CD3结合分子的制作方法

cd3结合分子
技术领域
1.本发明有关于抗体领域，特别涉及治疗抗体领域。此类抗体可用于治疗人类。更具体地，本发明涉及用于治疗肿瘤的抗体且优选为双特异性或多特异性抗体。


背景技术：

2.结合人类cd3的单株抗体是第一批开发用于人类治疗用途的抗体。单株cd3结合抗体典型用于其的免疫抑止性质，例如于移植排斥方面。针对t细胞上的cd3及针对癌细胞上的表面标靶抗原为双特异性的抗体，能够连接任何种类的t细胞与癌细胞，独立于t细胞受体特异性、共刺激或肽抗原呈现。这些双特异性t细胞衔接(t
‑
cell engaging)抗体于治疗各种癌症及赘瘤性生长方面显现出很大的希望。
3.本发明的目的是要提供新的抗体，其具有cd3结合性质，在种类方面不一定是数量的性质，具有改良的特征，有相对低的亲和力，有较高的细胞毒性，该抗体适合用于t细胞及效应子细胞衔接的肿瘤免疫学应用，以及相反地，要提供新的抗体其具有cd3结合，其有相对高的亲和力，有较低的细胞毒性，该抗体适合用于t细胞及效应子细胞向下调节的自体免疫应用。本发明进一步的目的是要提供t细胞衔接cd3结合蛋白及抗体，其具有以上的结合至少一另外的膜缔合分子的性质。


技术实现要素：

4.本发明提供一种会结合人类cd3的抗原结合蛋白，优选为一抗体，其包括一抗体可变结构域，该抗体可变结构域包括一重链可变区及一轻链可变区，其中该重链可变区包括一cdr1、cdr2及cdr3，该cdr1、cdr2及cdr3包括下列氨基酸序列：
5.cdr1：sfgis
6.cdr2：gfipvlgtanyaqkfqg
7.cdr3：rgnwnpfdp；或
8.包括下列氨基酸序列：
9.cdr1：sx1tftis；
10.cdr2：giipx2fgtityaqkfqg；
11.cdr3：rgnwnpfdp；
12.其中
13.x1＝k或r；
14.x2＝l或i。
15.在优选的具体例中x1＝k；并且x2＝l；
16.在另一优选的具体例中，x1＝r；并且x2＝i。
17.在优选具体例中，本发明提供一种会结合人类cd3的抗原结合蛋白，优选为一抗体，其包括一抗体可变结构域，该抗体可变结构域包括一重链可变区及一轻链可变区，其中该重链可变区包括一cdr1、cdr2及cdr3，该cdr1、cdr2及cdr3包括下列氨基酸序列：
18.cdr1：sktltis；
19.cdr2：giipifgsityaqkfqd；
20.cdr3：rgnwnpfdp；或
21.包括下列氨基酸序列：
22.cdr1：gsgis；
23.cdr2：gfipffgsanyaqkfrd；
24.cdr3：rgnwnpx
13
dp；
25.其中
26.x
13
＝l或f。
27.本发明进一步提供一种会结合人类cd3的抗原结合蛋白，优选为一抗体，其包括一抗体可变结构域，该抗体可变结构域包括一重链可变区及一轻链可变区，其中该重链可变区包括氨基酸序列
28.evqlvqsgaevkkpgssvkvsckasggtfrsfgiswvrqapgqglewmggfipvlgtanyaqkfqgrvtiiadkstntaymelsslrsedtavyycarrgnwnpfdpwgqgtlvtvss；
29.qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasgdafksktftiswvrqapgqglewlggiiplfgtityaqkfqgrvtitadkstntafmelsslrsedtamyyctrrgnwnpfdpwgqgtlvtvss；
30.evqlvqsgselkkpgssvkvsckasgvtfnsrtftiswvrqapgqglewlgsiipifgtityaqkfqgrvtitadkststafmeltslrsedtaiyyctrrgnwnpfdpwgqgtlvtvss；
31.qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasggtfrgsgiswvrqapgqglewvggfipffgsanyaqkfrdrvtitadksattaymelsslrsedtaiyycakrgnwnpldpwgqgtlvtvss；
32.qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasgvtfksktltiswvrqapgqglewlggiipifgsityaqkfqdrvsitadkstntaylelnslrsedtaiyycarrgnwnpfdpwgqgtlvtvss；或
33.evqlvqsgaevkkpgssvkvsckasggtfrgsgiswvrqapgqglewvggfipffgsanyaqkfrdrvtitadksattaymelsslrsedtaiyycakrgnwnpfdpwgqgtlvtvss；
34.于此类cdrs以外的一个或多个位置处具有0
‑
10个、优选0
‑
5个氨基酸变异、插入、缺失、取代、加入或其组合。
35.进一步提供一种会结合人类cd3的抗原结合蛋白，优选为一抗体，其包括一抗体可变结构域，该抗体可变结构域包括一重链可变区及一轻链可变区，其中该重链可变区包括一cdr1、cdr2及cdr3，该cdr1、cdr2及cdr3包括下列氨基酸序列：
36.cdr1：rx3wig；
37.cdr2：iiypgdsdtryspsfqg；
38.cdr3：x4iryfx5wsedyhyyx6dv；
39.其中
40.x3＝f或y；
41.x4＝h或n；
42.x5＝d或v；
43.x6＝l或m。
44.在一具体例中x3＝f；x4＝h；x5＝d；及x6＝l。在另一具体例中x3＝y；x4＝n；x5＝v；及x6＝m。
45.本发明进一步提供一种会结合人类cd3的抗原结合蛋白，优选为一抗体，其包括一抗体可变结构域，该抗体可变结构域包括一重链可变区及一轻链可变区，其中该重链可变区包括氨基酸序列
46.evqlvqsgaevkkpgeslkisckgsgysftrfwigwvrqmpgkglewmgiiypgdsdtryspsfqgqvtisadkststaylqwsslkasdtgmyycvrhiryfdwsedyhyyldvwgkgttvtvss；或
47.evqlvesgaevkkpgeslkisckgsgysftrywigwvrqmpgkglewmgiiypgdsdtryspsfqgqvtisadksistaylqwsslkasdtamyycvrniryfvwsedyhyymdvwgkgttvtvss；
48.于此类cdrs以外的一个或多个位置处具有0
‑
10个、优选0
‑
5个氨基酸变异、插入、缺失、取代、加入或其组合。
49.进一步提供一种会结合人类cd3的抗原结合蛋白，优选为一抗体，其包括一抗体可变结构域，该抗体可变结构域包括一重链可变区及一轻链可变区，其中该重链可变区包括一cdr1、cdr2及cdr3，该cdr1、cdr2及cdr3包括下列氨基酸序列：
50.cdr1：syals；
51.cdr2：gisgsgrttwyadsvkg；
52.cdr3：dggysygpywyfdl。
53.进一步提供一种会结合人类cd3的抗原结合蛋白，优选为一抗体，其包括一抗体可变结构域，该抗体可变结构域包括一重链可变区及一轻链可变区，其中该重链可变区包括一cdr1、cdr2及cdr3，该cdr1、cdr2及cdr3包括下列氨基酸序列：
54.cdr1：syals；
55.cdr2：aisgsgrttwyadsvkg；
56.cdr3：dggytygpywyfdl。
57.进一步提供一种会结合人类cd3的抗原结合蛋白，优选为一抗体，其包括一抗体可变结构域，该抗体可变结构域包括一重链可变区及一轻链可变区，其中该重链可变区包括氨基酸序列
58.qvqlvqsggglvqpggslrlscatsgfkfssyalswvrqapgkglewvsgisgsgrttwyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycardggysygpywyfdlwgrgtlvtvss；或
59.qvqlvesggglvqpggslrlscatsgftfisyalswvrqapgkglewvsaisgsgrttwyadsvkgrftisrdnskntlflqmnslraedtavyycardggytygpywyfdlwgrgtlvtvss；
60.于此类cdrs以外的一个或多个位置处具有0
‑
10个、优选0
‑
5个氨基酸变异、插入、缺失、取代、加入或其组合。
61.还提供一种会结合人类cd3的抗原结合蛋白，优选为一抗体，其包括一抗体可变结构域，该抗体可变结构域包括一重链可变区及一轻链可变区，其中该重链可变区包括一cdr1、cdr2及cdr3，该cdr1、cdr2及cdr3包括下列氨基酸序列：
62.cdr1：dytmh；
63.cdr2：diswssgsigyadsvkg；
64.cdr3：dhrgygdyegggfdy。
65.还提供一种会结合人类cd3的抗原结合蛋白，优选为一抗体，其包括一抗体可变结构域，该抗体可变结构域包括一重链可变区及一轻链可变区，其中该重链可变区包括一cdr1、cdr2及cdr3，该cdr1、cdr2及cdr3包括下列氨基酸序列：
66.cdr1：dytmh；
67.cdr2：diswsx7gx8x9x
10
yadsvkg；
68.cdr3：dhx
11
gygdyegggfdx
12
；
69.其中
70.x7＝s或g；
71.x8＝s或t；
72.x9＝i或t；
73.x
10
＝g或y；
74.x
11
＝r或m；
75.x
12
＝h或y。
76.在一个具体例中，x7、x8、x9和x
10
为s、s、i和g，并且x
11
和x
12
为r和h。在另一具体例中，x7、x8、x9和x
10
为g、s、i和y，并且x
11
和x
12
为r和y。在另一具体例中，x7、x8、x9和x
10
为s、t、t和g，并且x
11
和x
12
为m和y。
77.进一步提供一种会结合人类cd3的抗原结合蛋白，优选为一抗体，其包括一抗体可变结构域，该抗体可变结构域包括一重链可变区及一轻链可变区，其中该重链可变区包括氨基酸序列
78.evqlvesggglvqpgrslrlscatsgfnfddytmhwvrqapgkglewvsdiswssgsigyadsvkgrftisrdnaknslwlqmnslrtedtalyfcakdhrgygdyegggfdywgqgtlvtvss；或
79.evqlvesggglvqpgrslrlscatsgftfddytmhwvrqapgkglewvsdiswssgsigyadsvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtalyfcakdhrgygdyegggfdhwgqgtlvtvss；或
80.evqlvesggvvvqpggslrlscaasgftfddytmhwvrqapgkglewvsdiswsggsiyyadsvkgrftisrdnsknslylqmnslrtedtalyycakdhrgygdyegggfdywgrgtlvtvss；或
81.evqlvesggglvqpgrslrlscvtsgftfddytmhwvrqapgkglewvsdiswssgttgyadsvkgrftisrdnakdslylqmnslrtedtalyycakdhmgygdyegggfdywgqgtlvtvss；
82.于此类cdrs以外的一个或多个位置处具有0
‑
10个、优选0
‑
5个氨基酸变异、插入、缺失、取代、加入或其组合。
83.一种本发明的抗原结合蛋白，优选为一抗体，的轻链可变区优选包括一共同的轻链可变区。该共同的轻链可变区优选包括一igvκ1
‑
39轻链可变区。该轻链可变区优选为一生殖系列igvκ1
‑
39*01可变区。该轻链可变区优选包括κ轻链igvκ1
‑
39*01/igjκ1*01或igvκ1
‑
39*01/igjκ5*01。在一具体例中该轻链可变区包括人类生殖系列κ轻链igvκ1
‑
39*01/igjκ1*01或igvκ1
‑
39*01/igjκ5*01。该轻链可变区优选包括氨基酸序列
84.diqmt qspss lsasv gdrvt itcra sqsis sylnw yqqkp gkapk lliya asslq sgvps rfsgs gsgtd ftlti sslqp edfat yycqq systp ptfgq gtkve ik或diqmt qspss lsasv gdrvt itcra sqsis sylnw yqqkp gkapk lliya asslq sgvps rfsgs gsgtd ftlti sslqp edfat yycqq systp pitfg qgtrl eik
85.具有0
‑
5个氨基酸变异、插入、缺失、取代、加入或其的组合。
86.该抗原结合蛋白，优选为一种抗体，优选为一种双特异性或多特异性抗体。
87.该抗体优选包括一种如本文所示的会结合人类cd3的h/l链组合以及一种会结合肿瘤抗原的h/l链组合。该会结合肿瘤抗原的h/l链组合优选结合人类bcma、cd19、cd20、
cd30、cd33、cd38、cd44、cd123、cd138、cea、clec12a、cs
‑
1、egfr、egfrviii、epcam、dll3、lgr5、msln、folr1、folr3、her2、hm1.24、mcsp、pd
‑
l1、psma蛋白或其的一变异体，在优选具体例中egfr、pd
‑
l1或clec12a。
88.该抗体、双特异性或多特异性抗体优选为一种人类或人化抗体。
89.该双特异性或多特异性抗体优选包括具有兼容的异质二聚合域的二个不同的免疫球蛋白重链。该兼容的异质二聚合域优选为兼容的免疫球蛋白重链ch3异质二聚合域。
90.该双特异性或多特异性抗体优选为具有突变型ch2和/或下部铰链域的igg抗体以使得该双特异性或多特异性igg抗体与fc
‑
γ受体的交互作用减少。该突变型ch2和/或下部铰链域优选包括位置235和/或236(根据eu编号)的氨基取代，优选为l235g和/或g236r取代。
91.该双特异性或多特异性抗体优选包括一共同的轻链。
92.本发明进一步提供一种如本文所示的抗原结合蛋白或抗体，供用于治疗有需要的一个体。该个体优选有癌症或要治疗癌症。一种具有mf8057、mf8058、mf8078或mf8508的cdrs和/或vh序列，或其具有0
‑
10个氨基酸取代、变异、插入、加入或缺失的变异体，的抗原结合蛋白或抗体优选用于治疗，特别是用于一种包括局部投予和/或局部释放该抗原结合蛋白或抗体的治疗。一种具有mf9249、mf9267、mf8397的cdrs和/或vh序列，或其具有0
‑
10个氨基酸取代、变异、插入、加入或缺失的变异体，的抗原结合蛋白或抗体优选用于治疗有过度活化的免疫系统，例如自体免疫疾病的一个体。
93.除另有其他明确规定外，否则本发明的抗体优选为一种双特异性抗体。该双特异性抗体优选至少结合人类cd3。此外，该双特异性抗体优选与优先表现于人类肿瘤细胞上的至少一表面分子结合。在优选具体例中，该双特异性抗体结合bcma、cd19、cd20、cd30、cd33、cd38、cd44、cd123、cd138、cea、clec12a、cs
‑
1、egfr、egfrviii、epcam、dll3、lgr5、msln、pd
‑
l1、folr1、folr3、her2、hm1.24、mcsp或psma。在更优选的具体例中，该双特异性抗体与egfr或clec12a结合。在更优选的具体例中，该多特异性抗体与egfr及pd
‑
l1结合。
94.本发明进一步提供一种药学组合物，其包括如本发明的抗体。
95.进一步提供一种如本发明的抗体，其进一步包括一标记，优选为供用于活体内成像的标记。
96.本发明还提供一种用于治疗一具有一肿瘤或处于有一肿瘤的风险的个体的方法，其包括投予如本发明的双特异性或多特异性抗体至该个体。还提供一种如本发明的双特异性或多特异性抗体供用于治疗具有一肿瘤或处于有一肿瘤的风险的个体。进一步提供本发明的抗体供用于制备用于治疗一具有一肿瘤或处于有一肿瘤的风险的个体的一药剂的用途。在优选具体例中，肿瘤为egfr或clec12a阳性肿瘤或egfr及pd
‑
l1阳性肿瘤。
具体实施方式
97.一种“抗体”是一种属于蛋白质的免疫球蛋白类的蛋白质分子，其含有结合抗原上的表位的一个或多个域，其中这些域衍生自一抗体的可变区或与一抗体的可变区共享序列同源性。
98.抗体结合有不同的特质，包括特异性和亲和力。特异性决定该结合域特异性地结合那个抗原或其表位。亲和力是对于一个特定抗原或表位的结合量值的量度(measure)。在
此可方便地注意到：一个抗体的“特异性”意指其对于一个特定抗原的选择性，而“亲和力”意指介于该抗体的抗原结合地址以及其结合的表位之间的交互作用量值。抗体典型由基本结构单元组成
‑
各基本结构单元有二重链及二轻链。治疗用途的抗体优选尽可能接近待治疗个体的天然抗体(譬如人类个体的人类抗体)。如本发明的抗体不限于任何特定格式或其生产方法。
99.因此，如此处所用的“结合特异性(binding specificity)”意指一单独的抗体结合地址跟一抗原决定位反应的能力。通常，本发明的抗体的结合地址座落在包括此类可变结构域的fab部分的此类可变结构域内，并且从该重链及轻链的高度变异区域被构造。
100.本发明的抗体优选为一igg抗体，优选为一igg1抗体。全长igg抗体可能是优选的，因为其有利的半生期且由于为了免疫原性的理由，希望保持接近完全自体(人类)分子。igg1基于其在人体内的长循环半生期而是有利的。为了要预防或避免在人类的免疫原性，一种根据本发明的双特异性全长igg抗体是一种人类igg1是优选的。
[0101]“双特异性抗体”为一种如本文所述的抗体其中该抗体的一可变结构域与第一抗原结合而该抗体的第二可变结构域与第二抗原结合，其中该第一与第二抗原不是完全相同的。术语“双特异性抗体”还包括双特异性抗体(biparatopic antibodies)，其中该抗体的一可变结构域结合一抗原上的第一表位而该抗体的第二可变结构域结合该抗原上的第二表位。该术语进一步包括抗体，其中至少一vh能特异性识别第一抗原且与免疫球蛋白可变结构域的该至少一vh配对的vl能特异性识别第二抗原。生成的vh/vl对会结合抗原1或抗原2，且称为“二合一抗体”，其于例如wo 2008/027236、wo 2010/108127及schaefer等人(cancer cell 20，472
‑
486，2011年十月)乙文内有描述。如本发明的双特异性抗体不限于任何特定双特异性格式或其生产方法。一种双特异性抗体是一种多特异性抗体。
[0102]
如本文中所提及的多特异性多聚体或抗体涵盖属于蛋白质的免疫球蛋白类的蛋白质分子，其含有结合抗原上的表位的二个或多个域，其中这些域衍生自一抗体的可变区或与一抗体的可变区共享序列同源性，以及包括如本技艺所知结合三个或多个抗原的蛋白质分子，包括如于wo2019/190327中所述者。
[0103]“抗原”是一种能够在一宿主生物内诱发一免疫反应(以生成一抗体)的分子和/或一抗体靶向的分子。以分子级(molecular level)而言，一种抗原特征在于其被一个抗体的抗原结合地址所结合的能力。又，抗原的混合物可被视为是一种“抗原”，即熟习本领域技艺的人士将会理解到有时候肿瘤细胞的溶解产物或病毒颗粒可表示为“抗原”，而这样的肿瘤细胞溶解产物或病毒颗粒制备物存在有许多抗原决定位。一种抗原包括至少一种但通常是多种表位。针对如本文所公开的结合蛋白及抗体，抗原典型和细胞膜有关联且存在于细胞膜的细胞外部分之上。
[0104]“表位”或“抗原决定位”是指一抗原上与免疫球蛋白或抗体特异性结合的地址。表位可由相邻的氨基酸或由蛋白的三级折叠而并列的不连续氨基酸(分别为所谓的线形或构形表位)形成。自相邻的、线形氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时得以保持，而由三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时会丧失构形。表位通常在独特的空间构形中包括了3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。
[0105]
术语“重链”或“免疫球蛋白重链”包括来自任一种生物的一免疫球蛋白重链恒定区域序列，而且除非另有规定，否则会包括一重链可变结构域。除非另有规定，否则术语重
