一种同时检测三种猫腹泻病毒的三重PCR检测方法及其用途与流程

一种同时检测三种猫腹泻病毒的三重pcr检测方法及其用途
技术领域
1.本发明属于病毒核酸检测领域，具体涉及一种同时检测三种猫腹泻病毒的三重pcr检测方法及其用途。


背景技术：

2.猫的腹泻性疾病在临床多发，其中以传染性病原引起的临床症状最为严重，尤其是以猫泛白细胞减少症病毒(feline parvovirus，fpv)为代表的肠道病毒是引起幼年猫发病死亡的主要原因。除了fpv，病毒宏基因组学研究结果表明猫粪便样本中也存在猫星状病毒(feline astrovirus，fastv)、猫肠道冠状病毒(feline enteric coronavirus，fecov)以及其他多种肠道病毒混合感染的情况，这可能是决定临床抗病毒治疗效果和预后的影响因素。
3.猫细小病毒(feline parvovirus,fpv)又称猫泛白细胞减少症病毒、猫瘟热病毒或猫传染性肠炎病毒。病毒的基因组包含编码非结构蛋白(ns)和结构蛋白(vp1与vp2)等4个编码基因的开放性阅读框(orf)，vp基因易发生重组变异。猫感染细小病毒后的临床表现为高热、呕吐、腹泻和肠炎，能够导致白细胞数目严重减少。该病毒主要感染猫科与鼬科等多种动物，尤其以6月龄以下幼小动物的发病率和死亡率更高，是目前肉食兽细小病毒属中感染范围最广、致病性最强的一种病毒。
4.fastv为哺乳动物星状病毒属的无包膜单股正链rna病毒，包含编码开放性阅读框(orf)1a、1b和核衣壳蛋白(n)3个编码基因的序列，其中orf1序列显示出了明显的基因多态性。该病毒与人的星状病毒在进化关系上相近，因此，在共居环境中，人与猫的频繁接触可能会增加交叉感染的风险。
5.fecov为冠状病毒属的单股正链rna病毒，包括orf1a、orf1b、纤突蛋白(s)、膜蛋白(m)、非结构蛋白(n)等6个编码基因序列。猫单一感染fecov后通常无明显临床症状。感染猫康复后仍有感染风险，并隐性带毒，是导致该病毒持续传播和流行的主要原因之一。当fecov的s和3c基因突变时，ⅰ型fecov可能转变为具有强致病性的ⅱ型猫传染性腹膜炎病毒(fipv)。
6.目前对fpv的分子检测方法十分成熟，但对其他肠道病毒的临床检测仍然缺乏高效的方法，目前国内也尚未有同时检测fpv/fastv/fecov的分子检测方法。因此，若能开发出一种能够同时检测多种猫腹泻病毒感染的三重pcr检测方法，将有助于提升猫腹泻病毒检测水平，在疾病诊断和防治等方面具有重要的应用前景。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种同时检测三种猫腹泻病毒的三重pcr检测方法，能够同时检测猫星状病毒(fastv)、猫细小病毒(fpv)、猫肠道冠状病毒(fecov)。
8.本发明的目的通过以下方案实现：
9.提供一种同时检测三种猫腹泻病毒的引物组合，包括fastv、fpv和fecov的检测引
物，具体引物序列如下：
10.fastv
‑
f：5
’‑
ctggaagagctatgacaccattg
‑3’
，
11.fastv
‑
r：5
’‑
ccatgaacgcagagagcaac
‑3’
；
12.fpv
‑
f：5
’‑
tggttctgggggtgtggg
‑3’
，
13.fpv
‑
r：5
’‑
gctgctggagtaaatggc
‑3’
；
14.fecov
‑
f：5
’‑
ccaaaagacgtggtcgttctaa
‑3’
；
15.fecov
‑
r：5
’‑
gttttcttccaggtgtgtttgt
‑3’
。
16.临床上引起猫腹泻的病毒病原多样，但常见的病原仍为fpv，而fastv和fecov直接或间接引起临床发病的情况并未得到足够重视，其中的原因之一是尚缺少高效的检测方法，本发明提供的引物组合可以同时检测上述三种病毒，避免了对同一样本进行多次病原检测，提升了检测效率。
17.所述fastv的引物序列选取自编码开放性阅读框orf1b，fpv的引物序列选取自病毒蛋白vp2基因序列，fecov的引物序列选取自编码开放性阅读框orf1b。
