一种利用LAMP技术快速检测金黄色葡萄球菌的引物组、检测方法、试剂盒及应用与流程

一种利用lamp技术快速检测金黄色葡萄球菌的引物组、检测方法、试剂盒及应用
技术领域
1.本发明属于微生物检测技术领域，尤其涉及一种利用lamp技术快速检测金黄色葡萄球菌的引物组、检测方法、试剂盒及应用。


背景技术：

2.金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)是一种常见的食源性致病菌。金黄色葡萄球菌代谢类型为需氧或兼性厌氧，对环境要求不高，37℃为最适生长温度，但在各种恶劣环境中仍能存活，可耐高盐，最高可以耐受15％浓度的nacl溶液，且对高温有一定的耐受能力，在80℃以上的高温环境下可存活30min以上。金黄色葡萄球菌在适当条件下可产生肠毒素，引起食物中毒。近几年，金黄色葡萄球菌引发的食物中毒报道层出不穷，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒占食源性微生物食物中毒事件的25％左右，每年近十万人感染此病菌，成为仅次于沙门氏菌和副溶血杆菌的第三大微生物致病菌。对食品中金黄色葡萄球菌进行精准检测是保障食品安全和指导细菌治疗的重要手段。
3.目前针对食源性致病菌的检测主要有培养鉴定法、酶联免疫吸附法、pcr分析法。细菌培养法是病原菌检测金标准，但需4
‑
7天出结果，操作繁琐、耗时费力，在敏感性与特异性方面存在局限性，只能检测活细菌，且需要熟练的操作经验；酶联免疫吸附法(elisa)在特异性方面较好，但需要依赖于酶标仪等专业设备。各种pcr技术主要通过dna提取、pcr扩增、电泳观察或者荧光曲线等分析病原菌，检测敏感、准确、迅速，但仍依赖昂贵的pcr仪，检测成本较高，对实验技术要求较高，难以胜任现场化便携式快速检测。