链可变结构域会包括三个重链cdrs以及四个fr区域。重链的片段包括cdrs、cdrs与frs及其的组合。一种典型的重链在该可变结构域的后(从n
‑
端至c
‑
端)具有一ch1域、一铰链、一ch2域以及一ch3域。一种重链的一功能性片段包括一种能够特异性地识别一抗原并且包括至少一cdr的片段。
[0106]
术语“轻链”包括来自任一种生物的一免疫球蛋白轻链可变结构域或v
l
(或其功能性片段；以及一免疫球蛋白恒定域或c
l
或其功能性片段的序列。除非另有规定，否则术语轻链可包括一选自于人类κ、λ及其的一组合的轻链。除非另有规定，否则轻链可变(v
l
)结构域典型包括三个轻链cdrs以及四个架构(fr)区域。一般而言，一全长轻链从n
‑
端至c
‑
端包括了一种包括fr1
‑
cdr1
‑
fr2
‑
cdr2
‑
fr3
‑
cdr3
‑
fr4的v
l
域以及一种轻链恒定域。本发明可使用的轻链包括，例如不会选择性地结合一种选择性地由此类重链所结合的表位的此类。
[0107]
供用于本发明的抗体的合适的轻链包括一种共同的轻链(clc)，诸如可通过筛选现有的抗体库[湿式库(wet libraries)或电脑模拟(in silico)]中最常使用的轻链而鉴定出的此类，其中此类轻链大体上不会干扰此类重链的表位结合域的亲和力和/或选择性，但也适合于与一系列的重链配对。举例来说，一种合适的轻链包括一种来自一基因转殖动物，诸如的物，该基因转殖动物具有嵌入至其基因体的内的共同的轻链且其可用来产生大量的(large panels of)共同的轻链抗体其在重链处具有多样性的且在暴露于一抗原的时能特异性地结合该抗原。
[0108]
如本发明的术语“共同的轻链”是指可能完全相同或有一些氨基酸序列差异却不影响本发明的抗体的结合特异性，即此类差异不会实质地影响功能性结合区域的形成的轻链。
[0109]
例如于本文所使用的共同的轻链的定义范围内，要制备或找到不是完全相同但仍然在功能上等效的可变链是可能的，譬如通过导入且测试保留型氨基酸变化来进行，当与一同源链等等配对时，区域内的氨基酸变化不会对结合特异性起作用或只是起部分作用。这些变异体因此还能够结合不同的同源链而且形成功能性抗原结合域。如此处所用的术语共同的轻链因而是指可能完全相同或有一些氨基酸序列差异但在与一重链配对后保留了所形成的抗体的结合特异性的轻链。某些共同的轻链和这些功能上等效的变异体的组合涵盖在术语共同的轻链的内。关于共同的轻链的用途的详细说明可参见wo 2004/009618及wo2009/157771。
[0110]“fab”是指一种包括一个可变区的结合域，通常是一种包括有一配对的重链可变区及轻链可变区的结合域。fab可包括恒定区域域，其包括一个ch1及vh域与一个恒定轻链域(cl)及vl域配对。这些配对可以，例如，经由一个位在ch1和cl域的处的双硫键来作为共价键联而发生。
[0111]“单链可变片段”(scfv)是指一种结合域其包括经由例如长度由大约10至大约25个氨基酸的键接子，例如肽键接子，所连结的vh域及vl域。
[0112]
如本发明的术语“全长igg”或“全长抗体”定义为包括基本上完整的igg，然而其不一定具有完整的igg的全部功能。为避免疑义，全长igg含有二重链及二轻链。各链含有恒定(c)及可变(v)区域，其能细分为命名为ch1、ch2、ch3、vh及cl、vl的域。igg抗体经由fab部分内含的可变区域与抗原结合，且于结合后能经由恒定域，主要是经由fc部分，来与免疫系统的分子及细胞交互作用。如本发明的全长抗体包括其中可能存在提供所欲特征的突变的
igg分子。全长igg不应有任何域的实质部分的缺失。然而，术语“全长igg”包括其中缺失一或数个氨基酸残基，但没有实质改变产生的igg分子的结合特征的igg分子。举例来说，此igg分子能有1至10个之间的氨基酸残基缺失，优选于非cdr区域内，其中缺失的氨基酸对igg的结合特异性不是必需的。
[0113]
当此提及核酸或氨基酸序列时，“同一性百分率(％)”定义为为了进行最佳比较而排列匹配序列后，候选序列的残基与一选定序列的残基为同一的百分比。要比较的两个序列中的任何一个可引入间隙以使两个序列的排列比对达成最大。此排列比对可以在要比较的全长序列上进行。任择地，排列比对可以于较短的长度上进行，例如大约20、大约50、大约100或更多核酸/碱基或氨基酸。序列同一性为于报告的排列比对区域上，两个序列之间同一的匹配的百分比。
[0114]
序列的比较及两个序列之间的序列同一性百分率的测定可使用数学算法完成。熟习此项技术者会知道可用数种不同的计算机程序来排列比对二个序列且判定二个序列之间的同一性(kruskal，j.b.，1983)an overview of sequence comparison in d.sankoff and j.b.kruskal,(ed.),time warps,string edits and macromolecules:the theory and practice of sequence comparison,pp.1
‑
44 addison wesley)。
[0115]
关于本发明及本文所述的序列，二个核酸序列之间的序列同一性百分率可使用vector nti program advance 10.5.2软件的alignx应用程序、使用预设来测定，其利用修改的clustalw算法(thompson，j.d.，higgins，d.g.，and gibson t.j.(1994)nuc.acid res.22:4673
‑
4680)、swgapdnarnt得分矩阵、15之间隙开放罚分(gap open penalty)以及6.66之间隙延伸罚分(gap extension penalty)。氨基酸序列可使用vector nti program advance 11.5.2软件的alignx应用、使用默认被排列比对，其利用修改的clustalw算法(thompson，j.d.，higgins，d.g.，and gibson t.j.，1994)、blosum62mt2得分矩阵、10之间隙开放罚分及0.1之间隙延伸罚分。
[0116]
术语“超级群(super
‑
cluster)”或“超级群(supercluster)”在此使用于意指，基于相同的vh v基因节段使用且于hcdr3内具有至少70％的序列同一性及相同的hcdr3长度，的一群的殖株(clones)及其能生产的结合域。
[0117]
因而，在优选具体例中，本发明提供一种“超级群(super
‑
cluster)”或“超级群(supercluster)”，其包括，基于相同的vh v基因节段使用且于hcdr3内具有至少70％的序列同一性及相同的hcdr3长度，的一组的殖株及其能生产的结合域。在优选具体例中，该序列同一性为80％，更优选为90％，最佳为95％的序列同一性，但有条件是排除包括一编码hcdr3序列dggysygpywyfdl及dhrgygdyegggfdy的核酸的一殖株，包括编码hcdr2序列gfipvlgtanyaqkfqg、giiplfgtityaqkfqg及siipifgtityaqkfqg的核酸的殖株，或有条件是排除包括编码vh序列
[0118]
qvqlvqsggglvqpggslrlscatsgfkfssyalswvrqapgkglewvsgisgsgrttwyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycardggysygpywyfdlwgrgtlvtvss；
[0119]
evqlvesggglvqpgrslrlscatsgfnfddytmhwvrqapgkglewvsdiswssgsigyadsvkgrftisrdnaknslwlqmnslrtedtalyfcakdhrgygdyegggfdywgqgtlvtvss；
[0120]
evqlvqsgaevkkpgssvkvsckasggtfrsfgiswvrqapgqglewmggfipvlgtanyaqkfqgrvtiiadkstntaymelsslrsedtavyycarrgnwnpfdpwgqgtlvtvss；
[0121]
qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasgdafksktftiswvrqapgqglewlggiiplfgtityaqkfqgrvtitadkstntafmelsslrsedtamyyctrrgnwnpfdpwgqgtlvtvss；及
[0122]
evqlvqsgselkkpgssvkvsckasgvtfnsrtftiswvrqapgqglewlgsiipifgtityaqkfqgrvtitadkststafmeltslrsedtaiyyctrrgnwnpfdpwgqgtlvtvss
[0123]
的核酸的殖株，或有条件是来自该组的殖株包括核酸，该核酸是编码由一种双特异性抗体所组成或经设计而由一种双特异性抗体所组成的hcdr3。
[0124]
术语“超级群(super
‑
cluster)1”或“超级群(supercluster)1”在此使用于意指，基于与该超级群的成员相同的vh v基因节段使用(vh1
‑
69)且于hcdr3内具有至少70％的序列同一性及相同的hcdr3长度，的一组的殖株及其能生产的结合域。包括例如mf8048、mf8056、mf8057、mf8058、mf8078及mf8101。在另一优选的具体例中，本文的抗cd3抗体基于vh1
‑
69的相同的vh v基因节段使用和/或于hcdr3内具有至少80％的同一性及相同的hcdr3长度，更优选为于hcdr3内有90％或最佳为95％的同一性。在另一优选的具体例中，本文的抗cd3抗体基于vh1
‑
69的相同的vh v基因节段使用和/或相较于编码的cdr3节段rgnwnpfdp而言，于hcdr3内具有至少80％的同一性及相同的hcdr3长度，优选为于hcdr3内至少90％的序列同一性及相同的hcdr3长度，更优选为95％或最佳为98％的同一性及相同的hcdr3长度，但有条件是排除包括编码hcdr2序列gfipvlgtanyaqkfqg、giiplfgtityaqkfqg及siipifgtityaqkfqg的核酸的殖株，或有条件是排除包括编码vh序列
[0125]
evqlvqsgaevkkpgssvkvsckasggtfrsfgiswvrqapgqglewmggfipvlgtanyaqkfqgrvtiiadkstntaymelsslrsedtavyycarrgnwnpfdpwgqgtlvtvss；
[0126]
qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasgdafksktftiswvrqapgqglewlggiiplfgtityaqkfqgrvtitadkstntafmelsslrsedtamyyctrrgnwnpfdpwgqgtlvtvss；
[0127]
evqlvqsgselkkpgssvkvsckasgvtfnsrtftiswvrqapgqglewlgsiipifgtityaqkfqgrvtitadkststafmeltslrsedtaiyyctrrgnwnpfdpwgqgtlvtvss；
[0128]
的核酸的殖株，或有条件是来自该组的殖株包括核酸，该核酸编码由一种双特异性抗体所组成或经设计而由一种双特异性抗体所组成的hcdr3。术语“超级群(super
‑
cluster)3”或“超级群(supercluster)3”在此使用于意指，基于与该超级群的成员相同的vh v基因节段使用(vh3
‑
23)且于hcdr3内具有至少70％的序列同一性及相同的hcdr3长度，的一组的殖株及其能生产的结合域。包括例如mf8397及mf8562。在另一优选的具体例中，本文的抗cd3抗体基于vh3
‑
23的相同的vh v基因节段使用和/或于hcdr3内具有至少80％的同一性及相同的hcdr3长度，更优选为于hcdr3内有90％或最佳为95％的同一性。在另一优选的具体例中，本文的抗cd3抗体基于vh3
‑
23的相同的vh v基因节段使用和/或相较于编码的cdr3节段dggysygpywyfdl而言，于hcdr3内具有至少80％的同一性及相同的hcdr3长度，优选为于hcdr3内至少90％的序列同一性及相同的hcdr3长度，更优选为95％或最佳为98％的同一性及相同的hcdr3长度，但有条件是排除包括编码hcdr3序列dggysygpywyfdl的核酸的殖株，或有条件是排除包括编码vh序列
[0129]
qvqlvqsggglvqpggslrlscatsgfkfssyalswvrqapgkglewvsgisgsgrttwyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycardggysygpywyfdlwgrgtlvtvss
[0130]
的核酸的殖株，或有条件是来自该组的殖株包括核酸，该核酸编码由一种双特异性抗体所组成或经设计而由一种双特异性抗体所组成的hcdr3。
[0131]
术语“超级群(super
‑
cluster)4”或“超级群(supercluster)4”在此使用于意指，基于与该超级群的成员相同的vh v基因节段使用(vh3
‑
9)且于hcdr3内具有至少70％的序列同一性及相同的hcdr3长度，的一组的殖株及其能生产的结合域。包括例如mf8508、mf8998、mf10401及mf10428。在另一优选的具体例中，本文的抗cd3抗体基于vh3
‑
9的相同的vh v基因节段使用和/或于hcdr3内具有至少80％的同一性及相同的hcdr3长度，更优选为于hcdr3内有90％或最佳为95％的同一性。在另一优选的具体例中，本文的抗cd3抗体基于vh3
‑
9的相同的vh v基因节段使用和/或相较于编码的cdr3节段dhrgygdyegggfdy而言，于hcdr3内具有至少80％的同一性及相同的hcdr3长度，优选为于hcdr3内至少90％的序列同一性及相同的hcdr3长度，更优选为95％或最佳为98％的同一性及相同的hcdr3长度，但有条件是排除包括编码hcdr 3序列dhrgygdyegggfdy的核酸的殖株，或有条件是排除包括编码vh序列
[0132]
evqlvesggglvqpgrslrlscatsgfnfddytmhwvrqapgkglewvsdiswssgsigyadsvkgrftisrdnaknslwlqmnslrtedtalyfcakdhrgygdyegggfdywgqgtlvtvss
[0133]
的核酸的殖株，或有条件是来自该组的殖株包括核酸，该核酸编码由一种双特异性抗体所组成或经设计而由一种双特异性抗体所组成的hcdr3。
[0134]
术语“超级群(super
‑
cluster)7”或“超级群(supercluster)7”在此使用于意指，基于与该超级群的成员相同的vh v基因节段使用(vh5
‑
51)且于hcdr3内具有至少70％的序列同一性及相同的hcdr3长度，的一组的殖株及其能生产的结合域。包括例如mf9249及mf9267。在另一优选的具体例中，本文的抗cd3抗体基于vh5
‑
51的相同的vh v基因节段使用和/或于hcdr3内具有至少80％的同一性及相同的hcdr3长度，更优选为于hcdr3内有90％或最佳为95％的同一性。在另一优选的具体例中，本文的抗cd3抗体基于vh5
‑
51的相同的vh v基因节段使用和/或相较于编码的cdr3节段hiryfdwsedyhyyldv而言，于hcdr3内具有至少80％的同一性及相同的hcdr3长度，优选为于hcdr3内至少90％的序列同一性及相同的hcdr3长度，更优选为95％或最佳为98％的同一性及相同的hcdr3长度。
[0135]
本发明进一步提供一种包括一可变结构域的双特异性抗体，该可变结构域具有一由下列所编码的vh
[0136]
‑
v基因节段vh1
‑
69；或
[0137]
‑
一v基因节段vh1
‑
69的变异体，其包括与该v基因节段的序列为至少70％，优选为至少80％，更优选为至少90％且更优选为至少95％的序列同一性；
[0138]
其中该vh进一步包括
[0139]
‑
mf8048、mf8056、mf8057、mf8058、mf8078或mf8101的一hcdr3；
[0140]
‑
或该hcdr3的一变异体，其包括与该hcdr3为至少70％的序列同一性及该hcdr3相同的长度。
[0141]
在一优选的具体例中，该hcdr3的该变异体包括如该hcdr3相同的长度及与该hcdr3为至少80％的序列同一性，更优选为与该hcdr3的序列为至少90％且更优选为至少95％的序列同一性。
[0142]
在一些具体例中，该双特异性抗体不具有由下列所编码的vh：v基因节段vh1
‑
69；或v基因节段vh1
‑
69的变异体其具有hcdr2序列gfipvlgtanyaqkfqg、或giiplfgtityaqkfqg或siipifgtityaqkfqg。
[0143]
在一些具体例中，该双特异性抗体不具有由下列所编码的vh：v基因节段vh1
‑
69；或v基因节段vh1
‑
69的变异体其具有vh序列
[0144]
evqlvqsgaevkkpgssvkvsckasggtfrsfgiswvrqapgqglewmggfipvlgtanyaqkfqgrvtiiadkstntaymelsslrsedtavyycarrgnwnpfdpwgqgtlvtvss；或
[0145]
qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasgdafksktftiswvrqapgqglewlggiiplfgtityaqkfqgrvtitadkstntafmelsslrsedtamyyctrrgnwnpfdpwgqgtlvtvss；或
[0146]
evqlvqsgselkkpgssvkvsckasgvtfnsrtftiswvrqapgqglewlgsiipifgtityaqkfqgrvtitadkststafmeltslrsedtaiyyctrrgnwnpfdpwgqgtlvtvss。
[0147]
本发明进一步提供一种包括一可变结构域的双特异性抗体，该可变结构域具有一由下列所编码的vh
[0148]
‑
v基因节段vh3
‑
23；或
[0149]
‑
一v基因节段vh2
‑
23的变异体，其包括与该v基因节段的序列为至少70％，优选为至少80％，更优选为至少90％且更优选为至少95％的序列同一性；
[0150]
其中该vh进一步包括
[0151]
‑
mf8397；或mf8562的一hcdr3；
[0152]
‑
或该hcdr3的一变异体，其包括与该hcdr3为至少70％的序列同一性及该hcdr3相同的长度。
[0153]
在优选的具体例中，该hcdr3的该变异体包括如该hcdr3相同的长度及与该hcdr3为至少80％的序列同一性，更优选为与该hcdr3的序列为至少90％，更优选为至少9 3％且更优选为至少95％的序列同一性。
[0154]
在一些具体例中，该双特异性抗体不具有由下列所编码的vh：v基因节段vh3
‑
23；或v基因节段vh3
‑
23的变异体其具有hcdr3序列dggysygpywyfd。
[0155]
在一些具体例中，该双特异性抗体不具有由下列所编码的vh：v基因节段vh3
‑
23；或v基因节段vh3
‑
23的变异体其具有vh序列qvqlvqsggglvqpggslrlscatsgfkfssyalswvrqapgkglewvsgisgsgrttwyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycardggysygpywyfdlwgrgtlvtvss。
[0156]
本发明进一步提供一种包括一可变结构域的双特异性抗体，该可变结构域具有一由下列所编码的vh
[0157]
‑
v基因节段vh3
‑
9；或
[0158]
‑
一v基因节段vh3
‑
9的变异体，其包括与该v基因节段的序列为至少70％，优选为至少80％，更优选为至少90％且更优选为至少95％的序列同一性；
[0159]
其中该vh进一步包括
[0160]
‑
mf8508；mf8998；mf1041；或mf10428的一hcdr3；
[0161]
‑
或该hcdr3的一变异体，其包括与该hcdr3为至少70％的序列同一性及该hcdr3相同的长度。
[0162]
在优选的具体例中，该hcdr3的该变异体包括如该hcdr3相同的长度及与该hcdr3为至少80％的序列同一性，更优选为与该hcdr3的序列为至少90％且更优选为至少9 5％的序列同一性。
[0163]