18.本发明还提供了一种同时检测三种猫腹泻病毒的三重pcr检测方法，利用上述引物组合对fastv、fpv和fecov同时进行检测；
19.引物组合对中各引物的工作浓度比为：fastv：fpv：fecov＝0.8～1.4：0.8～1.4：0.8～1.4。
20.进一步地，引物组合对中各引物的工作浓度比为：fastv：fpv：fecov＝0.8～1.2：0.8：0.8～1.2。
21.三重pcr的反应体系为：
22.fastv、fpv和fecov混合模板dna0.8～1.5μl，2
×
taq pcr master mix10～15μl，fastv的上下游引物均为0.3～0.8μmol/l，fpv的上下游引物均为0.3～0.8μmol/l，fecov的上下游引物均为0.3～0.8μmol/l，用ddh2o补足至25μl。
23.进一步地，所述三重pcr的反应体系为：
24.fastv、fpv和fecov混合模板dna1.5μl，2
×
taq pcr master mix 12.5μl，fastv的上下游引物均为0.5μmol/l，fpv的上下游引物均为0.4μmol/l，fecov的上下游引物均为0.6μmol/l，用ddh2o补足至25μl。
25.所述三重pcr的扩增程序为：
26.92～97℃预变性1.5～2.5min，90～97℃15～40s，45～60℃15～40s，70～75℃20～35s，共30～35个循环，最后70～75℃延伸8～15min；
27.进一步地，所述三重pcr的扩增程序为：95℃预变性2min，95℃30s，50～54℃30s，72℃30s，共35个循环，最后72℃延伸10min。
28.本发明还提供了一种上述的引物组合在制备用于猫星状病毒、猫细小病毒、猫肠道冠状病毒检测的试剂盒中的用途。
29.进一步地，所述试剂盒中，引物组合对中各引物的工作浓度比为：fastv：fpv：fecov＝0.8～1.4：0.8～1.4：0.8～1.4。
30.进一步地，所述试剂盒中，各引物的工作浓度为：fastv的上下游引物均为0.5μmol/l，fpv的上下游引物均为0.4μmol/l，fecov的上下游引物均为0.6μmol/l。
31.进一步地，所述试剂盒在工作时的反应程序为：95℃预变性2min，95℃30s，50～54
℃30s，72℃30s，共35个循环，最后72℃延伸10min。
32.本发明具有如下有益效果：
33.(1)本发明引物组合可同时检测猫星状病毒(fastv)、猫细小病毒(fpv)、猫肠道冠状病毒(fecov)。
34.(2)本发明检测方法检测效率高，特异性、敏感性、重复性、稳定性好，最低检测限为2.4～7.1pg/μl，为临床猫腹泻性疾病的快速诊断及流行病学调查提供了重要的技术手段。
附图说明
35.图1为三种病毒引物浓度的正交试验结果的电泳图；
36.图2为三重pcr反应退火温度的优化结果的电泳图；
37.图3为三重pcr的特异性试验结果电泳图；
38.图4为三重pcr敏感性试验结果电泳图；
39.图5为样本的三重pcr扩增结果电泳图。
40.其中，图1中，1
‑
36：样本；n：阴性对照；
41.图2中，1
‑
6：48℃、50℃、52℃、54℃、56℃、58℃；n：阴性对照；
42.图3中，1
‑
3：fpv、fastv和fecov；4：fpv、fastv和fecov的混合质粒；5
‑
9：frv、fcv、fnov、cpv和ccov；n：阴性对照
43.图4中，1
‑
8：100、101、102、103、104、105、106、107梯度稀释；n：阴性对照；
44.图5中，1
‑
22：部分临床样本；n：阴性对照；p：混合质粒模板；图1～5中的m：dna marker ii。
具体实施方式
45.下面对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
46.猫星状病毒(fastv)、猫细小病毒(fpv)、猫肠道冠状病毒(fecov)、猫诺如病毒(feline norovirus，fnov)、猫鼻气管炎病毒(feline rhinotracheitis virus，frv)、猫嵌杯状病毒(feline calicivirus，fcv)、犬细小病毒(canine parvovirus，cpv)和犬冠状病毒(canine coronavirus，ccov)的阳性样本均由本西南民族大学动物医学实验室鉴定保存。207份猫粪便样本(66份临床健康样本，141份腹泻样本)采集自于成都市区5家宠物医院(2019年11月