技术实现要素：

4.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种简单、高效、特异、实用的快速检测金黄色葡萄球菌检测方法，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
5.本发明是这样实现的，一种利用lamp技术快速检测金黄色葡萄球菌的引物组，引物序列如下：
6.spa
‑
f3:aagatggcaacaagcctg；
7.spa
‑
b3:tgttagcatctgcatggt；
8.spa
‑
fip:ccgtttgcttttgcaatgtcagcaacggagtacatgtcg；
9.spa
‑
bip:cactactgctgacaaaattgctgcaacaacaagttcttgaccag。
10.本发明还提供了一种快速检测金黄色葡萄球菌的lamp检测试剂盒，包括：2
×
lamp反应缓冲液、bst 2.0warmstart dna聚合酶、20
×
eva green、120μm羟基溴酚蓝、上述的引物组。
11.进一步地，所述2
×
lamp反应缓冲液包括：40mm tris，20mm kcl，16mm mgso4，20mm(nh4)2so4，0.2％tween
‑
20，2.8mm dntps，1m甜菜碱，ph 8.8。
12.进一步地，还包括：阳性对照样品金黄色葡萄球菌atcc12600、标准菌株atcc 13076、标准菌株atcc14028、标准菌株d68
‑
4、插入了金黄色葡萄球菌spa基因的puc57载体质粒中的至少一种。
13.进一步地，外引物spa
‑
f3和spa
‑
b3与内引物spa
‑
fip和spa
‑
bip的浓度比例为8:1。
14.本发明还提供了一种利用lamp技术快速检测金黄色葡萄球菌的检测方法，包括：利用上述的lamp检测试剂盒对样品dna进行扩增，反应结束后样品呈天蓝色为阳性，紫罗兰色为阴性；或用琼脂糖凝胶电泳检测出现梯形条带为阳性，没有梯形条带为阴性。
15.进一步地，lamp反应体系为25μl：12.5μl的2
×
lamp缓冲液，1μl的内引物spa
‑
fip，1μl的内引物spa
‑
bip，1μl外引物spa
‑
f3，1μl外引物spa
‑
b3，1μl染料羟基溴酚蓝，1μl的荧光染料20
×
eva green，1μl的bst 2.0warmstart dna聚合酶，3.5μl无酶水，2μl dna样品。
16.进一步地，反应条件为65℃恒温45min，90℃灭活2min。
17.本发明还提供了如上述的引物组或检测试剂盒或检测方法在检测金黄色葡萄球菌中的应用，主要用于食品等非医疗诊断行业中目标微生物的检测。
18.本发明选用金黄色葡萄球菌毒力基因spa(genebank id:kc311343.1)作为其特异性靶标，设计了4条能在62
‑
68℃下扩增该基因的特异性引物组，通过可视化染料指示检测结果，由紫罗兰色(阴性)变为天蓝色(阳性)，该方法检测金黄色葡萄球菌其特异性好、操作简单，无需昂贵仪器，且灵敏度比常规pcr高。
19.综上所述，本发明的优点及积极效果为：
20.1、快速高效：从样品到结果在一小时内完成，扩增产物理论上是108‑
10
10
个靶序列的拷贝。
21.2、操作简单，实用性强：反应体系被冻干只需加入对应体积的无酶水和dna样品即可，不需要专业生物技术人员，反应不需要pcr仪器，简单的恒温装置即可比如水浴锅。
22.3、特异性强：根据lamp反应原理只有当4条引物完全与靶序列匹配时才能快速高效进行扩增，使用上述引物组只能扩增金黄色葡萄球菌。对其他致病菌比如沙门氏菌、志贺杆菌等结果均为阴性。
23.4、高灵敏度：对金黄色葡萄球菌的检出限是10
‑6ng/μl。
24.5、在条件有限的地区，利用本技术试剂盒可较为便捷地通过肉眼观察而判定检测结果，操作相对简单、设备依赖度低。
附图说明
25.图1是金黄色葡萄球菌引物特异性验证；a为扩增曲线，b为可视化结果，c为扩增产物跑胶结果；
26.图2是金黄色葡萄球菌特异性引物筛选；a为nuc基因设计引物扩增情况，b为spa基因对应12组lamp引物扩增情况，c为meca基因对应lamp引物扩增情况；
27.图3是金黄色葡萄球菌检测限测试；a为扩增曲线，b为可视化结果，c为扩增产物电泳结果。
具体实施方式
28.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明
进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
29.根据本技术包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
30.为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本技术中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。
31.本发明下述各实施例中未特别限定温度时，则均为常温条件。常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。
32.本发明中涉及的基因、蛋白或其片段可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。
33.本发明披露了一种利用lamp技术快速检测金黄色葡萄球菌的引物组、检测方法、试剂盒及应用。本发明试剂盒可以快速(1小时内)特异地检测金黄色葡萄球菌，检测限是10