在一些具体例中，该双特异性抗体不具有由下列所编码的vh：v基因节段vh3
‑
9；或
v基因节段vh3
‑
9的变异体其具有hcdr3序列dhrgygdyegggfdy。
[0164]
在一些具体例中，该双特异性抗体不具有由下列所编码的vh：v基因节段vh3
‑
9；或v基因节段vh3
‑
9的变异体其具有vh序列evqlvesggglvqpgrslrlscatsgfnfddytmhwvrqapgkglewvsdiswssgsigyadsvkgrftisrdnaknslwlqmnslrtedtalyfcakdhrgygdyegggfdywgqgtlvtvss。
[0165]
本发明进一步提供一种包括一可变结构域的双特异性抗体，该可变结构域具有一由下列所编码的vh
[0166]
‑
v基因节段vh5
‑
51；或
[0167]
‑
一v基因节段vh5
‑
51的变异体，其包括与该v基因节段的序列为至少70％，优选为至少80％，更优选为至少90％且更优选为至少95％的序列同一性；
[0168]
其中该vh进一步包括
[0169]
‑
mf9249或mf9267的一hcdr3；
[0170]
‑
或该hcdr3的一变异体，其包括与该hcdr3为至少70％的序列同一性及该hcdr3相同的长度。
[0171]
在优选的具体例中，该hcdr3的该变异体包括如该hcdr3相同的长度及与该hcdr3为至少80％的序列同一性，更优选为与该hcdr3的序列为至少90％且更优选为至少9 5％的序列同一性。
[0172]
一种如本文所定义的本发明提供的双特异性抗体优选不是如pct/nl2019/050199所定义的包括一cd3结合可变结构域的双特异性抗体。
[0173]
本发明进一步提供一种由下列所编码的vh
[0174]
‑
v基因节段vh1
‑
69；或
[0175]
‑
一v基因节段vh1
‑
69的变异体，其包括与该v基因节段的序列为至少70％，优选为至少80％，更优选为至少90％且更优选为至少95％的序列同一性；
[0176]
其中该vh进一步包括
[0177]
‑
mf8048、mf8056、mf8057、mf8058、mf8078或mf8101的一hcdr3；
[0178]
‑
或该hcdr3的一变异体，其包括与该hcdr3为至少70％的序列同一性及该hcdr3相同的长度。
[0179]
在优选的具体例中，该hcdr3的该变异体包括如该hcdr3相同的长度及与该hcdr3为至少80％的序列同一性，更优选为与该hcdr3的序列为至少90％且更优选为至少9 5％的序列同一性。
[0180]
在一些具体例中，该vh不是由下列所编码的vh：v基因节段vh1
‑
69；或v基因节段vh1
‑
69的变异体其具有hcdr2序列gfipvlgtanyaqkfqg、或giiplfgtityaqkfqg或siipifgtityaqkfqg。
[0181]
在一些具体例中，该vh不是由下列所编码的vh：v基因节段vh1
‑
69；或v基因节段vh1
‑
69的变异体其具有vh序列
[0182]
evqlvqsgaevkkpgssvkvsckasggtfrsfgiswvrqapgqglewmggfipvlgtanyaqkfqgrvtiiadkstntaymelsslrsedtavyycarrgnwnpfdpwgqgtlvtvss；或
[0183]
qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasgdafksktftiswvrqapgqglewlggiiplfgtityaqkfqgrvtitadkstntafmelsslrsedtamyyctrrgnwnpfdpwgqgtlvtvss；或
[0184]
evqlvqsgselkkpgssvkvsckasgvtfnsrtftiswvrqapgqglewlgsiipifgtityaqkfqgrvtitadkststafmeltslrsedtaiyyctrrgnwnpfdpwgqgtlvtvss。
[0185]
本发明进一步提供一种由下列所编码的vh
[0186]
‑
v基因节段vh3
‑
23；或
[0187]
‑
一v基因节段vh2
‑
23的变异体，其包括与该v基因节段的序列为至少70％，优选为至少80％，更优选为至少90％且更优选为至少95％的序列同一性；
[0188]
其中该vh进一步包括
[0189]
‑
mf8397；或mf8562的一hcdr3；
[0190]
‑
或该hcdr3的一变异体，其包括与该hcdr3为至少70％的序列同一性及该hcdr3相同的长度。
[0191]
在优选的具体例中，该hcdr3的该变异体包括如该hcdr3相同的长度及与该hcdr3为至少80％的序列同一性，更优选为与该hcdr3的序列为至少90％，更优选为至少9 3％且更优选为至少95％的序列同一性。
[0192]
在一些具体例中，该vh不是由下列所编码的vh：v基因节段vh3
‑
23；或v基因节段vh3
‑
23的变异体其具有hcdr3序列dggysygpywyfdl。
[0193]
在一些具体例中，该vh不是由下列所编码的vh：v基因节段vh3
‑
23；或v基因节段vh3
‑
23的变异体其具有vh序列
[0194]
qvqlvqsggglvqpggslrlscatsgfkfssyalswvrqapgkglewvsgisgsgrttwyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycardggysygpywyfdlwgrgtlvtvss。
[0195]
本发明进一步提供一种由下列所编码的vh
[0196]
‑
v基因节段vh3
‑
9；或
[0197]
‑
一v基因节段vh3
‑
9的变异体，其包括与该v基因节段的序列为至少70％，优选为至少80％，更优选为至少90％且更优选为至少95％的序列同一性；
[0198]
其中该vh进一步包括
[0199]
‑
mf8508；mf8998；mf10401；或mf10428的一hcdr3；
[0200]
‑
或该hcdr3的一变异体，其包括与该hcdr3为至少70％的序列同一性及该hcdr3相同的长度。
[0201]
在优选的具体例中，该hcdr3的该变异体包括如该hcdr3相同的长度及与该hcdr3为至少80％的序列同一性，更优选为与该hcdr3的序列为至少90％且更优选为至少95％的序列同一性。
[0202]
在一些具体例中，该vh不是由下列所编码的vh：v基因节段vh3
‑
9；或v基因节段vh3
‑
9的变异体其具有hcdr3序列dhrgygdyegggfdy。
[0203]
在一些具体例中，该vh不是由下列所编码的vh：v基因节段vh3
‑
9；或v基因节段vh3
‑
9的变异体其具有vh序列
[0204]
evqlvesggglvqpgrslrlscatsgfnfddytmhwvrqapgkglewvsdiswssgsigyadsvkgrftisrdnaknslwlqmnslrtedtalyfcakdhrgygdyegggfdywgqgtlvtvss。
[0205]
本发明进一步提供一种由下列所编码的vh
[0206]
‑
v基因节段vh5
‑
51；或
[0207]
‑
一v基因节段vh5
‑
51的变异体，其包括与该v基因节段的序列为至少70％，优选为
至少80％，更优选为至少90％且更优选为至少95％的序列同一性；
[0208]
其中该vh进一步包括
[0209]
‑
mf9249或mf9267的一hcdr3；
[0210]
‑
或该hcdr3的一变异体，其包括与该hcdr3为至少70％的序列同一性及该hcdr3相同的长度。
[0211]
在优选的具体例中，该hcdr3的该变异体包括如该hcdr3相同的长度及与该hcdr3为至少80％的序列同一性，更优选为与该hcdr3的序列为至少90％且更优选为至少95％的序列同一性。
[0212]
一种如本文所定义的本发明提供的vh优选不是如pct/nl2019/050199所定义的一cd3结合可变结构域的vh。
[0213]
还提供一种抗原结合蛋白或抗体，优选为一种双特异性抗体，其中此类cdrs与如所主张的此类cdrs有70％，优选为80％，更优选为90％的同一性。在优选的具体例中，该抗原结合蛋白或抗体为一种双特异性抗体，其包括的cdrs，就所主张的此类cdrs而言具有最多2个，优选最多1个且更优选为最多0个氨基酸残基变异、插入、取代、缺失或加入。
[0214]
与抗体的随机、非特异性附着不同，经抗体的抗原结合通常透过抗体的互补区域及抗原和可变结构域二者的特定三维结构被媒介而允许这些两种结构精准地结合在一起(类似锁和钥匙的交互作用)。因一种抗体通常仅识别抗原的一表位，且此一表位也可存在于其他蛋白，如本发明结合cd3或clec12a的抗体也可识别其他蛋白，如果这些其他蛋白含有相同的表位。因此，术语“结合”不排除该抗体与含有相同表位的另一种蛋白或多种蛋白的结合。本发明的抗体内的结合cd3的重/轻链组合不会与出生后、优选成年人类的细胞膜上的其他蛋白结合。本发明结合clec12a、egfr、pd
‑
l1或肿瘤细胞抗原的重/轻链组合不会与出生后、优选成年人类的细胞膜上的其他蛋白结合。合适的肿瘤抗原特异臂揭露于pct/nl2019/050199的内。
[0215]“复数”是指两个或多个。
[0216]
如本文所述的抗体的“变异体”可包括抗体的功能部分、衍生物和/或类似物。此包括拟抗体(antibody mimetic)、单一体型(monobody)及适配体(aptamer)。
[0217]
变异体典型会保持抗体的结合特异性，例如双特异性抗体的特异性。变异体可为如本文所述的结合域、多聚体或抗体的功能部分或衍生物。
[0218]
如本文所述的结合域、多聚体或抗体的功能部分为一种部分其包括结合如同此种结合域、多聚体或抗体所结合的标靶相同的标靶的可变结构域。
[0219]
如本文所述的抗体的功能衍生物是一种蛋白，其包括借由链接区域所链接的结合一标靶的一可变结构域及结合第二标靶的一可变结构域。该可变结构域可为可变结构域本身或fab片段或类可变结构域分子，例如包括经由键接子而链接在一起的vh及vl的单链fv(scfv)片段。抗体可变结构域或抗体类可变结构域分子可以不同的方式彼此链接。已经描述过各种能结合一个、二个或多个可变结构域的键接子及载体结构。如本文所述的抗原结合蛋白是一种蛋白，其包括至少一个此种可变结构域。在双特异性或多特异性抗原结合蛋白的情况下，此种蛋白包括二个或多个可变结构域，其中的至少二者结合不同的标靶。该可变结构域经由一键接部分而彼此键接。此典型为0
‑
15个，优选为3
‑
12个，更优选为约5
‑
8个氨基酸残基的一段。类可变结构域分子的其他实例是所谓的单域抗体片段。单域抗体片段
(sdab)是具有单一单体可变抗体区域的抗体片段。像完整抗体一样，其能够选择性地结合至特定抗原。分子量仅为12
‑
15kda，单域抗体片段远小于由两条重蛋白链和两条轻链所构成的普通抗体(150
‑
160kda)，且甚至比fab片段还要小(～50kda，一条轻链和半条重链)和单链可变片段(～25kda，两个可变区，一个来自轻而一个来自重链)。单域抗体本身并不比正常抗体小很多(通常为90
‑
100kda)。单域抗体片段主要由骆驼科(camelid)中发现的重链抗体进行工程化；这些称为vhh片段一些鱼类也具有仅有重链的抗体(ignar，“免疫球蛋白新抗原受体”)，从中可获得称为vnar片段的单域抗体片段。另一方法是将从来自人类或小鼠的常见免疫球蛋白g(igg)的二聚可变结构域分成单体。尽管对单域抗体的大多数研究目前基于重链可变结构域，但是衍生自轻链的纳米抗体(nanobody)已经显示出能结合至标靶表位。类可变结构域分子的其他非限制性实例是vhh、人类域抗体(human domain antibodies，dabs)和单抗体(unibodies)。优选的功能部分为包括可变结构域的部分，该可变结构域包括重链可变区及轻链可变区。这些可变结构域的非限制性实例为f(ab)片段及单链fv片段。(类)可变结构域键联的双特异性格式是例如与两个不同的scfv结合的人类血清白蛋白(hsa)；双特异性迷你抗体其包括透过二聚合模体(motif)或自我缔合(self
‑
associating)的二级结构例如螺旋束或卷曲螺旋，以引起scfv片段的二聚合而结合在一起的两个不同scfv(morrison(2007)nat.biotechnol.25:1233
‑
34)。在wo2009/126920中描述合适的has键接子及使scfv偶合至键接子的方法的实例。
[0220]
功能衍生物可为拟抗体、多肽、适配体或其的组合。这些蛋白或适配体通常结合至一标靶。本发明的蛋白结合至两个或多个标靶。应该理解的是可通过本技艺已知的方法将这些抗体、拟抗体、多肽及适配体的任何组合链接在一起。例如，在一些具体例中，本发明的结合分子为复合物(conjugate)或融合蛋白。
[0221]
拟抗体是像抗体一样，可特异性地结合抗原，但与抗体在结构上不相关的多肽。拟抗体通常是摩尔质量约3至20kda的人工肽或蛋白。拟抗体的非限制性实例为亲和体分子(affibody molecule)(通常基于蛋白a的z域)；阿菲林(affilin)(通常基于γ
‑
b结晶或泛素)；黏合素(affimers)(通常基于胱蛋白(cystatin))；阿非廷(affitins)(通常基于来自嗜酸热硫化叶菌(sulfolobus acidocaldarius)的sac7d)；阿尔法体(alphabody)(通常基于三重螺旋卷曲螺旋(triple helix coiled coil))；抗运载蛋白(anticalin)(通常基于脂质运载蛋白(lipocalin))；厄维体(avimer)(通常基于各种膜受体的a域)；d arpin(通常基于锚蛋白重复模体(ankyrin repeat motif))；非诺莫(fynomers)(通常基于fyn 7的sh3域)；孔尼兹域(kunitz domain)肽(通常基于各种蛋白酶抑制剂的孔尼兹域)；以及单一体型(通常基于纤维接合素(fibronectin)的第iii型域)。
[0222]
单一体型是合成的结合蛋白，其使用纤维接合素第iii型域(fn3)作为分子架构被构造。对于产生标靶结合蛋白而言，单一体型是抗体的替代物。
[0223]
单一体型及其它拟抗体通常从组合库中产生，其中使用分子展示和定向进化技术例如噬菌体展示、mrna展示及酵母菌表面展示，以使部分的架构多样化。
[0224]
适配体是结合特定标靶分子的寡核苷酸或肽分子。通常借由从大的随机序列池(sequence pool)选择适配体来创造适配体，但天然适配体还存在于核糖开关(riboswitch)中。适配体可用于基础研究及临床目的二者作为大分子。
[0225]
在本案发明说明书以及检附的权利要求书的全文中，词语“包括(comprise)”、“包
gene:8872；ensembl:ensg00000151465；omim:615470；uniprotkb:o75794。
[0241]
cd138还称为多配体蛋白聚糖1(syndecan 1)(scd1)；cd138；sdc；硫酸乙酰肝素蛋白多醣纤维母细胞生长因子受体；多配体蛋白聚糖蛋白多醣1(syndecan proteoglycan 1)；多配体蛋白聚糖；synd1；多配体蛋白聚糖
‑
1；cd138抗原。ids:hgnc:10658；entrez gene:6382；ensembl:ensg00000115884；omim:186355；uniprotkb:p18827。
[0242]
cea还称为癌胚抗原相关的细胞黏着分子5(ceacam5)；胎便抗原100；cd66e；癌胚抗原；cd66e抗原。ids:hgnc:1817；entrez gene:1048；ensembl:ensg00000105388；omim:114890；uniprotkb:p06731。
[0243]
egfr还称为表皮生长因子受体；红血球胚细胞白血病病毒(v
‑
erb
‑
b)致癌基因同源物(禽)；erbb1；pig61；原致癌基c
‑
erbb
‑
1；禽红血球胚细胞白血病病毒(v
‑
erb
‑
b)致癌基因同源物；受体酪胺酸蛋白激酶erbb
‑
1；细胞生长抑制蛋白40；细胞增殖诱发蛋白61；her1；mena；ec 2.7.10.1；ec 2.7.10；表皮生长因子受体(禽红血球胚细胞白血病病毒(v
‑
erb
‑
b)致癌基因同源物)。ids:hgnc:3236；entrez gene:1956；ensembl:ensg00000146648；omim:131550；uniprotkb:p00533。
[0244]
egfrviii为常见的egfr变异体(oncogene.2013may 23；32(21):2670
‑
81.doi:10.1038/onc.2012.280.epub 2012jul 16)。
[0245]
δ样3(delta like 3)(dll3)还称为δ样3(delta
‑
like 3))；果蝇δ同源物3；delta3；δ(果蝇)样3；scdo1。dll3的ids为：hgnc：2909；entrez gene：10683；ensembl：ensg00000090932；omim：602768及uniprotkb：q9nyj7。
[0246]
lgr5是含有富含白胺酸重复的g蛋白偶联受体5(leucine
‑
rich repeat containing g protein
‑
coupled receptor 5)。该基因或蛋白的替代名称为含有富含白胺酸重复的g蛋白偶联受体5；含有富含白胺酸重复的g蛋白偶联受体5；g蛋白偶联受体hg38；g蛋白偶联受体49；g蛋白偶联受体67；gpr67；gpr49；孤儿g蛋白偶联受体hg38(orphan g protein
‑
coupled receptor hg38)；g蛋白偶联受体49；gpr49；hg38及fex。本发明的结合lgr5的蛋白或抗体结合人类lgr5。由于人类和其它哺乳动物异种同源物(ortholog)之间的序列及三级结构的相似性，本发明的lgr5结合蛋白或抗体也可结合这样的异种同源物，但不一定如此。人类lgr5蛋白和编码其的基因的数据库登录序号为(nc_000012.12；nt_029419.13；nc_018923.2；np_001264155.1；np_001264156.1；np_003658.1)。
[0247]
msln或间皮素(mesothelin)还称为间皮素(mesothelin)；初前巨核细胞增效因子(pre
‑
pro
‑
megakaryocyte
‑
potentiating factor)；cak1抗原；mpf；可溶性mpf间皮素相关蛋白；巨核细胞增效因子及smrp。msln的ids为：hgnc：7371；entrez gene：10232；ensembl：ensg00000102854；omim：601051；uniprotkb：q13421。
[0248]
叶酸受体1还称为folr1；叶酸受体1；卵巢肿瘤相关抗原mov18；成人叶酸结合蛋白；叶酸受体，成人；kb细胞fbp；fr
‑
α；folr；fbp；叶酸结合蛋白；及叶酸受体1。folr1的ids为hgnc：3791；entrez gene：2348；ensembl：ensg00000110195；omim：136430；uniprotkb：p15328。
[0249]
叶酸受体3还称为folr3；叶酸受体3(γ)；fr
‑
γ；叶酸受体3；γ
‑
hfr；及fr
‑
g。folr3的ids为hgnc：3795；entrez gene：2352；ensembl：ensg00000110203；omim：602469；及uniprotkb：p41439。
[0250]
epcam还称为上皮细胞黏着分子；egp40；m4s1；esa；mic18；ks1/4；肿瘤相关钙信号传导子1(tumor
‑
associated calcium signal transducer 1)；mk
‑
1；tacstd1；人类上皮醣蛋白
‑
2；trop1；膜组分，染色体4，表面标记(35kd醣蛋白)；腺癌相关抗原；egp；细胞表面醣蛋白trop
‑
1；ep
‑
cam；上皮醣蛋白314；ga733
‑
2；主要肠胃肿瘤相关蛋白ga733
‑
2；m1s2；egp314；cd326抗原；ksa；上皮细胞表面抗原；d iar5；上皮醣蛋白；hnpcc8；hegp314；单株抗体aua1鉴定的抗原；ks 1/4抗原；egp
‑