‑
2020年11月)。
47.病毒基因组dna/rna提取试剂盒、大肠杆菌dh5α感受态细胞和dna markerⅱ、2
×
taq mastermix购自天根生化科技(北京)有限公司产品；rnaiso plus、pmd19
‑
t载体、prime script tm
rt购自takara宝生物工程(大连)有限公司产品；e.z.n.a gel extraction kit胶回收试剂盒和e.z.n.a.tm plasmid kit质粒提取试剂盒购自omega公司。
48.以下实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中所使用的材料、试剂，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
49.本发明所述fastv的引物序列选取自编码开放性阅读框orf1b，fpv的引物序列选
取自病毒蛋白vp2基因序列，fecov的引物序列选取自编码开放性阅读框orf1b。
50.实施例1
51.将本发明设计的3种猫腹泻病毒引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物信息见表1。
52.表1引物信息
[0053][0054]
实施例2三种猫病毒的三重pcr检测方法的建立
[0055]
1.质粒标准品的制备和质粒dna的提取
[0056]
取fastv、fpv和fecov阳性样本，按照dna或rna提取试剂盒说明书提取核酸或反转录为cdna，再分别扩增目的基因片段。将阳性pcr产物纯化、回收并连接于pmd19
‑
t载体，构建得到pmd19
‑
t
‑
fastv orf1b、pmd19
‑
t
‑
fpv vp2和pmd19
‑
t
‑
fecov n三种重组质粒，分别转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，筛选出阳性克隆并送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序鉴定。
[0057]
将测序正确的阳性菌摇菌扩繁，按照e.z.n.a.tm plassmid kit质粒提取试剂盒说明书提取质粒dna，采用核酸浓度测定仪测定洗脱出的质粒dna浓度。
[0058]
2.fastv、fpv和fecov三重pcr的建立及条件优化
[0059]
将提取的fpv、fastv和fecov质粒dna稀释到相同的数量级后，分别取20μl混匀，作为三重pcr的模板，并对反应体系进行引物终浓度和退火温度的优化。
[0060]
引物浓度优化的pcr总反应体系为25μl：fastv、fpv和fecov混合模板dna 1.5μl，2
×
taq pcr master mix 12.5μl，fastv、fpv和fecov三对引物按比例混合，终浓度见表2，并用ddh2o补足反应体系。
[0061]
退火温度优化的总反应体系为25μl：fastv、fpv和fecov混合模板dna1.5μl；2
×
taq pcr master mix 12.5μl；以优化后的浓度条件添加上下游引物，最后以ddh2o补足反应体系。
[0062]
扩增程序为：95℃预变性2min，95℃30s，52℃30s，72℃30s，共35个循环，最后72℃延伸10min；扩增程序中退火温度分别设置为48℃、50℃、52℃、54℃、56℃和58℃共6个不同的梯度，并设置阴性对照。pcr扩增产物用1.2％的琼脂糖凝胶进行电泳鉴定。
[0063]
扩增结束后，取pcr产物8μl，于1.2％琼脂糖凝胶上进行电泳鉴定，以选出最佳引物浓度。
[0064]
表2三重pcr的引物浓度正交筛选
[0065][0066]
条件优化结果：
[0067]