‑6ng/μl。其操作简单、结果易于判读，适合进出口检疫、食品卫生及临床样本检测。
34.本发明中涉及的菌种：金黄色葡萄球菌atcc12600、痢疾志贺氏菌atcc 13313、肠出血性大肠杆菌(o157：h7)、沙门菌atcc13076来自湖北海关，肺炎克雷伯菌、表皮葡萄球菌、松鼠葡萄球菌均为本实验室保存。下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
35.实施例1金黄色葡萄球菌特异性lamp检测方法的建立
36.1、纯培养细菌dna提取
37.将上述所有细菌接种于lb液体培养基，37℃有氧条件下过夜。取菌液1ml用商品化细菌基因组提取试剂盒严格按照步骤提取基因组dna，样品存于
‑
20℃。
38.2、粪便模拟样品制备及dna提取
39.取新鲜培养细菌300μl与2g无菌正常饲养小鼠粪便用pbs缓冲液混均，取100μl混悬液接种于lb液体培养基37℃过夜，取培养液1ml按照1中方法提取基因组dna，样品存于
‑
20℃。
40.3、lamp反应
41.标准lamp反应体系25μl组成如下：12.5μl的2
×
lamp缓冲液，1μl内引物spa
‑
fip，1μl内引物spa
‑
bip，1μl外引物spa
‑
f3，1μl外引物spa
‑
b3，1μl羟基溴酚蓝，1μl eva green(20
×
)，1μl bst 2.0warmstart dna聚合酶，3.5μl无酶水，2μl dna样品。
42.spa
‑
f3:aagatggcaacaagcctg；
43.spa
‑
b3:tgttagcatctgcatggt；
44.spa
‑
fip:ccgtttgcttttgcaatgtcagcaacggagtacatgtcg；
45.spa
‑
bip:cactactgctgacaaaattgctgcaacaacaagttcttgaccag。
46.每个检测样品设置2个复孔，其中金黄色葡萄球菌atcc12600基因组dna为阳性对照组，沙门菌atcc13076、痢疾志贺氏菌atcc 13313、肠出血性大肠杆菌(o157：h7)、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、表皮葡萄球菌、松鼠葡萄球菌为阴性对照组，无酶水为空白对照组。
47.在bio
‑
rad实时荧光定量pcr仪上进行恒温扩增，扩增条件：65℃ 60min，90℃灭活2min终止反应。粪便模拟样品和纯菌液特异性实验重复3次结果一致，结果如表1所示。反应产物在2
‑
3％琼脂糖凝胶90v恒压电泳45min，凝胶成像。
48.表1.模拟样品及标准菌株检测结果
[0049][0050]
注：“ ”：阳性反应为天蓝色；
“‑”
：阴性反应为紫罗兰色
[0051]
4、结果判断
[0052]
图1a反映了扩增样品中仅有金黄色葡萄球菌出现明显扩增，而图1b显示反应结束后样品呈天蓝色为阳性，紫罗兰色为阴性，仅有金黄色葡萄球菌出现天蓝色结果；图1c表明阳性扩增产物出现梯形条带，其他阴性及空白对照均无扩增条带。上述结果表明，本技术引物组及试剂盒对金黄色葡萄球菌有特异性扩增效果。
[0053]
实施例2特异性引物筛选
[0054]
本发明中针对nuc、spa、meca三个靶基因的共设计19个lamp引物组，其他的引物序列如表2所示，其中spa基因引物组12个，每组引物分别具有外引物f3和b3、内引物bip和fip，以相同浓度金黄色葡萄球菌atcc12600基因组为模板，采用实施例1相同的反应条件和扩增模板，分别进行独立扩增检测，其结果如图2所示。
[0055]
图2中，不同序号代表对应基因的引物组编号。扩增30分钟后，nuc的4组lamp引物均无阳性结果；spa基因对应的lamp引物扩仅有spa9出现明显天蓝色变化，相比于其他11组引物均具有显著优势；meca基因对应3组扩增引物扩增效率均较低，无明显扩增结果。综上所述，相较于其他目的基因或相同基因的引物组，本技术引物组(spa9)具有显著优势。
[0056]
表2.筛选引物组
[0057]
[0058]
[0059][0060]
实施例3试剂盒灵敏度测试
[0061]
以金黄色葡萄球菌atcc12600基因组为模板，以spa
‑
f3、spa
‑
b3引物进行pcr扩增，所得产物用商业化回收，后用无酶水进行梯度稀释，从高到低依次为1ng/μl、10
‑1ng/μl、10
‑2ng/μl、10
‑3ng/μl、10
‑4ng/μl、10
‑5ng/μl、10
‑6ng/μl。以此为模板进行灵敏度测试，实时荧光扩增曲线图、颜色变化、产物电泳结果见图3。
[0062]
图3a表明，不同浓度靶基因所需的扩增时间存在浓度依赖关系，浓度为10
‑6ng/μl时仅需40min左右即可出现扩增曲线；图3b显示，浓度范围10
‑6～1ng/μl的基因组核酸，本技术试剂盒均可产生对应颜色变化(天蓝色)；图3c进一步证实了不同浓度核酸扩增后均有梯度条带。上述结果一致表明，本技术设计的lamp引物组及试剂盒可检测低至10
‑6ng/μl的基因组浓度，约相当于100copies/μl。
[0063]
本发明可视化lamp快速检测试剂盒使用简单，储存方便，检测条件要求低，可以在45min内完成对金黄色葡萄球菌准确快速检测。
[0064]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。