发明的目的是提供一种一锅一步法合成多官能团苯胺的光促酶催化方法，本发明选用多官能团硝基苯为底物合成多官能团苯胺，在模拟太阳光下，以光催化剂和过氧化酶催化氧化。该方法是在室温下，在小分子醇溶液体系中依次添加一定量的缓冲液及光催化剂，多官能团硝基苯和过氧化酶，反应一段时间后，萃取、干燥，得到多官能团苯胺。
4.本发明所提供合成多官能团苯胺的光促酶催化制备方法，包括如下步骤：
5.以式i所示多官能团硝基苯为反应底物，在小分子醇
‑
缓冲液反应体系中，在光催化剂和过氧化酶存在下，光照下反应，得到式ii所示氧官能化的苯胺，
[0006][0007]
式i中，r可为h、烷基、烷氧基、卤素、卤素取代的烷基、羰基、巯基、羧基、磺酸基、偶
氮基中的一种或多种；
[0008]
x可为
‑
ch2、乙烯基、s中的任一种；
[0009]
r’可为c1
‑
c6烷基、酯基、羧基、羰基中的一种，具体可为甲基；
[0010]
式ii中r、r’分别同式i中r、r’；
[0011]
式ii中y为含氧基团；
[0012]
当式i中x为
‑
ch2时，式ii中的y为
[0013]
当式i中x为乙烯基时，式ii中的y为
[0014]
当式i中x为s时，式ii中的y为
[0015]
反应体系中，多官能团硝基苯的浓度可为1.0mmol/l
‑
100mmol/l，具体可为2.5
‑
10mmol/l；
[0016]
所述小分子醇可为甲醇、乙醇、异丙醇中的一种或几种的混合物；
[0017]
小分子醇占反应体系体积的1
‑
50％；
[0018]
所述缓冲溶液可为磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液中的任一种，其ph值为3.5
‑
11，具体可为5
‑
9，更具体可为7.5；
[0019]
所述光催化剂可为g
‑
c3n4，tio2，bivo4、cds、pt、pd以及au/zro2及其掺杂的(如cds
‑
tio2、au
‑
tio2、pt
‑
c3n4、pd
‑
c3n4等)一种或几种，具体可为g
‑
c3n4；
[0020]
所述光催化剂与多官能团硝基苯的配比可为0.75
‑
15mg：0.005
‑
0.1mmol，具体可为15mg：0.005mmol；
[0021]
所述过氧化酶可为来源于茶树菇、球毛壳菌、辐毛小鬼伞菌、小应伞等的过氧化酶或其突变体，以及来源于辣根、海洋真菌leptoxyphium fumago等的过氧化物酶或其突变体；
[0022]
所述过氧化酶或其突变体以全细胞、粗酶粉、粗酶液或者纯酶的形式发挥催化作用；
[0023]
反应体系中，过氧化物酶的浓度可为1nmol/l
‑
5umol/l，具体可为5nmol/l
‑
5umol/l(0.02～0.4u/ml)，1u为室温下，在1分钟内能转化1微摩尔乙苯所需的酶量)。
[0024]
所述反应的反应时间可为15
‑
25h，反应温度可为25
‑
30℃。
[0025]
反应结束后，将反应液用有机溶剂萃取，干燥，过滤，气相色谱检测分析。
[0026]
本发明的优点是：
[0027]
(1)研制了一种合成多官能团苯胺的光促酶催化方法，可以通过一锅一步法直接制备多官能团苯胺，这种化合物可作为多种药物的中间体。
[0028]
(2)制备过程中除使用水与小分子醇类外，没有使用其他任何溶剂。该方法属于绿色制备方法，并获具有较高的原子经济利用性。
[0029]
(3)制备工艺简便，得率高，成本低。
具体实施方式
[0030]
图1为本发明制备的(r)
‑1‑
(4
‑
氨苯基)乙醇的核磁共振氢谱(氘代氯仿作为溶剂)。
[0031]
图2为本发明制备的4
‑
甲基磺酰苯胺的核磁共振氢谱(氘代二甲基亚砜作为溶剂)。具体实施方式
[0032][0033]
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0034]
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0035]
本发明提供一种合成多官能团苯胺的光促酶催化制备方法，包括如下步骤：