三对引物均能扩增出相应的病毒靶基因，电泳结果和测序结果与参考基因相符，引物浓度优化试验结果见图1，退火温度优化试验结果见图2。
[0068]
通过对引物浓度和退火温度等条件的优化，最终确定三重pcr的25μl反应体系为：fastv、fpv和fecov的上、下游引物分别为0.5μl、0.4μl和0.6μl；2
×
taq mastermix 12.5μl；模板1.5μl；ddh2o 8μl，退火温度54℃。
[0069]
多重pcr分别扩增出fpv 468bp、fastv 320bp、fecov 664bp大小的目的片段、所有扩增的特异性目的片段均经测序验证。
[0070]
实施例3三重pcr方法的检验
[0071]
(1)特异性试验
[0072]
以优化的三重pcr方法对fastv/fpv/fecov的混合模板和fastv、fpv、fecov的单一模板以及fnov、frv、fcv、cpv和ccov的核酸为模板分别进行检测，以鉴定该方法的特异性。
[0073]
从图3结果可以看出，除fpv、fastv和fecov外，其它病原均不能扩增出相应条带，表明本发明方法建立的多重pcr方法具有良好的特异性。
[0074]
(2)敏感性试验
[0075]
将获得的三种质粒dna模板分别进行10倍梯度稀释，共计8个梯度，分别为1
×
100、1
×
101、1
×
102、1
×
103、1
×
104、1
×
105、1
×
106、1
×
107；各个稀释梯度分别取0.5μl dna混匀，作为三重pcr模板，用优化后的三重pcr进行扩增，以检测该方法的敏感性。
[0076]
从图4结果可以看出，本发明建立的多重pcr方法检测fpv、fastv和fecov的最低限分别为2.4pg/μl、7.1pg/μl和5.1pg/μl。
[0077]
(3)重复性试验
[0078]
应用建立的三重pcr方法对fastv/fpv/fecov混合核酸样本进行4个批次的重复试
验，以验证三重pcr的稳定性。
[0079]
建立的多重pcr方法对目标模板进行4个批次的重复检测，试验结果一致且稳定，表明该方法具有良好的可重复性。
[0080]
(4)临床应用
[0081]
应用建立的三重pcr方法对207份猫粪便样本进行fastv、fpv和fecov的检测，并与单重pcr检测结果进行比较。
[0082]
采用本发明建立的多重pcr方法和单一pcr方法对207份猫肛拭子样本进行病毒分子检测。
[0083]
多重pcr方法检测结果显示fastv检出率为24.15％(50/207)，其中腹泻猫的检出率为24.8％(35/141)略高于临床健康猫22.7％(15/66)；fpv的检出率为37.20％(77/207)，其中腹泻猫的检出率为48.9％(69/141)显著高于临床健康猫12.1％(8/66)；fecov检出率为15.46％(32/207)，其中腹泻猫的检出率为12.7％(20/141)低于临床健康猫18.2％(12/66)。部分临床样本扩增结果见图5。其中，fpv/fastv、fpv/fecov和fastv/fecov的混合感染率分别为9.18％(19/207)、6.28％(13/207)和6.28％(13/207)，fpv/fastv/fecov的三重混合感染较少见(2.42％，5/207)。检测结果与单一pcr结果符合度为100％，表明本发明方法能够快速的检测这三种病原。
[0084]
综上，本发明通过条件优化获得了特异性、敏感性和稳定性良好的三重pcr检测方法，对模板梯度稀释后得到的最低检测限为2.4～7.1pg/μl。通过临床样本的检测，验证了三重pcr与单重pcr的阳性检出一致，复核率100％，表明其重复性好。由于dna病毒和rna病毒在提取核酸过程及扩增中会存在差异，在建立检测方法时，通过正交试验对这3种病毒扩增的引物浓度、退火温度等条件进行反复筛选和优化，本发明建立的fpv、fastv和fecov三种病毒的三重pcr方法兼顾了各个引物的不同片段大小和错配重组情况，以及在反应体系中不同病毒的扩增效率，为相关病原的临床检测提供了一种快速准确的方法。
[0085]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。