2；acstd1。ids:hgnc:11529；entrez gene:4072；ensembl:ensg00000119888；omim:185535；uniprotkb:p16422。
[0251]
her2还称为v
‑
erb
‑
b2禽红血球胚细胞白血病病毒致癌基因同源物2；erbb2；cd340；ngl；her
‑
2；her
‑
2/neu2；neu2；tkr1；神经/神经胶质母细胞瘤衍生的致癌基因同源物；c
‑
erb b2/neu蛋白；转移性淋巴结基因19蛋白；赫斯达汀(herstatin)；原致癌基因c
‑
erbb
‑
2；神经母细胞瘤/神经胶质母细胞瘤衍生的致癌基因同源物；原致癌基因neu；受体酪胺酸蛋白激酶erbb
‑
2；酪胺酸激酶型细胞表面受体her2；v
‑
erb
‑
b2红血球胚细胞白血病病毒致癌基因同源物2，神经/神经胶质母细胞瘤衍生的致癌基因同源物；mln 19；mln19；p185erbb2；cd340抗原；ec 2.7.10.1；ec 2.7.10；v
‑
erb
‑
b2禽红血球胚细胞白血病病毒致癌基因同源物2(神经/神经胶质母细胞瘤衍生的致癌基因同源物)。ids:
[0252]
hgnc:3430；entrez gene:2064；ensembl:ensg00000141736；omim:164870；uniprotkb:p04626。
[0253]
hm1.24还称为bst2；骨髓基质细胞抗原2；tetherin；bst
‑
2；骨髓基质抗原2；hm1.24抗原；联系蛋白(tetherin)；cd317；cd317抗原；npc
‑
a
‑
7。ids:hgnc:1119；entrez gene:684；ensembl:ensg00000130303；omim:600534；uniprotkb:q10589。
[0254]
mcsp还称为精子粒线体相关富含半胱胺酸蛋白(sperm mitochondria
‑
associated cysteine
‑
rich protein)(smcp)；mcsp；mcs；粒线体囊硒蛋白(mitochondrial capsule selenoprotein)；hsmcsgen1；精子粒线体相关富含半胱胺酸蛋白。ids:hgnc:6962；entrez gene:4184；ensembl:ensg00000163206；omim:601148；uniprotkb:p49901。
[0255]
pd
‑
l1为第1型跨膜蛋白，其在特定事件例如怀孕、组织同种异体移植、自体免疫疾病及其他疾病状态如肝炎，的期间于抑制免疫反应中起作用。pd
‑
l1与pd
‑
1或b7.1(cd80)结合传递抑制信息其减少pd
‑
1表现t细胞的增殖。一般认为pd
‑
1能够透过细胞凋亡来控制外来抗原特异性t细胞的累积。多种癌细胞有表现pd
‑
l1，且其的表现认为至少部分负责减缓了对抗癌细胞的免疫反应。pd
‑
l1是蛋白质的b7家族的成员且以各种其他名称为人所熟知，例如cd274分子；cd274抗原；b7同源物1；pdcd1配体1；pdcd1lg1；pdcd1l1；b7h1；pdl1；计划性细胞死亡1配体1；计划性死亡配体1；b7
‑
h1；及b7
‑
h。cd274的外部ids为hgnc：17635；entrez gene：29126；ensembl：ensg00000120217；omim：605402；uniprotkb：q9nzq7。
[0256]
psma还称为叶酸水解酶(前列腺特异性膜抗原)1；folh1；naalad1；folh；mgcp；麸胺酸羧肽酶ii；n
‑
乙酰化
‑
α
‑
链接的酸性双肽酶i；psm；naaladase i；psma；ec 3.4.17.21；麸胺酸羧酶ii；gcp2；细胞生长抑制基因27蛋白；naaladase；叶酰多(folylpoly)
‑
γ
‑
麸胺酸羧肽酶；麸胺酸羧肽酶2；膜麸胺酸羧肽酶；n
‑
乙酰化α
‑
链接的酸性双肽酶1；喋酰多(pteroylpoly)
‑
γ
‑
麸胺酸羧肽酶；前列腺特异性膜抗原变异体f；fgcp；叶酸水解酶1；gcpii；前列腺特异性膜抗原。ids:hgnc:3788；entrez gene:2346；ensembl:ensg00000086205；omim:600934；uniprotkb:q04609。
[0257]
psma不要与蛋白酶体(前体(prosome)，巨蛋白因子(macropain))亚单位，α型，1混淆，其的别名也称为psma1。
[0258]
给登录序号主要是为了提供另外的标靶鉴别方法，所结合的蛋白的实际序列可能，譬如因为编码基因突变而变化，例如在一些癌症及类似癌症中发生的此类。抗原结合地址与抗原及其多种变异体结合，例如一些抗原阳性免疫或肿瘤细胞表现的此类。
[0259]
在本文提到一基因、蛋白的处，其优选是指该基因或蛋白的人类形式。在本文提到一基因、蛋白的处，其是指天然基因或蛋白以及该基因或蛋白的变异体形式，如同于肿瘤、癌症及类似癌症内能检测到的，优选如人类肿瘤、癌症及类似癌症内能检测到的。
[0260]
本发明的双特异性或多特异性抗体优选结合人类bcma、cd19、cd20、cd30、cd33、cd38、cd44、cd123、cd138、cea、clec12a、cs
‑
1、egfr、egfrviii、epcam、dll3、lgr5、msln、folr1、folr3、her2、hm1.24、mcsp、pd
‑
l1、psma蛋白或其的一变异体。该抗原结合重/轻链组合优选结合该抗原的细胞外部分。如本发明的双特异性抗体优选结合人类clec12a或其的一变异体。如本发明的优选的双特异性抗体结合人类cd3及人类clec12a或其的一变异体。在优选具体例中，该多特异性抗体结合cd3、pd
‑
l1及egfr。
[0261]
hgnc代表hugo基因命名委员会。缩写后的数字为登录序号，以该登录序号可以从hgnc数据库中检索该基因及该基因编码的蛋白的信息。entrez gene提供登录序号或基因id，以其可以从ncbi(国家生物技术信息中心)数据库中检索该基因或该基因编码的蛋白的信息。ensemble提供登录序号，以该登录序号可以从ensemble数据库中获得该基因或该基因编码的蛋白的信息。ensembl是embl
‑
eb及威康信托桑格研究所(wellcome trust sanger institute)之间共同的计划以发展一软件系统其对所选的真核基因体产生自动注解且被维护。
[0262]
本发明提供一种会结合人类cd3的抗原结合蛋白，优选为一抗体，其包括一抗体可变结构域，该抗体可变结构域包括一重链可变区及一轻链可变区，其中该重链可变区包括一cdr1、cdr2及cdr3
[0263]
该cdr1、cdr2及cdr3包括下列氨基酸序列：
[0264]
cdr1:sfgis；cdr2:gfipvlgtanyaqkfqg；cdr3:rgnwnpfdp或
[0265]
包括下列氨基酸序列：
[0266]
cdr1：sx1tftis；
[0267]
cdr2：giipx2fgtityaqkfqg；
[0268]
cdr3：rgnwnpfdp；
[0269]
其中
[0270]
x1＝k或r；x2＝l或i。
[0271]
在优选的具体例中，x1＝k；及x2＝l。在另一优选的具体例中，x1＝r；及x2＝i。
[0272]
本发明提供一种会结合人类cd3的抗原结合蛋白，优选为一抗体，其包括一抗体可变结构域，该抗体可变结构域包括一重链可变区及一轻链可变区，其中该重链可变区包括一cdr1、cdr2及cdr3，该cdr1、cdr2及cdr3包括下列氨基酸序列：
[0273]
cdr1：sktltis；cdr2：giipifgsityaqkfqd；cdr3：rgnwnpfdp；或
[0274]
包括下列氨基酸序列：
[0275]
cdr1:gsgis；cdr2:gfipffgsanyaqkfrd；cdr3:rgnwnpx
13
dp；
[0276]
其中
[0277]
x
13
＝或l或f。
[0278]
本发明进一步提供一种会结合人类cd3的抗原结合蛋白，优选为一抗体，其包括一抗体可变结构域，该抗体可变结构域包括一重链可变区及一轻链可变区，其中该重链可变区包括一cdr1、cdr2及cdr3，该cdr1、cdr2及cdr3包括下列氨基酸序列：
[0279]
cdr1:rx3wig；cdr2:iiypgdsdtryspsfqg；cdr3:x4iryfx5wsedyhyyx6dv；
[0280]
其中
[0281]
x3＝f或y；x4＝h或n；x5＝d或v；及x6＝l或m。
[0282]
在优选的具体例中，x3＝f；x4＝h；x5＝d；及x6＝l；或x3＝y；x4＝n；x5＝v；及x6＝m。
[0283]
本发明进一步提供一种会结合人类cd3的抗原结合蛋白，优选为一抗体，其包括一抗体可变结构域，该抗体可变结构域包括一重链可变区及一轻链可变区，其中该重链可变区包括一cdr1、cdr2及cdr3，该cdr1、cdr2及cdr3包括下列氨基酸序列：
[0284]
cdr1:syals；cdr2:gisgsgrttwyadsvkg；cdr3:dggysygpywyfdl。
[0285]
本发明进一步提供一种会结合人类cd3的抗原结合蛋白，优选为一抗体，其包括一抗体可变结构域，该抗体可变结构域包括一重链可变区及一轻链可变区，其中该重链可变区包括一cdr1、cdr2及cdr3，该cdr1、cdr2及cdr3包括下列氨基酸序列：
[0286]
cdr1:syals；cdr2:aisgsgrttwyadsvkg；cdr3:dggytygpywyfdl。
[0287]
本发明进一步提供一种会结合人类cd3的抗原结合蛋白，优选为一抗体，其包括一抗体可变结构域，该抗体可变结构域包括一重链可变区及一轻链可变区，其中该重链可变区包括一cdr1、cdr2及cdr3，该cdr1、cdr2及cdr3包括下列氨基酸序列：
[0288]
cdr1:dytmh；cdr2:diswssgsigyadsvkg；cdr3:dhrgygdyegggfdy。
[0289]
本发明进一步提供一种会结合人类cd3的抗原结合蛋白，优选为一抗体，其包括一抗体可变结构域，该抗体可变结构域包括一重链可变区及一轻链可变区，其中该重链可变区包括一cdr1、cdr2及cdr3，该cdr1、cdr2及cdr3包括下列氨基酸序列：
[0290]
cdr1：dytmh；
[0291]
cdr2：diswsx7gx8x9x
10
yadsvkg；
[0292]
cdr3：dhx
11
gygdyegggfdx
12
；
[0293]
其中
[0294]
x7＝s或g；
[0295]
x8＝s或t；
[0296]
x9＝i或t；
[0297]
x
10
＝g或y；
[0298]
x
11
＝r或m；
[0299]
x
12
＝h或y，
[0300]
优选x7、x8、x9及x
10
为s、s、i及g或是g、s、i及y或是s、t、t和g，并且优选x
11
及x
12
为r及h，或是r及y，或是m及y，更优选x7、x8、x9、x
10
、x
11
和x
12
为s、s、i、g、r和h或是g、s、i、y、r及y或是s、t、t、g、m及y，或是换句话讲，优选x7、x8、x9和x
10
为s、s、i及g，并且x
11
及x
12
为r和h；或x7、x8、x9和x
10
为g、s、i和y和x
11
和x
12
为r和y；或x7、x8、x9和x
10
为s、t、t和g，并且x
11
和x
12
为m及y。
itcra sqsis sylnw yqqkp gkapk lliya asslq sgvps rfsgs gsgtd ftlti sslqp edfat yycqq systp pitfg qgtrl eik，其具有0
‑
5个氨基酸变异、插入、缺失、取代、加入或其的组合。
[0306]
该轻链可变区优选包括cdr1、cdr2及cdr3区域，其包括氨基酸序列cdr1
–
qsissy，cdr2
–
aas，cdr3
–
qqsystp，即igkv1
‑
39的cdrs(根据imgt)。该氨基酸变异、插入、缺失、取代、加入或其的组合优选不在该轻链可变区的cdr3区域内，优选不在该轻链可变区的cdr1或cdr2区域内。于优选的具体例中，该轻链可变区就所示的序列而言不包括缺失、加入或变异。在此具体例中，该轻链可变区就所示的氨基酸序列而言可具有0
‑
5个氨基酸取代。氨基酸取代优选为保留型氨基酸取代。本发明的抗体的轻链的cdr1、cdr2及cdr3优选分别包括氨基酸序列cdr1
‑
qsissy、cdr2
‑
aas、cdr3
‑
qqsystp，即igkv1
‑
39的cdrs(根据imgt)。
[0307]
该抗原结合蛋白优选为一种抗体，优选为一种双特异性或多特异性抗体。该抗体优选包括一种共同的轻链，该共同的轻链包括一如本文所定义的共同的轻可变区及一如本文所定义的轻链恒定区域。
[0308]
本发明如前所述的抗体优选为一种双特异性抗体。“双特异性抗体”如本文所述为一种抗体其中该抗体的一域与第一抗原结合而该抗体的第二域与第二抗原结合，其中该第一与第二抗原不是完全相同的。术语“双特异性抗体”还包括抗体其中一重链可变区/轻链可变区(vh/vl)组合结合一抗原上的第一表位及第二vh/vl组合结合第二表位。该术语进一步包括抗体其中vh能特异性识别第一抗原，且与免疫球蛋白可变区的vh配对的vl能特异性识别第二抗原。生成的vh/vl对会结合抗原1或抗原2。这些所谓的“二合一抗体”于例如wo 2008/027236、wo2010/108127及schaefer等人(cancer cell 20，472
‑
486，2011年十月)内有描述。如本发明的双特异性抗体不限于任何特定双特异性格式或其生产方法。
[0309]
该双特异性抗体优选具有会结合cd3的一重链可变区/轻链可变区(vh/vl)组合以及会结合cd3上的抗原以外的抗原的第二vh/vl组合。在优选的具体例中，抗原为肿瘤抗原。在优选的具体例中，该第一vh/vl组合内的vl与该第二vh/vl组合内的vl是相似的。在一更优选的具体例中，该第一及第二vh/vl组合内的vls是完全相同的。在优选具体例中，该双特异性抗体是一种全长抗体其具有会结合cd3的一重/轻(h/l)链组合以及会结合另一抗原，优选为肿瘤抗原的一h/l链组合。在优选的具体例中，该第一h/l链组合的轻链与该第二h/l链组合的轻链是相似的。在一更优选具体例中，该第一及第二h/l链组合的轻链是完全相同的，即一相似或完全相同的人类轻链是所谓的“共同的轻链”，其为一种能与不同重链组合以形成有功能性抗原结合域的抗体的轻链。在优选的具体例中，于该第一h/l链组合内的轻链包括一轻链可变区，其与该第二h/l链组合内的轻链可变区是相似的。在一更优选的具体例中，该第一及第二h/l链组合内的轻链可变区是完全相同的，即一相似或完全相同的人类轻链可变区是所谓的“共同的轻链可变区”，其为一种能与不同重链可变区组合以形成有功能性抗原结合域的抗体的轻链可变区。该包括一共同的轻链可变区的轻链优选为一共同的轻链。
[0310]
双特异性抗体内的共同的轻链优选为如上文所示的igvκ1
‑
39轻链。
[0311]
本发明还提供任择的双特异性抗体格式，例如spiess，c.等人乙文(alternative molecular formats and therapeutic applications for bispecific antibodies.mol.immunol.(2015)http:dx.doi.org/10.1016/j.molimm.2015.01.003)中
所述的此类。双特异性抗体格式—不是具有二个h/l组合的古典抗体—具有本发明的包括一重链可变区及一轻链可变区的至少一可变结构域。此可变结构域可链接一单链fv片段、单一体型(monobody)、vh及fab片段以提供第二结合活性。
[0312]
于本发明的双特异性抗体方面，于cd3结合的h/l链组合内的轻链优选与结合cd3以外的抗原，优选为肿瘤抗原的h/v链组合内的轻链是相似的。在一更优选具体例中，二种h/l链组合内的轻链是完全相同的，即该人类轻链是所谓的“共同的轻链”，其为一种能与不同重链组合以形成有功能性抗原结合域的抗体的轻链。优选地，该共同的轻链具有生殖系列序列。优选的生殖系列序列是人类库(human repertoire)常用且具有良好的热力学稳定性、产量及溶解度的轻链可变区。优选的生殖系列序列是igvκ1
‑
39，优选为重排的生殖系列人类κ轻链igvκ1
‑
39*01/igjκ1*01或其片段或功能等效物(即相同的igvκ1
‑
39基因节段但igjκ基因节段不同)(根据imgt.org的imgt数据库万维网来命名)。
[0313]
当使用于本文时术语“异常细胞”包括肿瘤细胞，更具体地为血液来源的肿瘤细胞，还包括白血病前期细胞例如造成骨髓发育不良症候群(mds)的细胞及白血病细胞如急性骨髓性白血病(aml)肿瘤细胞或慢性骨髓性白血病(cml)细胞。
[0314]
当使用于本文中术语“免疫效应子细胞”或“效应子细胞”是指哺乳动物免疫系统内的细胞天然库内的细胞，其能被活化以影响标靶细胞的生存力。免疫效应子细胞包括淋巴谱系细胞例如自然杀手(nk)细胞、t细胞包括胞毒型t细胞，或b细胞，且包括骨髓谱系细胞，例如单核球或巨噬细胞、树突细胞及嗜中性颗粒球。因此，该效应子细胞优选为nk细胞、t细胞、b细胞、单核球、巨噬细胞、树突细胞或嗜中性颗粒球。募集效应子细胞至异常细胞意指使免疫效应子细胞接近异常标靶细胞以使得效应子细胞能直接杀灭异常细胞或间接发起杀灭异常细胞。
[0315]
当使用于本文中，术语“个体”及“患者”可互换使用且是指哺乳动物例如人类、小鼠、大鼠、仓鼠、天竺鼠、兔、猫、狗、猴、牛、马、猪等(例如有癌症的患者，例如人类患者)。
[0316]
当使用于本文中，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”及“治疗(treatment)”指在个体上进行任何类型的介入或过程或向该个体投予活性剂或活性剂组合，且目的在于逆转、减轻、改良、抑制或减慢或预防与疾病相关联的症状、并发症、病况或生物化学指标的进展、发展、严重性或复发。
[0317]
当使用于本文中，“有效的治疗”或“正面治疗反应”是指产生有益效应的治疗，例如减轻一疾病或障碍，如癌症的至少一症状。有益效应能以比基线有所改善的方式呈现，包括比根据该方法的疗法起始前所进行的测量或观察有改善。例如，有益效应能以减慢、稳定、中止或逆转癌症于处于任何临床阶段的个体内的进展的方式呈现，如由疾病的临床或诊断症状或癌症标识减少或消除来证明。有效的治疗可，例如减小肿瘤尺寸、减少循环的肿瘤细胞存在、降低或预防肿瘤转移、减慢或阻止肿瘤生长和/或预防或延迟肿瘤复发或再发。
[0318]
术语“治疗量”指提供所欲的生物、治疗和/或预防结果的一制剂或制剂组合的量。该结果可为减少、改良、缓和、衰减、延迟和/或减轻疾病的一个或多个征象、症状或原因，或生物系统任何其他所欲的改变。在一些具体例中，治疗量为足以延迟肿瘤发展的量。在一些具体例中，治疗量为足以预防或延迟肿瘤复发的量。治疗量能以一或多次投予被投予。药物或组合物的治疗量可以：(i)降低癌细胞的数目；(ii)缩小肿瘤尺寸；(iii)在一定程度上抑
制、减缓、减慢且可中止癌细胞浸润至周边器官内；(iv)抑制肿瘤转移；(v)抑制肿瘤生长；(vi)预防或延迟肿瘤发生和/或复发；和/或(vii)在一定程度上缓解癌症相关联的一个或多个症状。在一实例中，“治疗量”是clec12a/cd3双特异性抗体的量，其减少癌症(例如癌细胞数目减少)或减慢癌症，例如急性骨髓性白血病、骨髓发育不良症候群或慢性骨髓性白血病的进展。
[0319]
本发明还提供一种会结合人类cd3的抗原结合蛋白，优选为一抗体，其包括一抗体可变结构域，该抗体可变结构域包括一重链可变区及一轻链可变区，其中该重链可变区包括氨基酸序列
[0320]
evqlvqsgaevkkpgssvkvsckasggtfrsfgiswvrqapgqglewmggfipvlgtanyaqkfqgrvtiiadkstntaymelsslrsedtavyycarrgnwnpfdpwgqgtlvtvss；
[0321]
qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasgdafksktftiswvrqapgqglewlggiiplfgtityaqkfqgrvtitadkstntafmelsslrsedtamyyctrrgnwnpfdpwgqgtlvtvss；
[0322]