[0036]
以式i所示多官能团硝基苯为反应底物，在小分子醇
‑
缓冲液反应体系中，在光催化剂和过氧化酶(其制备方法见实施例1)存在下，光照下反应，得到式ii所示氧官能化的苯胺，
[0037][0038]
式i中，r可为h、烷基、烷氧基、卤素、卤素取代的烷基、羰基、巯基、羧基、磺酸基、偶氮基中的一种或多种；
[0039]
x可为
‑
ch2、乙烯基、s中的任一种；
[0040]
r’可为c1
‑
c6烷基、酯基、羧基、羰基中的一种，具体可为甲基；
[0041]
式ii中r、r’分别同式i中r、r’；
[0042]
式ii中y为含氧基团；
[0043]
当式i中x为
‑
ch2时，式ii中的y为
[0044]
当式i中x为乙烯基时，式ii中的y为
[0045]
当式i中x为s时，式ii中的y为
[0046]
反应体系中，多官能团硝基苯的浓度可为1.0mmol/l
‑
100mmol/l，具体可为2.5
‑
10mmol/l；
[0047]
所述小分子醇可为甲醇、乙醇、异丙醇中的一种或几种的混合物；
[0048]
小分子醇占反应体系体积的1
‑
50％；
[0049]
所述缓冲溶液可为磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液中的任一种，其ph值为3.5
‑
11，具体可为5
‑
9；
[0050]
所述光催化剂可为g
‑
c3n4，tio2，bivo4、cds、pt、pd以及au/zro2及其掺杂的一种或
几种，具体可为g
‑
c3n4；
[0051]
所述光催化剂与多官能团硝基苯的配比可为2.5
‑
20mg：2.5
‑
50mmol；
[0052]
所述过氧化酶可为来源于茶树菇、球毛壳菌、辐毛小鬼伞菌、小应伞等的过氧化酶或其突变体，以及来源于辣根、海洋真菌leptoxyphium fumago等的过氧化物酶或其突变体，具体可为upo酶；
[0053]
所述过氧化酶或其突变体以全细胞、粗酶粉、粗酶液或者纯酶的形式发挥催化作用；
[0054]
反应体系中，过氧化物酶的浓度可为100nmol/l
‑
5umol/l，具体可为200nmol/l
‑
1000nmol/l(0.02～04u/ml，1u为室温下，在1分钟内能转化1微摩尔对硝基乙苯所需的酶量)。
[0055]
所述反应的反应时间可为15
‑
25h，反应温度可为25
‑
30℃。
[0056]
本发明的优点是：
[0057]
(1)研制了一种合成多官能团苯胺的光促酶催化方法，可以通过一锅一步法直接制备多官能团苯胺，这种化合物可作为多种药物的中间体。
[0058]
(2)制备过程中除使用水与小分子醇类外，没有使用其他任何溶剂。该方法属于绿色制备方法，并获具有较高的原子经济利用性。
[0059]
(3)制备工艺简便，得率高，成本低。
[0060]
下面结合具体实施来进一步描述本发明。
[0061]
下述实施例中采用的upo酶通过如下方法制备得到：
[0062]
全基因合成aaeupo(genbank:fm872458.1)基因，并将其构建到分泌表达载体ppic9k上，将构建的分泌载体转化到毕赤酵母gs115宿主菌中。挑取单菌落置于25ml bmgy培养基中，于30℃，250rpm培养至od600＝2
‑
6，室温下离心收集菌体，用bmmy重悬菌体，使od600＝1.0，将上述所得菌液置于1l的摇瓶中，用双层纱布或者粗棉布封口，放置于28℃，250rpm摇床中继续生长，每24h向培养基中添加100％甲醇至终浓度为0.5
‑
1.0％之间。培养96h收集培养液，培养液通过在4℃下以8000rpm离心2小时至澄清。上清液通过20μm过滤器过滤并保持在
‑
80℃。aaeupo活性通过在ph 5.0的napi缓冲液中使用abts测定法测定；
[0063]
蛋白质纯化：将上清液浓缩透析到100mm磷酸钠(ph 7.0)。使用ngc色谱系统(biorad)一步纯化aaeupo。将浓缩上清液与q sepharose ff 30
‑
ml阴离子交换柱进行结合，流速为5ml/min。用90ml、100mm磷酸钠(ph 7.0)洗涤，用0～250mm nacl梯度洗涤杂蛋白，然后用250～500mm梯度nacl洗涤目标蛋白，75ml 500mm nacl洗柱子，将获得的目标蛋白进行合并、浓缩，并用100mm磷酸钠缓冲液(ph 7.0)进行透析。纯化获得aaeupo蛋白通过12％sds
‑
page凝胶验证纯度和浓度。
[0064]
实施例1：
[0065]
化合物r
‑1‑
(4
‑
氨苯基)乙醇的制备：
[0066][0067]
在4ml反应瓶中，加入g
‑
c3n4光催化剂15mg，750微升磷酸盐缓冲溶液(ph＝7.5)，加
入200微升甲醇，加入50微升对硝基乙苯的甲醇溶液(100mmol/l)，加入20微升过氧化酶(upo酶，500nmol/l)。
[0068]
上述反应体系于30℃水浴锅中磁子搅拌反应18小时后，结束反应，取100微升反应液，加入200微升乙酸乙酯，萃取，无水硫酸钠干燥，气相色谱检测分析，纯度99％，收率80％。
[0069]
图1为制得的(r)
‑1‑
(4
‑
氨苯基)乙醇的核磁共振氢谱(氘代氯仿作为溶剂)。
[0070]
实施例2：
[0071]
如下化合物的制备：
[0072][0073]
在4ml反应瓶中，加入g
‑
c3n4光催化剂15mg，750微升磷酸盐缓冲溶液，加入200微升甲醇，加入50微升顺式
‑
对硝基苯丙烯的甲醇溶液(100mmol/l)，加入20微升过氧化酶(upo酶，500nmol/l)。
[0074]
上述反应体系于30℃水浴锅中磁子搅拌反应18小时后，结束反应，取100微升反应液，加入200微升乙酸乙酯，萃取，无水硫酸钠干燥，气相色谱检测分析。产物收率80％。
[0075]
实施例3：
[0076]
化合物4
‑
甲基磺酰苯胺的制备：
[0077][0078]
在4ml反应瓶中，加入g
‑
c3n4光催化剂15mg，750微升磷酸盐缓冲溶液，加入200微升甲醇，加入50微升4
‑
硝基茴香硫醚的甲醇溶液(100mmol/l)，加入20微升过氧化酶(upo酶，500nmol/l)。
[0079]
上述反应体系于30℃水浴锅中磁子搅拌反应18小时后，结束反应，取100微升反应液，加入200微升乙酸乙酯，萃取，无水硫酸钠干燥，气相色谱检测分析。产品的收率85％。
[0080]
图2为制得的4
‑
甲基磺酰苯胺的核磁共振氢谱(氘代二甲基亚砜作为溶剂)。
[0081]
实施例4
[0082]
在4ml反应瓶中，加入tio2光催化剂15mg，750微升磷酸盐缓冲溶液(ph＝7.5)，加入200微升甲醇，加入50微升对硝基乙苯的甲醇溶液(100mmol/l)，加入20微升过氧化酶(upo酶，500nmol/l)。
[0083]
上述反应体系于30℃水浴锅中磁子搅拌反应20小时后，结束反应，取100微升反应液，加入200微升乙酸乙酯，萃取，无水硫酸钠干燥，气相色谱检测分析，纯度84％，收率75％。
[0084]
实施例5
[0085]
在4ml反应瓶中，加入bivo4光催化剂22mg，750微升磷酸盐缓冲溶液(ph＝7.5)，加入100微升甲醇，加入50微升对硝基乙苯的甲醇溶液(100mmol/l)，加入25微升过氧化酶(upo酶，500nmol/l)。
[0086]
上述反应体系于30℃水浴锅中磁子搅拌反应23小时后，结束反应，取100微升反应液，加入200微升乙酸乙酯，萃取，无水硫酸钠干燥，气相色谱检测分析，纯度99％，收率93％。
[0087]
以上所述，实施案例仅为本发明较好的实施方式，本领域的技术人员应当理解的是，实施示例并不是范例性的，不对本发明的保护范围构成任何限制。任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明所提出的的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思，在其细节或者形式的做出等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。