evqlvqsgselkkpgssvkvsckasgvtfnsrtftiswvrqapgqglewlgsiipifgtityaqkfqgrvtitadkststafmeltslrsedtaiyyctrrgnwnpfdpwgqgtlvtvss；
[0323]
qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasggtfrgsgiswvrqapgqglewvggfipffgsanyaqkfrdrvtitadksattaymelsslrsedtaiyycakrgnwnpldpwgqgtlvtvss；
[0324]
qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasgvtfksktltiswvrqapgqglewlggiipifgsityaqkfqdrvsitadkstntaylelnslrsedtaiyycarrgnwnpfdpwgqgtlvtvss；或
[0325]
evqlvqsgaevkkpgssvkvsckasggtfrgsgiswvrqapgqglewvggfipffgsanyaqkfrdrvtitadksattaymelsslrsedtaiyycakrgnwnpfdpwgqgtlvtvss
[0326]
于此类cdrs以外的一个或多个位置处具有0
‑
10个、优选0
‑
5个氨基酸变异、插入、缺失、取代、加入或其组合。
[0327]
进一步提供一种会结合人类cd3的抗原结合蛋白，优选为一抗体，其包括一抗体可变结构域，该抗体可变结构域包括一重链可变区及一轻链可变区，其中该重链可变区包括氨基酸序列
[0328]
evqlvqsgaevkkpgeslkisckgsgysftrfwigwvrqmpgkglewmgiiypgdsdtryspsfqgqvtisadkststaylqwsslkasdtgmyycvrhiryfdwsedyhyyldvwgkgttvtvss；或
[0329]
evqlvesgaevkkpgeslkisckgsgysftrywigwvrqmpgkglewmgiiypgdsdtryspsfqgqvtisadksistaylqwsslkasdtamyycvrniryfvwsedyhyymdvwgkgttvtvss；
[0330]
于此类cdrs以外的一个或多个位置处具有0
‑
10个、优选0
‑
5个氨基酸变异、插入、缺失、取代、加入或其组合。
[0331]
还提供一种会结合人类cd3的抗原结合蛋白，优选为一抗体，其包括一抗体可变结构域，该抗体可变结构域包括一重链可变区及一轻链可变区，其中该重链可变区包括氨基酸序列
[0332]
qvqlvqsggglvqpggslrlscatsgfkfssyalswvrqapgkglewvsgisgsgrttwyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycardggysygpywyfdlwgrgtlvtvss；或
[0333]
qvqlvesggglvqpggslrlscatsgftfisyalswvrqapgkglewvsaisgsgrttwyadsvkgrftisrdnskntlflqmnslraedtavyycardggytygpywyfdlwgrgtlvtvss
[0334]
于此类cdrs以外的一个或多个位置处具有0
‑
10个、优选0
‑
5个氨基酸变异、插入、
缺失、取代、加入或其组合。
[0335]
本发明进一步提供一种会结合人类cd3的抗原结合蛋白，优选为一抗体，其包括一抗体可变结构域，该抗体可变结构域包括一重链可变区及一轻链可变区，其中该重链可变区包括氨基酸序列
[0336]
evqlvesggglvqpgrslrlscatsgfnfddytmhwvrqapgkglewvsdiswssgsigyadsvkgrftisrdnaknslwlqmnslrtedtalyfcakdhrgygdyegggfdywgqgtlvtvss；
[0337]
evqlvesggglvqpgrslrlscatsgftfddytmhwvrqapgkglewvsdiswssgsigyadsvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtalyfcakdhrgygdyegggfdhwgqgtlvtvss；
[0338]
evqlvesggglvqpgrslrlscvtsgftfddytmhwvrqapgkglewvsdiswssgttgyadsvkgrftisrdnakdslylqmnslrtedtalyycakdhmgygdyegggfdywgqgtlvtvss；或
[0339]
evqlvesggvvvqpggslrlscaasgftfddytmhwvrqapgkglewvsdiswsggsiyyadsvkgrftisrdnsknslylqmnslrtedtalyycakdhrgygdyegggfdywgrgtlvtvss；
[0340]
于此类cdrs以外的一个或多个位置处具有0
‑
10个、优选0
‑
5个氨基酸变异、插入、缺失、取代、加入或其组合。
[0341]
该氨基酸变异、插入、缺失、取代、加入或其的组合优选不在重链可变区的cdr3区域内，优选不在重链可变区的cdr1和/或cdr2区域内。于优选的具体例中，该重链可变区就所示的序列而言不包括缺失、加入或变异、插入。在一具体例中，该重链可变区就所示的氨基酸序列而言可具有0
‑
10个，优选0
‑
5个氨基酸取代。在优选的具体例中，该重链可变区就所示的氨基酸序列而言，于此类cdrs以外的位置处包括0
‑
9、0
‑
8、0
‑
7、0
‑
6、0
‑
5、0
‑
4，优选为0
‑
3，优选为0
‑
2，优选为0
‑
1且优选为0个氨基酸变异、插入、缺失、取代、加入，或其的组合。设如果排列的序列没有超过10个位置的差异，优选为没有超过5个位置的差异，则一个插入、加入、缺失或取代的组合为所主张的组合。位在排列的序列中的一者内的一个空位会算作是在另一个序列中跳过(skipped)的数量一样多的氨基酸。一个氨基酸取代，如果有的话，优选是一种保留型氨基酸取代。
[0342]
本发明进一步提供一种会结合人类cd3的抗原结合蛋白，优选为一抗体，其包括一抗体可变结构域，该抗体可变结构域包括一重链可变区及一轻链可变区，其中该重链可变区包括如图13所描绘的mf8057；mf8058或mf8078的氨基酸序列。
[0343]
本发明进一步提供一种会结合人类cd3的抗原结合蛋白，优选为一抗体，其包括一抗体可变结构域，该抗体可变结构域包括一重链可变区及一轻链可变区，其中该重链可变区包括如图13所描绘的mf8397的氨基酸序列。
[0344]
本发明进一步提供一种会结合人类cd3的抗原结合蛋白，优选为一抗体，其包括一抗体可变结构域，该抗体可变结构域包括一重链可变区及一轻链可变区，其中该重链可变区包括如图13所描绘的mf8508的氨基酸序列。
[0345]
本发明进一步提供一种会结合人类cd3的抗原结合蛋白，优选为一抗体，其包括一抗体可变结构域，该抗体可变结构域包括一重链可变区及一轻链可变区，其中该重链可变区包括如图13所描绘的mf9249或mf9267的氨基酸序列。
[0346]
该轻链优选包括如本文其他地方所定义的cdr1、cdr2及cdr3。其优选包括一共同的轻链可变区且优选为如本文其他地方所定义的一共同的轻链。该双特异性抗体优选进一步包括一种会结合另一抗原，优选为肿瘤抗原的重链及轻链组合。会结合另一抗原的该重
链及轻链组合的轻链优选为如本文其他地方所定义的一共同的轻链。会结合另一抗原的该重链及轻链组合的重链优选包括一重链可变区，该重链可变区包括一氨基酸序列：mf8233(egfr)
[0347]
qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsygiswvrqapgqglewmgwisaynantnyaqklqgrvtmttdtststaymelrslrsddtavyycakdrhwhwwldafdywgqgtlvtvss，于此类cdrs以外的一个或多个位置处具有0
‑
10个、优选0
‑
5个氨基酸变异、插入、缺失、取代、加入或其的组合；或mf4327(clec12a)
[0348]
qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsyymhwvrqapgqglewmgiinpsggstsyaqkfqgrvtmtrdtststvymelsslrsedtavyycakgttgdwfdywgqgtlvtvss，
[0349]
于此类cdrs以外的一个或多个位置处具有0
‑
10个、优选0
‑
5个氨基酸变异、插入、缺失、取代、加入或其的组合。
[0350]
如本文所定义的会结合clec12a的可变结构域，其具有一重链可变区及一共同的轻链区域，于wo2014/051433及wo2017/010874等等的内有描述，为本文的此目的特别提及其且其并入本文以作为参考资料。会结合人类egfr或clec12a的该重/轻链组合的重链可变区，就所示的氨基酸序列而言能具有0
‑
10个、优选0
‑
5个氨基酸变异、插入、缺失、取代、加入或其的组合。在优选的具体例中，该重链可变区就所示的氨基酸序列而言，包括0
‑
9、0
‑
8、0
‑
7、0
‑
6、0
‑
5、0
‑
4，优选为0
‑
3，优选为0
‑
2，优选为0
‑
1且优选为0个氨基酸变异、插入、缺失、取代、加入，或其的组合。设如果排列的序列没有超过5个位置的差异，则一个插入、缺失、加入或取代的组合为所主张的组合。位在排列的序列中的一者内的一个空位会算作是在另一个序列中跳过的数量一样多的氨基酸。
[0351]
一氨基酸变异、插入、缺失、取代、加入或其的组合优选不进行/存在于重及轻链的结合界面(interface)中。
[0352]
设如果h/l链交互作用的界面中的氨基酸有改变，优选的是另一链中对应的氨基酸也改变以适应该改变。插入或加入氨基酸最好不需要插入或加入脯胺酸。
[0353]
加入氨基酸原则上可认为与插入是一样的。加入氨基酸至多肽链的一末端有时不认为是插入而是严格的加入(strict addition)(延长)。就本发明而言，加入一链内或加入至一末端二者一般均认为是插入。
[0354]
该氨基酸变异、插入、缺失、取代、加入或其的组合优选不是在该重链可变区的cdr3区域内，优选不是在该重链可变区的cdr1或cdr2区域内。于优选的具体例中，该重链可变区就所示的序列而言不包括缺失、加入或变异。在此具体例中，该重链可变区就所示的氨基酸序列而言可具有0
‑
5个氨基酸取代。氨基酸取代优选为保留型氨基酸取代。本发明的cd3结合vh的cdr1、cdr2及cdr3优选包括图13所描绘的cd3结合vh的cdr1、cd2及cdr3的组合，优选mf8057；mf8058；mf8078；mf8397；mf8508；mf9249或mf9267的一者的vh。
[0355]
本发明的抗体，包括双特异性或多特异性抗体，的恒定区域优选地为人类恒定区域。该恒定区域可含有与天然存在的人类抗体的恒定区域的一个或多个，优选不超过10个，优选不超过5个氨基酸差异。本文生产的抗体的各种可变区衍生自人类抗体可变结构域库。因此这些可变结构域为人类的。独特的cdr区域可衍生自人类、为合成的或衍生自另一种生物。本发明的抗体或双特异性抗体优选为一种人类或人化抗体。合适的重链恒定区域非限制性地举例说明于图12中。
[0356]
本技艺存在多种生产抗体的方法。抗体通常由表现编码该抗体的核酸的细胞来生产。合适抗体生产的细胞为融合瘤细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞、ns0细胞或per
‑
c6细胞。在一个特别佳的具体例中，该细胞为cho细胞。
[0357]
各种机构及公司已经开发出用于大规模生产抗体的细胞株，譬如供临床使用。这些细胞株的非限制性实例为cho细胞、ns0细胞或per.c6细胞。这些细胞还用于其他的目的例如生产蛋白质。开发用于工业规模生产蛋白质及抗体的细胞株于此进一步称为工业细胞株。在优选的具体例中，本发明提供一种生产本发明的抗体的工业细胞株。
[0358]
在一具体例中本发明提供一种细胞，其包括如本发明的抗体和/或如本发明的核酸。该细胞优选为动物细胞，更优选为哺乳动物细胞，更优选为灵长类动物细胞，最佳为人类细胞。出于本发明的目的，一种合适的细胞为能包括且优选生产如本发明的抗体和/或如本发明的核酸的任何细胞。
[0359]
本发明进一步提供一种包括如本发明的抗体的细胞。优选地该细胞(典型为一种活体外、单离或重组细胞)生产该抗体。于优选的具体例中，该细胞为融合瘤细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞、ns0细胞或per
‑
c6细胞。在一特别佳的具体例中该细胞为cho细胞。进一步提供一种细胞培养物其包括如本发明的细胞。各种机构及公司已经开发出用于大规模生产抗体的细胞株，譬如临床使用。这些细胞株的非限制性实例为cho细胞、ns0细胞或per.c6细胞。这些细胞还用于其他的目的例如生产蛋白质。开发用于工业规模生产蛋白质及抗体的细胞株于此进一步称为工业细胞株。因而在优选的具体例中，本发明提供一种开发用于大规模生产抗体的细胞株的用途，其供用于生产本发明的抗体。本发明进一步提供一种用于生产一抗体的细胞，该抗体包括一种编码如所主张的抗体的vh、vl和/或重及轻链的核酸分子。该核酸分子优选编码图13所示的vh、一编码如由数字4327所示或由数字8233所示的vh的核酸分子或其的组合。
[0360]
本发明进一步提供一种用于生产一抗体的方法，其包括培养本发明的细胞且从该培养物收获该抗体。该细胞优选于无血清培养基内培养。优选地使该细胞适合供悬浮生长。进一步提供一种抗体其可由一种用于生产如本发明的抗体的方法而获得。该抗体优选由该培养物的培养基被纯化。该抗体比优选经亲和力纯化。
[0361]
本发明的细胞举例来说为融合瘤细胞株、cho细胞、293f细胞、ns0细胞或另一种已知其适合用于临床目的的抗体生产的细胞类型。在一特别佳的具体例中该细胞为人类细胞。优选为一种由腺病毒e1区域或其功能等效物转形的细胞。此一细胞株的优选实例为per.c6细胞株或其效物。在一个特别佳具体例中该细胞为cho细胞或其变异体。优选为一种利用麸酰胺酸合成酶(gs)载体系统用于表现抗体的变异体。
[0362]
本发明进一步提供一种用于生产一抗体的方法，其包括培养本发明的细胞且从该培养物收获该抗体。该细胞优选于无血清培养基内培养。优选地使该细胞适合供悬浮生长。进一步提供一种抗体其可由一种用于生产如本发明的抗体的方法而获得。该抗体优选由该培养物的培养基被纯化。该抗体比优选系经亲和力纯化。
[0363]
双特异性抗体典型还由表现编码该抗体的核酸的细胞来生产。在此情况下该细胞表现组成该双特异性抗体的不同的轻及重链。为此该细胞表现二种不同的重链及至少一轻链。因未经修饰的重链能彼此配对以形成二聚体，所以这些细胞典型除了生产双特异性抗体(异二聚体)的外还生产二种单特异性抗体(同型二聚体)。此原理也适用于未经修饰的重
链，其包括一种具有一重链可变区的第一重链及一具有至少二种重链可变区的第二重链，而使得表现这些二种重链的细胞生产一种单特异性抗体(二种第一重链配对的同型二聚体)、四价(quadrovalent)抗体(二种第二重链配对的同型二聚体)及三特异性抗体(第一及第二重链的异二聚体)。当细胞表现二或多种轻链时，生产的抗体中可能的重/轻链组合数目增加。为了降低不同的抗体种类数目(不同的重及轻链组合)所以生产前述的“共同的轻链”是优选的。
[0364]
一种表现一共同的轻链及等量的二种重链的抗体生产细胞典型生产50％双特异性抗体及25％的每种单特异性抗体(即有完全相同的重轻链组合)。任择地，在上文关于一具有一可变区的第一重链及一具有二种可变区的第二重链的实例中，该二种重链典型会生产50％的三特异性、25％的单特异性及25％的四特异性(quadrospecific)。
[0365]
已经公开数种方法有助于生产双特异性抗体或反过来单特异性抗体也一样，其可进一步用于有助于多特异性抗体生产。于本发明中优选的是细胞有利于生产该双特异性抗体超过生产相应的单特异性抗体。这件事通常通过修饰重链的恒定区域以使得其有利异质二聚合(即与另一重/轻链组合的重链进行二聚合)超过同质二聚合来达成。于优选的具体例中本发明的双特异性抗体包括具有兼容的异质二聚合域的二个不同的免疫球蛋白重链。本技艺中已有描述各种兼容的异质二聚合域。兼容的异质二聚合域优选为兼容的免疫球蛋白重链ch3异质二聚合域。本技艺描述了各种可完成这些重链的异质二聚合的方法，包括使用“旋钮至孔洞(knob into hole)”的双特异性抗体。
[0366]
于us13/866,747(现在颁布为us 9,248,181)、us14/081,848(现在颁布为us 9,358,286)及pct/nl2013/050294(公开为wo2013/157954)；并入本文以作为参考资料)中公开使用兼容的异质聚合二域供用于生产双特异性抗体的方法及构件。这些构件及方法也可以有利地使用于本发明中。具体地，基本上只生产双特异性全长igg分子的优选的突变为第一ch3域的氨基酸取代l351k及t366k(根据eu编号)(“kk
‑
变异体”重链)以及第二域的氨基酸取代l351d及l368e(“de
‑
变异体”重链)，或反的还然。先前在我们的us 9,248,181和us 9,358,286专利以及wo2013/157954 pct申请案中证明了de
‑
变异体和kk
‑
变异体优先地配对以形成异二聚体(所谓的“dekk”双特异性分子)。由于完全相同的重链之间的ch3
‑
ch3界面的带电残基之间强大的排斥作用，所以de
‑
变异体重链的同质二聚合(dede同型二聚体)或kk
‑
变异体重链的同质二聚合(kkkk同型二聚体)几乎不会发生。在一具体例中，包括会结合cd3的可变结构域的重链/轻链组合，包括了该重链的kk变异体。在此具体例中包括会结合cd3以外的抗原的可变结构域的重链/轻链组合，包括了该重链的de变异体。在优选的具体例中，该cd3以外的抗原系clec12a。在优选的具体例中，该会结合clec12a的可变结构域的vh如图13所描绘的mf4327。
[0367]
一些抗体于ch2/下部铰链区域予修饰，举例来说以降低fc受体的交互作用或降低c1q的结合。在一些具体例中，本发明的抗体为具有突变型ch2和/或下部铰链域的igg抗体以使得该双特异性igg抗体与fc
‑
γ受体的交互作用减少。此一突变型ch2和/或下部铰链域优选包括位置235和/或236(根据eu编号)的氨基取代，优选为l235g和/或g236r取代。
[0368]
任择地，一些抗体被修饰例如以提升fc受体的交互作用或提升c1q的结合。关于针对自体免疫适应症的具体例，此一修饰可能是优选的。
[0369]
本发明进一步提供一种治疗一个体的方法，其包括投予本发明的抗原结合蛋白，
优选为抗体给有需要的该个体。本发明进一步提供一种本发明的抗原结合蛋白，优选为抗体供用于治疗有需要的一个体。该个体优选有要从身体上移开的细胞。此类细胞可以是导向自体免疫反应的异常免疫细胞或癌细胞等等。适合于此目的的可变结构域为具有一共同的轻链及mf9249及mf8397的vh的此类及其他。这些具有适当低的亲和力及低的细胞杀灭活性但于自体免疫反应条件下是有功能的。适合于此目的的可变结构域为具有一共同的轻链及mf9267、mf8057、mf8058、mf8078及mf8508的vh的此类及其他。这些可变结构域具有适当的亲和力及适当的细胞杀灭活性用于抗癌目的。
[0370]
此外，一种在此列出的发明包括一种抗原结合蛋白或抗体，其具有有高细胞杀灭活性的高亲和力可变结构域，其能局部投予或局部表现，包括结合域mf8078。本发明进一步提供一种治疗一个体的方法，其包括投予本发明的抗原结合蛋白优选为抗体给有需要的该个体，其通过如熟悉此艺者已知的一种投予的局部化构件，包括例如，一溶瘤病毒，供用于黑色素瘤或于独立腔室例如脑内的其他癌症的局部治疗。
[0371]
本发明进一步提供一种本发明的抗原结合蛋白，优选为抗体供用于治疗有需要的一个体，其优选具有中到高的亲和力及相当高的细胞毒性例如本文所述的此类。适合于此目的的可变结构域为具有一共同的轻链及mf8057、mf8058、mf9267、mf8508及mf8078的vh的此类及其他。
[0372]
本发明进一步提供一种治疗一个体内的癌症或癌症的一风险的方法，其包括投予给有需要的该个体一会结合人类cd3的抗原结合蛋白，优选为一抗体，其包括一抗体可变结构域，该抗体可变结构域包括一重链可变区及一轻链可变区，其中该重链可变区包括一cdr1、cdr2及cdr3，该cdr1、cdr2及cdr3包括下列氨基酸序列：
[0373]
cdr1：sfgis
[0374]
cdr2：gfipvlgtanyaqkfqg
[0375]
cdr3：rgnwnpfdp；或
[0376]
包括下列氨基酸序列：
[0377]
cdr1：sx1tftis；
[0378]
cdr2：giipx2fgtityaqkfqg；
[0379]
cdr3：rgnwnpfdp；
[0380]
其中
[0381]
x1＝k或r；
[0382]
x2＝l或i。
[0383]
在优选的具体例中，x1＝k；及x2＝l。在另一优选的具体例中，x1＝r；及x2＝i。
[0384]
本发明进一步提供本发明的抗原结合蛋白，优选为抗体供用于治疗有需要的一个体，其优选具有中到高的亲和力及相当高的细胞毒性例如本文所述的此类。适合于此目的的可变结构域为具有一共同的轻链及mf8048、mf8056及mf8101的vh的此类及其他。
[0385]
本发明进一步提供一种治疗一个体内的癌症或癌症的一风险的方法，其包括投予给有需要的该个体一会结合人类cd3的抗原结合蛋白，优选为一抗体，其包括一抗体可变结构域，该抗体可变结构域包括一重链可变区及一轻链可变区，其中该重链可变区包括一cdr1、cdr2及cdr3，其包括下列氨基酸序列：
[0386]
cdr1：sktltis；
＝v；及x6＝m。
[0413]
本发明进一步提供一种治疗一个体内的癌症或癌症的一风险的方法，其包括投予给有需要的该个体一会结合人类cd3的抗原结合蛋白，优选为一抗体，其包括一抗体可变结构域，该抗体可变结构域包括一重链可变区及一轻链可变区，其中该重链可变区包括氨基酸序列
[0414]
evqlvqsgaevkkpgeslkisckgsgysftrfwigwvrqmpgkglewmgiiypgdsdtryspsfqgqvtisadkststaylqwsslkasdtgmyycvrhiryfdwsedyhyyldvwgkgttvtvss；或
[0415]
evqlvesgaevkkpgeslkisckgsgysftrywigwvrqmpgkglewmgiiypgdsdtryspsfqgqvtisadksistaylqwsslkasdtamyycvrniryfvwsedyhyymdvwgkgttvtvss；
[0416]
于此类cdrs以外的一个或多个位置处具有0
‑
10个、优选0
‑
5个氨基酸变异、插入、缺失、取代、加入或其组合。
[0417]
本发明进一步提供一种治疗一个体内的癌症或癌症的一风险的方法，其包括投予给有需要的该个体一会结合人类cd3的抗原结合蛋白，优选为一抗体，其包括一抗体可变结构域，该抗体可变结构域包括一重链可变区及一轻链可变区，其中该重链可变区包括一cdr1、cdr2及cdr3，该cdr1、cdr2及cdr3包括下列氨基酸序列：
[0418]
cdr1：syals；
[0419]
cdr2：gisgsgrttwyadsvkg；
[0420]
cdr3：dggysygpywyfdl。
[0421]
本发明进一步提供一种治疗一个体内的癌症或癌症的一风险的方法，其包括投予给有需要的该个体一会结合人类cd3的抗原结合蛋白，优选为一抗体，其包括一抗体可变结构域，该抗体可变结构域包括一重链可变区及一轻链可变区，其中该重链可变区包括一cdr1、cdr2及cdr3，该cdr1、cdr2及cdr3包括下列氨基酸序列：
[0422]
cdr1：syals；
[0423]
cdr2：aisgsgrttwyadsvkg；
[0424]
cdr3：dggytygpywyfdl。
[0425]
本发明进一步提供一种治疗一个体内的癌症或癌症的一风险的方法，其包括投予给有需要的该个体一会结合人类cd3的抗原结合蛋白，优选为一抗体，其包括一抗体可变结构域，该抗体可变结构域包括一重链可变区及一轻链可变区，其中该重链可变区包括氨基酸序列
[0426]
qvqlvqsggglvqpggslrlscatsgfkfssyalswvrqapgkglewvsgisgsgrttwyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycardggysygpywyfdlwgrgtlvtvss；或
[0427]
qvqlvesggglvqpggslrlscatsgftfisyalswvrqapgkglewvsaisgsgrttwyadsvkgrftisrdnskntlflqmnslraedtavyycardggytygpywyfdlwgrgtlvtvss；于此类cdrs以外的一个或多个位置处具有0
‑
10个、优选0
‑
5个氨基酸变异、插入、缺失、取代、加入或其的组合。
[0428]
本发明进一步提供一种治疗一个体内的癌症或癌症的一风险的方法，其包括投予给有需要的该个体一会结合人类cd3的抗原结合蛋白，优选为一抗体，其包括一抗体可变结构域，该抗体可变结构域包括一重链可变区及一轻链可变区，其中该重链可变区包括一cdr1、cdr2及cdr3，该cdr1、cdr2及cdr3包括下列氨基酸序列：
[0429]
cdr1：dytmh；
[0430]
cdr2：diswssgsigyadsvkg；
[0431]
cdr3：dhrgygdyegggfdy。
[0432]
本发明进一步提供一种治疗一个体内的癌症或癌症的一风险的方法，其包括投予给有需要的该个体一会结合人类cd3的抗原结合蛋白，优选为一抗体，其包括一抗体可变结构域，该抗体可变结构域包括一重链可变区及一轻链可变区，其中该重链可变区包括一cdr1、cdr2及cdr3，该cdr1、cdr2及cdr3包括下列氨基酸序列：
[0433]
cdr1：dytmh；
[0434]
cdr2：diswsx7gx8x9x
10
yadsvkg；
[0435]
cdr3：dhx
11
gygdyegggfdx
12
；
[0436]
其中
[0437]
x7＝s或g；
[0438]
x8＝s或t；
[0439]
x9＝i或t；
[0440]
x
10
＝g或y；
[0441]
x
11
＝r或m；
[0442]
x
12
＝h或y，
[0443]
优选x7、x8、x9及x
10
为s、s、i及g或是g、s、i及y或是s、t、t和g，并且优选x
11
及x
12
为r及h，或是r及y，或是m及y，更优选x7、x8、x9、x
10
、x
11
和x
12
为s、s、i、g、r和h或是g、s、i、y、r及y或是s、t、t、g、m及y，或是换句话讲，优选x7、x8、x9和x
10
为s、s、i及g，并且x
11
及x
12
为r和h；或x7、x8、x9和x
10
为g、s、i和y和x
11
和x
12
为r和y；或x7、x8、x9和x
10
为s、t、t和g，并且x
11
和x
12
为m及y。
[0444]
本发明进一步提供一种治疗一个体内的癌症或癌症的一风险的方法，其包括投予给有需要的该个体一会结合人类cd3的抗原结合蛋白，优选为一抗体，其包括一抗体可变结构域，该抗体可变结构域包括一重链可变区及一轻链可变区，其中该重链可变区包括氨基酸序列
[0445]
evqlvesggglvqpgrslrlscatsgfnfddytmhwvrqapgkglewvsdiswssgsigyadsvkgrftisrdnaknslwlqmnslrtedtalyfcakdhrgygdyegggfdywgqgtlvtvss；
[0446]
evqlvesggglvqpgrslrlscatsgftfddytmhwvrqapgkglewvsdiswssgsigyadsvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtalyfcakdhrgygdyegggfdhwgqgtlvtvss；
[0447]
evqlvesggglvqpgrslrlscvtsgftfddytmhwvrqapgkglewvsdiswssgttgyadsvkgrftisrdnakdslylqmnslrtedtalyycakdhmgygdyegggfdywgqgtlvtvss；或
[0448]
evqlvesggvvvqpggslrlscaasgftfddytmhwvrqapgkglewvsdiswsggsiyyadsvkgrftisrdnsknslylqmnslrtedtalyycakdhrgygdyegggfdywgrgtlvtvss；
[0449]
于此类cdrs以外的一个或多个位置处具有0
‑
10个、优选0
‑
5个氨基酸变异、插入、缺失、取代、加入或其组合。
[0450]
如上所述于治疗中的抗原结合蛋白优选为一抗体，优选包括一种会结合肿瘤抗原的重链
‑
轻链(h/l)组合。
[0451]
该抗体优选为一种人类或人化抗体。该抗体优选包括具有兼容的异质二聚合域的二个不同的免疫球蛋白重链。该兼容的异质二聚合域优选为兼容的免疫球蛋白重链ch3异
质二聚合域。该双特异性抗体针对肿瘤免疫学应用优选为具有突变型ch2和/或下部铰链域的igg抗体以使得该双特异性或多特异性igg抗体与fc
‑
γ受体的交互作用减少。该突变型ch2和/或下部铰链域优选包括于位置235和/或236(根据eu编号)的氨基取代，优选为l235g和/或g236r取代。任择地，针对自体免疫应用，该双特异性或多特异性与fc
‑
γ受体的交互作用通过修饰ch2和/或ch3域来提升。例如，通过工程处理(通过导入氨基酸取代)有较大的选择性结合活化的受体的fc区域，能创造抗癌mab或cd3靶向结合臂所欲的具有较大的媒介细胞毒性活性的能力的抗体供用于治疗自体免疫相关疾病。例如，一种报道的用于提升抗体的adcc的技术是无岩藻醣基化(afucosylation)。(参见例如junttila，t.t.，k.parsons，等人(2010)。“superior in vivo efficacy of afucosylated trastuzumab in the treatment of her2
‑
amplified breast cancer.”cancer research 70(11):4481
‑
4489)。因而进一步提供如本发明的双特异性抗体，其为无岩藻醣基化的。任择地，或另外地，据报道有多样其他的策略可用来达到adcc提升，例如包括醣化工程处理(glycoengineering)(kyowa hakko/biowa，glycart(roche)and eureka therapeutics)及突变诱发(xencor and macrogenics)，全部都是寻求要改良fc与低亲和力活化的fcγriiia结合，和/或要降低与低亲和力抑制fcγriib结合。
[0452]
该抗体优选包括一共同的轻链。
[0453]
本发明进一步提供一种双特异性抗原结合蛋白，优选为一双特异性抗体，其包括一会结合肿瘤抗原的可变结构域及一会结合人类cd3的可变结构域，其中该可变结构域各包括一不同的重链可变区及一共同的轻链可变区，以及其中该会结合人类cd3的可变结构域的重链可变区包括一cdr1、cdr2及cdr3，该cdr1、cdr2及cdr3包括下列氨基酸序列：
[0454]
cdr1：sfgis
[0455]
cdr2：gfipvlgtanyaqkfqg
[0456]
cdr3：rgnwnpfdp；或
[0457]
包括下列氨基酸序列：
[0458]
cdr1：sx1tftis；
[0459]
cdr2：giipx2fgtityaqkfqg；
[0460]
cdr3：rgnwnpfdp；
[0461]
其中
[0462]
x1＝k或r；
[0463]
x2＝l或i。
[0464]
在优选的具体例中，x1＝k；及x2＝l。在另一优选的具体例中，x1＝r；及x2＝i。
[0465]
本发明进一步提供一种双特异性抗原结合蛋白，优选为一双特异性抗体，其包括一会结合肿瘤抗原的可变结构域及一会结合人类cd3的可变结构域，其中该可变结构域各包括一不同的重链可变区及一共同的轻链可变区，以及其中该会结合人类cd3的可变结构域的重链可变区包括一cdr1、cdr2及cdr3，该cdr1、cdr2及cdr3包括下列氨基酸序列：
[0466]
cdr1：sktltis；
[0467]
cdr2：giipifgsityaqkfqd；
[0468]
cdr3：rgnwnpfdp；或
[0469]
包括下列氨基酸序列：
[0470]
cdr1：gsgis；
[0471]
cdr2：gfipffgsanyaqkfrd；
[0472]
cdr3：rgnwnpx
13
dp；
[0473]
其中
[0474]
x
13
＝或l或f。
[0475]
本发明进一步提供一种双特异性抗原结合蛋白，优选为一双特异性抗体，其包括一会结合肿瘤抗原的可变结构域及一会结合人类cd3的可变结构域，其中该可变结构域各包括一不同的重链可变区及一共同的轻链可变区，以及其中该会结合人类cd3的可变结构域的重链可变区包括氨基酸序列
[0476]
evqlvqsgaevkkpgssvkvsckasggtfrsfgiswvrqapgqglewmggfipvlgtanyaqkfqgrvtiiadkstntaymelsslrsedtavyycarrgnwnpfdpwgqgtlvtvss；
[0477]
qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasgdafksktftiswvrqapgqglewlggiiplfgtityaqkfqgrvtitadkstntafmelsslrsedtamyyctrrgnwnpfdpwgqgtlvtvss；
[0478]
evqlvqsgselkkpgssvkvsckasgvtfnsrtftiswvrqapgqglewlgsiipifgtityaqkfqgrvtitadkststafmeltslrsedtaiyyctrrgnwnpfdpwgqgtlvtvss；
[0479]
qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasggtfrgsgiswvrqapgqglewvggfipffgsanyaqkfrdrvtitadksattaymelsslrsedtaiyycakrgnwnpldpwgqgtlvtvss；
[0480]
qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasgvtfksktltiswvrqapgqglewlggiipifgsityaqkfqdrvsitadkstntaylelnslrsedtaiyycarrgnwnpfdpwgqgtlvtvss；或
[0481]
evqlvqsgaevkkpgssvkvsckasggtfrgsgiswvrqapgqglewvggfipffgsanyaqkfrdrvtitadksattaymelsslrsedtaiyycakrgnwnpfdpwgqgtlvtvss
[0482]
于此类cdrs以外的一个或多个位置处具有0
‑
10个、优选0
‑
5个氨基酸变异、插入、缺失、取代、加入或其组合。
[0483]
本发明进一步提供一种双特异性抗原结合蛋白，优选为一双特异性抗体，其包括一会结合肿瘤抗原的可变结构域及一会结合人类cd3的可变结构域，其中该可变结构域各包括一不同的重链可变区及一共同的轻链可变区，以及其中该会结合人类cd3的可变结构域的重链可变区包括一cdr1、cdr2及cdr3，该cdr1、cdr2及cdr3包括下列氨基酸序列：
[0484]
cdr1：rx3wig；
[0485]
cdr2：iiypgdsdtryspsfqg；
[0486]
cdr3：x4iryfx5wsedyhyyx6dv；
[0487]
其中
[0488]
x3＝f或y；
[0489]
x4＝h或n；
[0490]
x5＝d或v；
[0491]
x6＝l或m。
[0492]
在一具体例中，x3＝f；x4＝h；x5＝d；及x6＝l。在另外的具体例中，x3＝y；x4＝n；x5＝v；及x6＝m。
[0493]
本发明进一步提供一种双特异性抗原结合蛋白，优选为一双特异性抗体，其包括一会结合肿瘤抗原的可变结构域及一会结合人类cd3的可变结构域，其中该可变结构域各
包括一不同的重链可变区及一共同的轻链可变区，以及其中该会结合人类cd3的可变结构域的重链可变区包括氨基酸序列
[0494]
evqlvqsgaevkkpgeslkisckgsgysftrfwigwvrqmpgkglewmgiiypgdsdtryspsfqgqvtisadkststaylqwsslkasdtgmyycvrhiryfdwsedyhyyldvwgkgttvtvss；或
[0495]
evqlvesgaevkkpgeslkisckgsgysftrywigwvrqmpgkglewmgiiypgdsdtryspsfqgqvtisadksistaylqwsslkasdtamyycvrniryfvwsedyhyymdvwgkgttvtvss；
[0496]
于此类cdrs以外的一个或多个位置处具有0
‑
10个、优选0
‑
5个氨基酸变异、插入、缺失、取代、加入或其组合。
[0497]
本发明进一步提供一种双特异性抗原结合蛋白，优选为一双特异性抗体，其包括一会结合肿瘤抗原的可变结构域及一会结合人类cd3的可变结构域，其中该可变结构域各包括一不同的重链可变区及一共同的轻链可变区，以及其中该会结合人类cd3的可变结构域的重链可变区包括一cdr1、cdr2及cdr3，该cdr1、cdr2及cdr3包括下列氨基酸序列：
[0498]
cdr1：syals；
[0499]
cdr2：gisgsgrttwyadsvkg；
[0500]
cdr3：dggysygpywyfdl。
[0501]
本发明进一步提供一种双特异性抗原结合蛋白，优选为一双特异性抗体，其包括一会结合肿瘤抗原的可变结构域及一会结合人类cd3的可变结构域，该会结合人类cd3的可变结构域包括一抗体可变结构域，该抗体可变结构域包括一重链可变区及一轻链可变区，其中该重链可变区包括一cdr1、cdr2及cdr3，该cdr1、cdr2及cdr3包括下列氨基酸序列：
[0502]
cdr1：syals；
[0503]
cdr2：aisgsgrttwyadsvkg；
[0504]
cdr3：dggytygpywyfdl。
[0505]
本发明进一步提供一种双特异性抗原结合蛋白，优选为一双特异性抗体，其包括一会结合肿瘤抗原的可变结构域及一会结合人类cd3的可变结构域，其中该可变结构域各包括一不同的重链可变区及一共同的轻链可变区，以及其中该会结合人类cd3的可变结构域的重链可变区包括氨基酸序列
[0506]
qvqlvqsggglvqpggslrlscatsgfkfssyalswvrqapgkglewvsgisgsgrttwyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycardggysygpywyfdlwgrgtlvtvss；或
[0507]
qvqlvesggglvqpggslrlscatsgftfisyalswvrqapgkglewvsaisgsgrttwyadsvkgrftisrdnskntlflqmnslraedtavyycardggytygpywyfdlwgrgtlvtvss
[0508]
于此类cdrs以外的一个或多个位置处具有0
‑
10个、优选0
‑
5个氨基酸变异、插入、缺失、取代、加入或其组合。
[0509]
本发明进一步提供一种双特异性抗原结合蛋白，优选为一双特异性抗体，其包括一会结合肿瘤抗原的可变结构域及一会结合人类cd3的可变结构域，其中该可变结构域各包括一不同的重链可变区及一共同的轻链可变区，以及其中该会结合人类cd3的可变结构域的重链可变区包括一cdr1、cdr2及cdr3，该cdr1、cdr2及cdr3包括下列氨基酸序列：
[0510]
cdr1：dytmh；
[0511]
cdr2：diswssgsigyadsvkg；
[0512]
cdr3：dhrgygdyegggfdy。
[0513]
本发明进一步提供一种双特异性抗原结合蛋白，优选为一双特异性抗体，其包括一会结合肿瘤抗原的可变结构域及一会结合人类cd3的可变结构域，该会结合人类cd3的可变结构域包括一抗体可变结构域，该抗体可变结构域包括一重链可变区及一轻链可变区，其中该重链可变区包括一cdr1、cdr2及cdr3，该cdr1、cdr2及cdr3包括下列氨基酸序列：
[0514]
cdr1：dytmh；
[0515]
cdr2：diswsx7gx8x9x
10
yadsvkg；
[0516]
cdr3：dhx
11
gygdyegggfdx
12
；
[0517]
其中
[0518]
x7＝s或g；
[0519]
x8＝s或t；
[0520]
x9＝i或t；
[0521]
x
10
＝g或y；
[0522]
x
11
＝r或m；
[0523]
x
12
＝h或y，
[0524]
优选x7、x8、x9及x
10
为s、s、i及g或是g、s、i及y或是s、t、t和g，并且优选x
11
及x
12
为r及h，或是r及y，或是m及y，更优选x7、x8、x9、x
10
、x
11
和x
12
为s、s、i、g、r和h或是g、s、i、y、r及y或是s、t、t、g、m及y，或是换句话讲，优选x7、x8、x9和x
10
为s、s、i及g，并且x
11
及x
12
为r和h；或x7、x8、x9和x
10
为g、s、i和y和x
11
和x
12
为r和y；或x7、x8、x9和x
10
为s、t、t和g，并且x
11
和x
12
为m及y。
[0525]
本发明进一步提供一种双特异性抗原结合蛋白，优选为一双特异性抗体，其包括一会结合肿瘤抗原的可变结构域及一会结合人类cd3的可变结构域，其中该可变结构域各包括一不同的重链可变区及一共同的轻链可变区，以及其中该会结合人类cd3的可变结构域的重链可变区包括氨基酸序列
[0526]
evqlvesggglvqpgrslrlscatsgfnfddytmhwvrqapgkglewvsdiswssgsigyadsvkgrftisrdnaknslwlqmnslrtedtalyfcakdhrgygdyegggfdywgqgtlvtvss；
[0527]
evqlvesggglvqpgrslrlscatsgftfddytmhwvrqapgkglewvsdiswssgsigyadsvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtalyfcakdhrgygdyegggfdhwgqgtlvtvss；
[0528]
evqlvesggglvqpgrslrlscvtsgftfddytmhwvrqapgkglewvsdiswssgttgyadsvkgrftisrdnakdslylqmnslrtedtalyycakdhmgygdyegggfdywgqgtlvtvss；或
[0529]
evqlvesggvvvqpggslrlscaasgftfddytmhwvrqapgkglewvsdiswsggsiyyadsvkgrftisrdnsknslylqmnslrtedtalyycakdhrgygdyegggfdywgrgtlvtvss；
[0530]
于此类cdrs以外的一个或多个位置处具有0
‑
10个、优选0
‑
5个氨基酸变异、插入、缺失、取代、加入或其组合。
[0531]
在一具体例中，该会结合肿瘤抗原的可变结构域的重链可变区优选包括mf8233(egfr)
[0532]
qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsygiswvrqapgqglewmgwisaynantnyaqklqgrvtmttdtststaymelrslrsddtavyycakdrhwhwwldafdywgqgtlvtvss的氨基酸序列
[0533]
于该cdr以外的一个或多个位置处具有0
‑
10个、优选0
‑
5个氨基酸变异、插入、缺失、取代、加入或其的组合。
[0534]
在另一具体例中，该会结合肿瘤抗原的可变结构域的重链可变区优选包括
[0535]
mf4327(clec12a)的氨基酸序列
[0536]
qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftsyymhwvrqapgqglewmgiinpsggstsyaqkfqgrvtmtrdtststvymelsslrsedtavyycakgttgdwfdywgqgtlvtvss
[0537]
于此类cdrs以外的一个或多个位置处具有0
‑
10个、优选0
‑
5个氨基酸变异、插入、缺失、取代、加入或其组合。
[0538]
本发明进一步提供本发明的抗体或其衍生物或本发明的药学组合物，供用于治疗有需要的一个体。关于治疗一具有一肿瘤或处于有一肿瘤的风险的个体，优选的是该抗体为本发明的双特异性抗体。优选其中该cd3结合抗体包括一会结合肿瘤抗原的重/轻链组合。
[0539]
提供cd3/肿瘤抗原双特异性抗体及包括这些双特异性抗体的药学组合物供用于治疗实性或血液肿瘤。优选的实性肿瘤为属于上皮来源；妇科癌症例如卵巢癌及内膜癌；前列腺癌、脑癌及任何其他实性肿瘤。
[0540]
还提供本发明的cd3/肿瘤抗原双特异性抗体或其衍生物或包括这些双特异性抗体或其衍生物的药学组合物，供用于治疗各种骨髓来源的白血病及白血病前期疾病但此外b细胞淋巴瘤。可根据本发明治疗的疾病包括骨髓性白血病或白血病前期疾病例如如急性骨髓性白血病(aml)、骨髓发育不良症候群(mds)及慢性骨髓性白血病(cml)，及霍奇金氏(hodgkin)淋巴瘤及多数非霍奇金淋巴瘤。并且b
‑
all；t
‑
all、外膜细胞淋巴瘤也是本发明的抗体优选的治疗标靶。因此，本发明提供一种如本发明的双特异性全长igg抗体供用作治疗骨髓发育不良症候群(mds)、慢性骨髓性白血病(cml)、多发性骨髓瘤(mm)或优选为急性骨髓性白血病(aml)的制剂。还提供一种如本发明的双特异性igg抗体于制备用于治疗或预防mds、cml、mm或优选为aml的一药剂的用途。
[0541]
如本发明的抗体待投予至患者的量典型落于治疗范围(therapeutic window)内，意思是使用足够获得治疗效应的量，同时该量不超过会导致不可接受程度的副作用的阈值。获得所欲治疗效应所需的抗体量越低，治疗范围典型会越大。因而，如本发明的抗体于低剂量发挥足够的治疗效应为优选的。
[0542]
在欧洲及美国每年有大概30.000位患者诊断为有aml。这些患者中多数是60岁以上。年龄较大是aml的结果的主要负面决定因素且重症的老年aml患者的长期(五年)存活大概是10％。在诱导性化学治疗后已经缓解的几乎全部患者，于3年内都观察到疾病进展。目前缓解后的治疗于有aml的老年患者显示出的价值有限，如果有的话。因而，残留抗性白血病的负担仍很大，且存活的药物抗性白血病细胞亚族群快速产生复发。这些化学治疗无反应aml肿瘤细胞需要有完全不同的作用模式的新型药物为了诱发且支持完全缓解。纵然用许多加强的化学治疗组合可于超过50％的老年aml患者及大约80％年轻患者达到完全缓解(cr)，但反应及存活的进展依然是重大的研究挑战。于最近发表的于有aml的年龄较大的患者的65个随机临床试验的网络统合分析(15.110位患者)中，多数修正的研究诱导摄生法有相似或甚至更糟的功效解析，相较于传统用道诺霉素(daunorubicin)及阿糖胞苷(cytarabine)的3 7诱导摄生法而言。此标准的aml治疗与高发病率且甚至是死亡率有关连。cr再发的多数患者由于化学治疗后剩余的白血病干细胞。由于不可接受的毒性而限制了进一步的剂量加大。对优选毒性较小的新的治疗方式的迫切需要因而浮现，尤其是于有
aml的老年患者。
[0543]
化学治疗没有反应的aml的治疗能通过使用双特异性抗体来使t细胞从患者自身的免疫系统复位向至aml肿瘤细胞且随后活化肿瘤特异性t细胞而达成。此方法也被称为“t细胞衔接(t
‑
cell engaging)方法”。以此方式，强化了患者的免疫系统且重新靶向以攻击及根除aml肿瘤细胞。例如，cd3xclec12a双特异性igg抗体有效地复位向t细胞至aml肿瘤细胞，借此诱发aml肿瘤细胞溶解。
附图说明
[0544]
图1
[0545]
功能活性评估：bxpc3标靶细胞用egfrxcd3双特异性抗体治疗后的t细胞细胞毒性分析。各双特异性抗体包括一种由一以mf号码命名的重链可变区构成的cd3结合域，及一种包括一重链可变区mf8233的egfr结合域。这些可变区与一共同的轻链配对以形成一种egfrxcd3双特异性抗体。亲和力(hpb
‑
all结合)相对于bxpc3溶解。本发明的某些抗体展现出相对低的hpb
‑
all细胞结合电平其表示该抗体的cd3结合域以比较低的亲和力与人类cd3结合。很清楚的是相对较低的亲和力不一定会阻止bxpc3细胞的肿瘤抗原媒介的t细胞细胞毒性(bxpc3溶解，垂直轴)。该双特异性抗体mf8233 x mf8508及mf8233 x mf8057能有效的溶解bxpc3细胞而该双特异性抗体mf8233 x mf8397及mf8233 x mf9249虽然具有相似的结合却无法有效地如此做。而且，比较该双特异性抗体mf8233 x mf6955以较高的亲和力结合hpb
‑
all(即人类cd3)，但无法比结合cd3程度较小的该双特异性抗体mf8233 x mf8508及mf8233 x mf8057更有效地溶解bxpc3细胞。mf6955为与一共同的轻链组合的一重链可变区及使用作比较子序列(comparator sequences)，以及相应于us2014/0088295a1内的h1h7232b(1129)vh。该具有mf6955及相同的egfr结合域的比较子双特异性抗体分别具有对人类cd3的亲和力比mf9267更高，以及展现出比mf9267更有效的杀灭。相比的下，其他纳入本发明的cd3结合域的抗体，例如mf8058，具有如mf6955大致相同的结合活性，然而显示出更有效的bxpc3细胞杀灭，例如mf8233 x mf8058。其他包括本发明能够结合cd3的结合域的双特异性抗体显示出相对高的结合及更有效的杀灭，例如mf8233 x mf8078，其对本文所述的特定应用有用。然而其他的包括本发明能够结合cd3的结合域的双特异性抗体显示出相对低的亲和力及低杀灭，例如mf8233 xmf9249及mf8233 x mf8397，其对本文所述的任择应用有用。
[0546]
图2
[0547]
相较于无抗体对照的抗体滴定曲线，其表示其诱发t细胞媒介的bxpc3标靶细胞的杀灭％。显示抗体mf8233 x mf8078、mf8233x mf8397；及mf8233 xmf8508的曲线。
[0548]
图3
[0549]
各种双特异性抗体于用bxpc3标靶细胞的t细胞细胞毒性中的滴定曲线数据的概要。cd3 fab栏目表示cd3结合臂的mf号码。egfr臂具有已指明的mf8233号码。该栏目表示超级群号码以基于相同的vh基因节段列出变异体。表示cd3结合的栏目反映hbp
‑
all结合实验的结果。
[0550]
显示判定诱发t细胞媒介的bxpc3标靶细胞的溶解能力的二个独立细胞毒性分析的结果。
[0551]
图4
[0552]
用bxpc3标靶细胞对于有表现的cd8 t细胞进行的t细胞细胞毒性分析的t细胞活化。各种超级群号码的抗体滴定曲线，其列出变异体cd3结合域。该双特异性抗体的另一臂具有mf8233的重链结合域。为了比较该双特异性抗体mf8233 x mf6955及mf8233 x mf6964也被测试，mf6955及mf6964为与一共同的轻链组合的重链可变区且使用作比较子序列，以及分别相应于us2014/0088295a1内的h1h7232b(1129)vh及hh7241b(1145)。
[0553]
图5
[0554]
各种抗体于用bxpc3标靶细胞的t细胞活化t细胞细胞毒性分析中的滴定曲线数据的概要。mfnr.栏目表示cd3结合域的mf号码。egfr结合域具有已指明的mf8233号码。各种cd3结合域序列的超级群信息表示于栏目“超级群”内；表示cd3亲和力的栏目反映hbp
‑
all结合实验的结果。
[0555]
显示针对标识cd69及cd25的cd4 及cd8 细胞的结果。指明的双特异性抗体是一大池双特异性抗体中的范例。
[0556]
图6
[0557]
功能活性评估：用bxpc3标靶细胞的t细胞细胞毒性分析。亲和力(hpb
‑
all结合)相对于通过cd69表现来测量的cd8 t细胞活化。本发明的某些抗体展现出相对低的hpb
‑
all细胞结合电平其表示该抗体的cd3结合域以比较低的亲和力与人类cd3结合。这些亲和力不一定会阻止肿瘤抗原媒介的t细胞活化，如由cd8阳性cd69活化分析的结果所示。该双特异性抗体mf8233 x mf8508及mf8233 x mf8057能有效的活化t细胞而该双特异性抗体mf8233 xmf8397及mf8233 xmf9249无法有效地如此做。某些无法有效地结合这些细胞的cd3结合域也无法活化t细胞(见左下角)。而其他cd3结合域例如，mf8508及mf8057，其与hpb
‑
all细胞结合比比较子cd3结合域mf6955更少，使t细胞活化达相似的程度。其他包括本发明能够结合cd3的结合域的双特异性抗体显示出相对高的结合及高电平的活化，例如mf8078，其对本文所述的特定应用有用。然而其他包括本发明能够结合cd3的结合域的双特异性抗体显示出相对低的亲和力及低活化，例如mf9249及mf8397，其对本文所述的任择应用有用。
[0558]
图7
[0559]
功能活性评估：用hct116标靶细胞的t细胞细胞毒性分析。亲和力(hpb
‑
all结合)相对于hct
‑
116溶解。
[0560]
本发明的某些双特异性抗体展现出低的hpb
‑
all细胞结合电平其表示该抗体的cd3结合域以比较低的亲和力与人类cd3结合。很清楚的是低的亲和力不一定会阻止肿瘤抗原媒介的hct
‑
116细胞的细胞溶解(垂直轴)。该双特异性抗体mf8233 x mf8508及mf8233 x mf8057能有效的溶解hct
‑
116细胞而该双特异性抗体mf8233 xmf8397及mf8233 xmf9249无法有效地如此做。为了比较该双特异性抗体mf8233 x mf6955及mf8233 x mf6964以比例如，mf8233 x mf8508、mf8233xmf8057及mf8233 xmf9267更高的亲和力来结合hpb
‑
all(即人类cd3)，但无法比mf8233 x mf8508或mf8233 x mf9267更有效地，或比mf8233 xmf8057显着更有效地溶解hct
‑
116细胞，相对于如此处所示的测试中的结合上的差异。另一种包括本发明能够结合cd3的结合域的双特异性抗体显示出相对高的结合及高电平的杀灭，例如mf8078，其对本文所述的特定应用有用。然而其他包括本发明能够结合cd3的结合域的双特异性抗体显示出相对低的亲和力及低杀灭，例如mf9249及mf8397，其对本文所述的任择应
用有用。
[0561]
图8
[0562]
用hct
‑
116标靶细胞的t细胞细胞毒性分析中，相较于无抗体对照的抗体滴定曲线，其表示hct
‑
116细胞的杀灭％。显示各种双特异性抗体的曲线。
[0563]
图9
[0564]
各种抗体于用hct
‑
116标靶细胞的t细胞细胞毒性分析中的滴定曲线数据的概要。cd3 fab栏目表示cd3结合域的mf号码。egfr结合域具有已指明的mf8233号码。该栏目表示超级群号码以基于相同的vh基因节段列出变异体。表示cd3结合的栏目反映hbp
‑
all结合实验的结果。
[0565]
hct
‑
116细胞的溶解百分率及溶解的ec50值(ng/ml)表示于接下来的字段中。所指明的双特异性抗体是一大池双特异性抗体中的范例。
[0566]
图10
[0567]
图10a及10b列出mv1624表现载体及mv1625表现载体的示意图。
[0568]
图11
[0569]
单及双特异性igg内使用的共同的轻链。
[0570]
图11a：共同的轻链氨基酸序列。图11b：共同的轻链可变结构域dna序列及呈现(igkv1
‑
39/jk1)。图11c：共同的轻链恒定区域dna序列及转译。图11d：igkv1
‑
39/jk5共同的轻链可变结构域转译。图11e：v区域igkv1
‑
39a；图11f：共同的轻链的cdr1、cdr2及cdr3。
[0571]
图12
[0572]
双特异性分子的igg重链。图12a：ch1区域。图12b：铰链区域。图12c：ch2区域。图12d：含有l235g及g236r沉默替换的ch2。图12e：含有取代l351k及t366k(kk)的ch3域。图12f；含有取代l351d及l368e(de)的ch3域。
[0573]
图13
[0574]
编码本说明书中所述的重链可变区及其部分的各种dna的序列及其的氨基酸序列。
[0575]
图14
[0576]
来自超级群1附加的殖株与殖株mf8057及mf8058相比的特征化。a：于facs分析中所选的mf殖株与表现人类cd3
‑
tcr错合物的hpb
‑
all人类细胞的结合。b：以hct
‑
116细胞进行的t细胞细胞毒性分析，其表示hct
‑
116细胞的杀灭％。c
‑
e：表示t细胞活化的活化标识cd25及cd69以facs的定量。f
‑
g：来自细胞毒性分析之上清液的细胞介素生产。
[0577]
图15
[0578]
来自超级群4的殖株的特征化。a：所选的mf殖株与hpb
‑
all人类细胞的结合。b：以bxpc3细胞进行的t细胞细胞毒性分析，其表示bxpc3细胞的杀灭％。c
‑
e：来自细胞毒性分析之上清液的细胞介素生产。
[0579]
图16
[0580]
cd3功能活性评估：附加的殖株来自超级群1(mf8048、mf8101、mf8056)、超级群3(mf8562)及超级群4(mf8998)的亲和力(hpb
‑
all)于x轴上相对hct
‑
116溶解于y轴上。b：属于超级群1及超级群4的抗体，其于细胞毒性分析显示出相似的活性及不同的结合亲和力。c：属于超级群1及超级群3的抗体，其展现相似的结合亲和力及差异的溶解活性。
[0581]
图17
[0582]
呈双特异性cd3xegfr格式的cd3 fabs mf8998及mf8058的活性。
[0583]
图18
[0584]
一大组对cd3有特异性的iggs的facs结合数据。针对抗体mf5196、mf6955及mf6964，通过biacore
tm
来判定对于cd3δε
‑
fc抗原的结合，同时显示剩余殖株与hpb
‑
all细胞的facs结合数据。
[0585]
图19
[0586]
人类clec12a的核苷酸序列。
[0587]
图20
[0588]
人类cd3γ
‑
、δ
‑
、ε
‑
及ζ
‑
链的氨基酸序列。
[0589]
实施例
[0590]
细胞株
[0591]
bxpc3人类胰脏癌细胞株。
[0592]
hct
‑
116人类结肠癌细胞株。
[0593]
用cd3来免疫小鼠
[0594]
为了产生结合cd3的人类抗体，就该人类共同的轻链和一人类重链(hc)微小基因座(minilocus)(包括一群挑选的人类v基因节段、所有的人类ds和所有的人类js)而为基因转殖的小鼠(参见w02009/157771，在此被并入本案以作为参考)，用含tcr/cd3的脂质球(tcr/cd3 containing lipoparticles)(intergral molecular)来被免疫。这些小鼠称为小鼠。有关于特异性重链可变区，或者具有此处所公开的序列的三价多聚体，其可借由具有本领域中的通常技艺的人士所知道的方式来生成。
[0595]
小鼠以含有hek293t
‑
衍生的人类5d5m tcr/cd3的脂质球，继而为人类t细胞被免疫，以产生一种抗
‑
tcr/cdr3免疫反应及产生抗
‑
tcr/cd3抗体群组。
[0596]
脂质球直接从细胞表面浓缩(concentrate)构形上完整的膜蛋白，允许这些复杂的蛋白有如供抗体免疫和筛选的可溶性高浓度蛋白被操作(manipulated)。
[0597]
在本研究中使用于供免疫作用的脂质球含有5d5m tcrαβ组合。含有该5d5m tcrαβ组合的载体借由暂时转染至hek293t细胞(intergral molecular)中被合成、转殖和使用于产生含有此tcr/cd3组合的脂质球。
[0598]
5d5m tcrα
[0599]
mwgvfllyvsmkmggttgqnidqptemtategaivqinctyqtsgfnglfwyqqhageaptflsynvldgleekgrfssflsrskgysylllkelqmkdsasylcavmdsnyqliwgagtkliikpdiqnpdpavyqlrdskssdksvclftdfdsqtnvsqskdsdvyitdktvldmrsmdfksnsavawsnksdfacanafnnsiipedtffpspesscdvklveksfetdtnlnfqnlsvigfrilllkvagfnllmtlrlwss
[0600]
5d5m tcrβ
[0601]
mrirllccvafsllwagpviagitqaptsqilaagrrmtlrctqdmrhnamywyrqdlglglrlihysntagttgkgevpdgysvsrantddfpltlasavpsqtsvyfcasseaggntgelffgegsrltvledlnkvfppevavfepseaeishtqkatlvclatgffpdhvelswwvngkevhsgvstdpqplkeqpalndsryclssrlrvsatfwqnprnhfrcqvqfyglsendewtqdrakpvtqivsaeawgradcgftsvsyqqgvlsatilyeillgkatlyavlvsalv
lmamvkrkdf
[0602]
小鼠使用于使用tcr/cd3脂质球及初级人类t细胞的免疫作用。
[0603]
免疫时间表(immunization schedule)包括在第35、56、77和98天的时点(points)，于此类时点判定抗原
‑
特异性ig血清效价，其通过使用利用抗小鼠igg检测的qtg衍生的3sdx tcr/cd3阳性和阴性脂质球的elisa以及通过使用cd3c5e
‑
fc融合蛋白作为阳性对照的elisa来进行。在第35天抽取的血清内观察到的反应性将会决定那些小鼠发展出相关的抗tcr/cd3反应。
[0604]
对于所有免疫的小鼠，当有下列情况时，收集且储存淋巴材料用于抗体探索：
[0605]
对于人类tcr/cd3的效价为1/300(在使用脂质球的elisa中)；或：
[0606]
对于人类tcr/cd3的效价为<1/300且>1/100而且在最后的补强注射免疫(booster immunization)期间当中不会增高。
[0607]
使用脂质球的激活免疫(priming immunisation)
[0608]
为了激活(prime)小鼠对于tcr/cd3的体液性免疫反应，使用含有人类5d5m tcrαβ组合的脂质球用于免疫。脂质球和gerbu佐剂一起使用于第一次和第二次注射。
[0609]
使用多株t细胞的补强注射免疫
[0610]
小鼠通过皮下注射细胞悬浮液被免疫。第一次的补强注射免疫(第28天)包括由配于pbs的细胞和佐剂所构成的混合物且所有随后的注射品是仅由配于pbs的细胞所构成。在第35天时对人类tcr/cd3已发展出1/300的血清igg效价(借由使用脂质球的elisa来测定)的小鼠在第42、43和44天接受使用细胞的附加注射。不符合这些标准的小鼠接受使用细胞的补强注射免疫(第42天和第49天)。所有随后的免疫都是如配于pbs的细胞的皮下注射来给予。在最后的免疫的后，牺牲小鼠，为了血清被放血且采集脾脏和左侧腹股沟淋巴结。
[0611]
以elisa筛选来自经免疫的小鼠的血清
[0612]
通过elisa使用含有tcr/cd3的脂质球及空(null)脂质球来筛选期中(interim)血清igg效价。使用抗小鼠igg染色来测定血清igg效价，因为这种染色经证明是最为灵敏的。
[0613]
通过rt
‑
pcr转殖vh基因来产生“免疫”噬菌体抗体库
[0614]
使用来自成功免疫的小鼠的腹股沟淋巴结来构造“免疫”噬菌体抗体库。使用trizol ls以从淋巴组织萃取出rna且使用1μg的总rna于一种用igg
‑
ch1特异性引子的rt反应中。接而使用产生的cdna、利用内部开发的vh特异性引子来扩增vh编码cdna的多株库(polyclonal pool)，基本上如于marks等人(j mol biol.1991 dec 5；222(3)：581
‑
97)乙文中所述。产生的pcr产物接而选殖至一噬粒(phagemid)载体中用于显示fab片段在噬菌体上，如haard等人(j biol chem.1999 jun 25；274(26)：18218
‑
30)乙文中所述，但有例外是该轻链对于每个抗体而言是相同的并且为该载体所编码。在连接的后，此类噬粒用来转形大肠杆菌tg1细菌且转形的细菌被平盘培养在含有安比西林和葡萄糖的lb
‑
琼脂平盘上。所有的噬菌体库都含有>10e6个转形体并且具有>80％的插入物频率(insert frequency)。细菌在过夜生长后被收获并且根据已建立的程序用来制备噬菌体(de haard等人，jbiol chem.1999 jun 25；274(26):18218
‑
30)。
[0615]
挑选携带特异性地结合人类cd3的fab片段的噬菌体。
[0616]
根据标准程序来救援(rescued)噬菌体库(j mol biol.1991 dec 5；222(3):581
‑
97；j biol chem.1999 jun 25；274(26)：18218
‑
30)且以一或多轮的免疫噬菌体抗体库的选择来挑选噬菌体。于第1轮，使重组cd3蛋白涂覆于maxisorp
tm elisa平盘的孔或nunc免疫管上，而第2轮，使用重组cd3蛋白或过度表现人类cd3蛋白的细胞。用4％elk阻断maxisorp
tm elisa平盘或免疫管。噬菌体抗体库也用4％elk被阻断且在噬菌体库添加至经涂覆的抗原的前，也用过量的人类igg被阻断以耗乏fc区域结合物(binder)。
[0617]
在振荡条件下，噬菌体库与经涂覆的蛋白的孵育于室温执行2hrs。平盘或管子继而用配于pbs的0.05％吐温
‑
20(tween
‑
20)清洗，接着用pbs清洗5至10次。使用50mm甘胺酸(ph 2.2)溶析结合的噬菌体以及添加至大肠杆菌tg
‑
1且在37℃下孵育用于噬菌体感染。
[0618]
随后，将感染的细菌被平盘培养至含有安比西林和葡萄糖的琼脂平盘上，且在37℃下孵育过夜。于第1轮选择的后，从平盘刮掉群落且合并然后救援及扩增以制备富集的第1轮噬菌体库(pool)供用于合成的库(repertoire)。关于免疫库，于第1轮噬菌体选择的后筛选单一群落供用于标靶结合。
[0619]
抗体选殖及生产
[0620]
本文中使用的双特异性抗体彼此不同的处通常仅在一或二个可变结构域的重链可变区的特定氨基酸序列。抗体生产通过选殖重链可变区至表现载体的内用于表现重及轻链。用于生产双特异性抗体的方法为本技艺已知的。
[0621]
简言的，编码cd3靶向的可变结构域的重链可变区的dna选殖至mv1624载体中(见图10a)，该载体编码kk残基(l351k，t366k)于ch3区域供用于产生igg重链异二聚体(wo2013/157954及wo2013/157953)。该fc恒定区域于ch2内含有突变以使fc效应子功能沉默。编码该重链可变区的dna替代构造物内的充填(stuffer)区域。该可变区的前面有一编码的hc信号肽(未显示)。编码egfr靶向的可变结构域的重链可变区的dna选殖至mv1625载体中(图10b)，该载体表现双特异性抗体基础的抗体部分的第二重链，带有l351d
‑
l368e突变于ch3区域内(wo2013/157954及wo2013/157953)。编码该重链可变区的dna替代构造物内的充填区域。该可变区的前面有一编码的hc信号肽(未显示)。二种构造物还含有一种表现匣用于表现igkv1
‑
39/jk1轻链。同时表现该二重链及所提及的轻链导致了双特异性抗体的生产。
[0622]
使用293
‑
f细胞供用于表现所设计的抗体于24孔平盘格式。在转染前二天，293
‑
f细胞原液以1：1的比例于293
‑
f培养基中分离(split)并且在155rpm的回转式振荡速度(orbital shaking speed)的下、于37℃和8％co2下孵育过夜。细胞在转染的前一天稀释至5x105个细胞/ml的密度。4ml的悬浮细胞播种(seeded)至24深孔培养平盘内，以一个透气封件被覆盖并在285rpm的回转式振荡速度的下、于37℃和8％co2下孵育过夜。在转染当天，混合4.8ml的293
‑
f培养基与240μg的线性聚乙烯亚胺(polyethylenimine)(pei)(mw 25，000)。对于每一种要生产的igg，200μl的293f培养基
‑
pei混合物添加8μl的dna(对于异二聚体为4μl的编码各个重链的dna)。在温和地加入至细胞的前，该混合物在室温下孵育历时20分钟。在转染的后一天，稀释于500μl的293f培养基中的青霉素
‑
链霉素(pen strep)添加至每个孔内。此类平盘在285rpm的回转式振荡速度的下、于37℃和8％co2下孵育直到转染的后7天要收获的时。平盘在500g的下被离心5min，含有iggs之上清液使用10
‑
12μm熔喷聚丙烯过滤板(melt blown polypropylene filter plates)被过滤并在纯化前储存在
‑
20℃的下。
[0623]
从培养上清液纯化抗体
[0624]
收获含抗体的培养基且离心以移除细胞碎片。随后加入蛋白asepharose珠粒至该培养基。该培养基和蛋白a sepharose珠粒连同抗体一起孵育以允许结合。
[0625]
在孵育的后通过真空过滤器以从培养基单离珠粒并且清洗。此类抗体通过用溶析缓冲液孵育而从珠粒溶析出。
[0626]
选择性地，纯化的igg的缓冲液被交换/脱盐(desalted)。
[0627]
缓冲液交换
[0628]
为了要将纯化的抗体脱盐，使用一滤板或滤柱(filter column)来离心抗体部分(fraction)。离心滤板或滤柱以减少该抗体部分的体积。随后，添加pbs或所需要的缓冲液至该部分以用一低盐缓冲液来替换该缓冲液。选择性地，此离心步骤接着添加缓冲液步骤被重复俾以进一步脱盐该抗体的储存缓冲液。
[0629]
抗体肿瘤抗原特异性t细胞活化及bxpc3细胞或htc
‑
116细胞的溶解。
[0630]
特定cd3 x肿瘤抗原双特异性igg组合诱发肿瘤抗原特异性t细胞活化及肿瘤抗原阳性肿瘤细胞的溶解以一细胞毒性分析来测试。效应子细胞为健康的供体衍生的休眠t细胞而标靶细胞为bxpc3细胞或htc
‑
116细胞。
[0631]
根据标准技术、使用菲科尔(ficoll)和easysep人类t细胞单离套组而从来自健康的供体的全血单离出休眠t细胞，通过抗cd3抗体、使用流动式细胞测量术分析来检查>95％t细胞纯度以及随后被冷冻保存。关于细胞毒性分析，冷冻保存的t细胞被解冻并且使用，如果在解冻的时其的生存力借由标准锥虫蓝染色法来测定是>90％。细胞毒性分析简而言的，解冻的休眠t细胞和bxpc3或hct116标靶细胞以5：1的e：t比率共培养历时48小时。抗体以一稀释范围被测试。一cd3单特异性抗体及一egfr单特异性抗体，以及不相关的igg1同型对照mab含括在分析内作为对照(例如一种结合cd3及另一抗原如破伤风类毒素(tt)的抗体)。t细胞活化使用流动式细胞测量术被定量；cd8 t细胞根据cd8表现被圈选(gated)并且随后通过测量t细胞上的cd69表现来分析它们的活化状态。标靶细胞溶解通过测量活细胞的分率(fraction)而测定，其通过celltiterglo(promega)所评估的atp电平来测量。atp电平，通过在envision微量盘读数器上的发光来测量，结果为相对光单位(rlu)数值，其使用graphpad prism被分析。
[0632]
每一个样本的标靶细胞溶解计算如下：
[0633]
杀灭％＝(100
‑
(rlu样本/rlu无igg)
×
100)。
[0634]
于此分析中，该双特异性抗体具有二个结合域。一个一者靶向egfr且另一者靶向cd3。二个结合域都具有相同的(共同的)轻链可变区(vl)和不同的重链可变区(vh)。该egfr靶向的结合域具有一vh其带有mf8233的氨基酸序列。该cd3靶向的结合域具有一vh其带有针对cd3的已指明的mfs中的一的氨基酸序列。该双特异性抗体于ch2内含有突变以使fc效应子功能沈默。
[0635]
该抗体mf8233xmf8397诱发cd4及cd8 t细胞上的cd69(fig 4
‑
6)及cd25(fig 4
‑
6)的向上调节，其以5：1的e
±
t比率共培养于48小时后被判定。t细胞媒介的溶解于48小时后测量。
[0636]
cd3双特异性抗体特征化
[0637]
一种候选egfr/cd3 igg双特异性抗体的结合作用能使用任何合适的分析法被测
试。例如，与hpb
‑
all细胞上的膜表现的cd3结合(dsmz，acc 483)能通过移动式细胞测量术被评估(根据如前于wo2014/051433内所述的facs程序)。在一具体例中，一种候选egfr/cd3双特异性抗体与hpb all细胞上的cd3结合通过流动式细胞测量术被证实，其根据本技艺已知的标准程序来执行。与细胞表现的cd3的结合能使用转染cd3δ/ε或cd3γ/ε的cho细胞来确定。该候选双特异性igg1与egfr的结合能使用转染egfr表现构造物的bxpc3及hct
‑
116以及cho细胞来判定；一种cd3单特异性抗体及一种egfr单特异性抗体，以及不相关的igg1同型对照mab含括在分析内作为对照(例如一种结合cd3及另一抗原如破伤风类毒素(tt)的抗体)。
[0638]
从超级群1、3及4产生另外的殖株
[0639]
从免疫噬菌体库筛选(如于“挑选携带特异性地结合人类cd3的fab片段的噬菌体”节中所述)，携带特异性地结合人类cd3的fab片段的附加的殖株被特征化。从超级群1鉴定出附加的殖株，包括mf8048、mf8101及mf8056。从超级群3及超级群4鉴定出附加的殖株，包括超级群3的mf8562及超级群4的mf8998。
[0640]
使用次世代定序仪(ngs)分析从超级群4鉴定出另外的新殖株。ngs是对从用来产生抗cd3群组的小鼠呈现的vh基因库(pool)被执行。为了这个目的，从不同的小鼠获得的序列资料集与属于超级群4mf的mf序列作比较。此导致识别出属于超级群4序列变异体殖株mf10401及mf10428。不同序列的hcdr1及hcdr2内发现到数种不同的突变。
[0641]
所有来自超级群1、3及4的附加殖株的vh序列选殖至mv1624(dm
‑
kk)载体中且表现为cd3xegfr双特异性格式用于进一步特征化，如于以上的“抗体选殖及生产”节中所述。
[0642]
来自超级群1及4的另外的殖株的特征化
[0643]
来自超级群1附加的殖株就其呈双特异性格式的功能活性被特征化。该双特异性cd3xegfr抗体的egfr结合臂具有mf8233编码的氨基酸序列。作为对照，这些cd3殖株还以mf1337编码的氨基酸序列的另一抗原(例如破伤风类毒素)被测试。来自超级群1的参考mfs(mf8057及mf8058)含括在内以根据如以上的：“抗体肿瘤抗原特异性t细胞活化及bxpc3细胞或htc
‑
116细胞的溶解”及“cd3双特异性抗体特征化”节中所述来直接比较序列变异体的亲和力与来自超级群1已经特征化的mf殖株的亲和力。使用移动式细胞测量术来执行表现人类cd3
‑
tcr错合物的hpb
‑
all细胞的结合亲和力(图14a及图18)以及以细胞毒性分析(图14b
‑
e)分析来执行肿瘤抗原阳性肿瘤细胞(hct
‑
116)的t细胞活化及溶解。用具有mf1337对照臂的双特异性抗体没有观察到标靶细胞溶解。针对所测试的不同cd3殖株，观察到以剂量依赖的方式的标靶细胞溶解。mf8048观察到低标靶细胞溶解。cd4及cd8 t细胞上的活化标识cd69及cd25表现电平测量以facs染色用于评估t细胞活化。所有殖株都观察到剂量依赖的t细胞活化，及阴性对照没有观察到t细胞活化。最后，48hrs后使用assays(ebiosciences
tm
)、遵照标准制造商的指示来判定自以hct
‑
116细胞进行的egfrxcd3细胞毒性分析衍生之上清液内的ifn
‑
γ及tnf
‑
α细胞介素生产(图14f
‑
g)。
[0644]
针对属于超级群4的附加的殖株的特征化，以facs来判定与hpb
‑
all细胞结合亲和力(图15)。pg1337，一种有对破伤风类毒素特异性的二个完全相同的mf1337臂的单价抗体，使用作阴性对照。关于细胞毒性分析，使用hct
‑
116细胞及bxpc3细胞作为标靶细胞以测试mf8998的活性以及使用bxpc3标靶细胞以测试mf10401及mf10428的活性。含括具已知高活
性的cd3xtaa双特异性抗体在内作为阳性对照。标靶细胞溶解使用细胞生存力测量来定量。使用来自细胞毒性分析之上清液、用分析来测量il
‑
6、ifn
‑
γ及tnf
‑
α的细胞介素电平。
[0645]
因而发现所测试的三种超级群4的殖株展现出不同的结合但是展现出相似的溶解活性。纵然这些殖株的溶解活性是相似的，但观察到降低的细胞介素生产。
[0646]
表1
[0647]
mf组合aucmf8233xmf899813630mf8233xmf104282700mf8233xmf104019646mf1337xmf1337255
[0648]
表1：图15a所提及已指明的cd3殖株的结合的auc值。
[0649]
表2
[0650]
mf组合标靶aucec50(ng/ml)mf8233xmf8998egfr2536.9mf8233xmf10428egfr21610.7mf8233xmf10401egfr2414.6cd3x假：
‑
ctrl假11
‑
cd3xtaa: ctrltaa3694.5
[0651]
表2：图15a所提及已指明的cd3殖株的标靶细胞溶解的auc及ec50值。
[0652]
表3
[0653]
mf组合细胞介素aucec50(ng/ml)mf8233xmf8998il
‑
685851.2mf8233xmf10428il
‑
66598.6mf8233xmf10401il
‑
66573.1mf8233xmf8998ifnγ311>400mf8233xmf10428ifnγ107>4000mf8233xmf10401ifnγ114>4000mf8233xmf8998tnfα50
‑
mf8233xmf10428tnfα50
‑
mf8233xmf10401tnfα50
‑
[0654]
表3：图15a所提及已指明的细胞介素的量及cd3殖株的auc及ec50值。
[0655]
如由细胞毒性分析所评估的，观察到所有另外鉴定出的mfs为功能性的。接下来，绘制溶解于y轴上及结合亲和力于x轴上之间的图(图16)以了解于超级群内及跨越超级群的溶解及亲和力之间的关系。总的来说，产生了多样抗cd3 fabs群组其由多样的超级群所构成且涵盖一系列的亲和力。有趣地，超级群1和4导定出展现出相似的活性但是不同的cd3结合的殖株(图16b)。比较超级群1及3揭露了展现出相似的cd3结合及差异的活性的殖株(图16c)。
[0656]
表4
[0657]
mf组合aucec50(ng/ml)mf8233xmf805711728.5mf8233xmf80582834.4mf8233xmf81013551.0mf8233xmf85082676.4mf8233xmf89982328.0mf8233xmf839762>400mf8233xmf856257>400
[0658]
表4：图16b与16c所提及已指明的cd3殖株的标靶细胞溶解的auc及ec50值。
[0659]
cd3抗原特征化
[0660]
如以上所述，发现分别来自超级群1及超级群4的二个殖株，即mf8058及mf8998，在与作为结合作为肿瘤细胞抗原的egfr的fab臂的殖株mf8233一起呈双特异性格式的情况下有相似的溶解活性(图17)。针对此实验，对hct
‑
116细胞的溶解活性如上文所述被测量。mf9257xmf8233使用作阳性对照以及mf9257xmf1337使用作阴性对照。从图17及表5中可以看出，多种测试的双特异性抗体观察到剂量依赖及高的杀灭百分率。
[0661]
表5
[0662][0663]
表5：图17所提及已指明的双特异性抗体于标靶细胞溶解的auc及ec50值。阴性对照显示无显着可测量的活性。
[0664]
结合亲和力
[0665]
如于“cd3双特异性抗体特征化”节中所述，附加的cd3殖株以facs来分析对于表现人类cd3的hpb
‑
all细胞的结合亲和力。mf6955及mf6964对于cd3的亲和力通过表面电浆子共振(spr)技术、使用biacore
tm
t100来测量。抗人类igg小鼠单株抗体(becton and dickinson，cat.nr.555784)使用游离胺化学(nhs/edc)偶合至cm5传感器芯片表面。继而捕捉cd3xtaa双特异性抗体于此传感器表面上。一浓度范围的重组纯化的抗原人类cd3δε
‑
fc蛋白随后于传感器表面移动来测量缔合及解离速率。在每周期的后，通过hcl脉冲使传感器表面再生且再次捕捉cd3xtaa双特异性抗体。从得到的感应图，使用biaevaluation软件来判定缔合及解离速率。图18说明所产生的cd3组的结合亲和力范围。