用于诊断年龄相关性黄斑变性的复合生物标志物及其用途的制作方法

1.本发明涉及用于诊断年龄相关性黄斑变性(agerelatedmaculardegeneration，amd)的复合生物标志物及其用途，更详细地，涉及由对于年龄相关性黄斑变性诊断特异性的两种以上的血液生物标志物组成来提高诊断性能的用于诊断年龄相关性黄斑变性的复合生物标志物。并且，本发明涉及利用上述复合生物标志物的用于诊断年龄相关性黄斑变性的组合物、诊断试剂盒及诊断年龄相关性黄斑变性所需的信息提供方法。
背景技术：
：：2.年龄相关性黄斑变性是主要在50岁以上的成人中发病的在视网膜的中心部即黄斑(macular)发生各种变化来引起的疾病，与糖尿病视网膜病变及青光眼一同为眼科三大失明疾病之一。在发达国家，它是成人失明的主要原因，发病率随着年龄的增长而增加。根据韩国国民健康营养调查，在韩国年龄相关性黄斑变性的患病率中，韩国人中的60岁～69岁人口中有11.7％、70岁以上人口中有18％罹患年龄相关性黄斑变性。黄斑是指视网膜神经组织的中心部位，对光刺激作出反应的感光细胞密集来负责中央视觉。将由于黄斑感光细胞随年龄增长而消失来引起视力受损的疾病称为年龄相关性黄斑变性。年龄相关性黄斑变性为影响视网膜、视网膜色素上皮(rpe)、布鲁赫膜(bruch'smembrane)、脉络膜的退行性疾病。3.年龄相关性黄斑变性可分为干性或非渗出性(dry)形态和湿性或渗出性(exudative)形态。非渗出性形态是指在视网膜中发生诸如药物(drugen)或视网膜色素上皮萎缩等病变的情况。其通常不会导致严重的视力丧失，但可以发展成湿性形态。渗出性形态是指脉络膜新生血管在视网膜下生长的情况。这些新血管会导致黄斑渗出和出血等，损害感光细胞，从而降低中央视觉，若不治疗，则大部分导致0.1以下的法定失明。渗出性形态的黄斑变性的进展速度非常快，在数周之内视力快速恶化的情况较多。在年龄相关性黄斑变性中，一旦视力受损，则无法恢复以前的情况较多，因此，早期发现非常重要。通过眼科医生的定期眼科检查可以及早发现，通过包括眼底检查的眼科检查，若怀疑为年龄相关性黄斑变性，则可进行荧光素血管造影和光学相干断层扫描等的眼科精密检查来确诊。4.因此，本发明人发现了一种灵敏度及特异性高的血液蛋白质生物标志物，并试图复合利用其来提高年龄相关性黄斑变性早期诊断能力，结果确认了包含igfbp2(胰岛素样生长因子结合蛋白2(insulinlikegrowthfactorbindingprotein2))、adamtsl2(adamts样蛋白2(adamts‑likeprotein2))、lgals3bp(半乳糖凝集素3结合蛋白(galectin3bindingprotein))及cfh(补充因子h(complementfactorh))的复合生物标志物的年龄相关性黄斑变性诊断效率优秀，从而完成了本发明。技术实现要素：5.技术问题6.本发明的目的在于，提供包含对于年龄相关性黄斑变性诊断特异性的血液生物标志物的用于诊断年龄相关性黄斑变性的复合生物标志物。7.本发明的再一目的在于，提供利用上述用于诊断年龄相关性黄斑变性的复合生物标志物的用于诊断年龄相关性黄斑变性的组合物或诊断试剂盒。8.本发明的另一目的在于，提供利用上述用于诊断年龄相关性黄斑变性的复合生物标志物的诊断年龄相关性黄斑变性所需的信息提供方法。9.技术方案10.为了实现上述目的，本发明提供用于诊断年龄相关性黄斑变性的复合生物标志物，其包含igfbp2(胰岛素样生长因子结合蛋白2)、adamtsl2(adamts样蛋白2)、lgals3bp(半乳糖凝集素3结合蛋白)以及cfh(补充因子h)。11.在本发明的一优选实施例中，上述复合生物标志物还可包含选自由cp(铜蓝蛋白(ceruloplasmin))、ddi2(蛋白质ddi1同源物2(proteinddi1homolog2))、fcn2(纤维蛋白胶2(ficolin2))、mbl2(甘露糖结合蛋白c(mannose‑bindingproteinc))、pnlip(胰腺三酰甘油脂肪酶(pancreatictriacylglycerollipase))、sele(e‑选择素(e‑selectin))、siglec14(唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素14(sialicacid‑bindingig‑likelectin14))、thbs1(血小板反应蛋白‑1(thrombospondin‑1))及zg16b(酶原颗粒蛋白16同源物b(zymogengranuleprotein16homologb))组成的组中的一种以上的生物标志物。12.并且，本发明提供用于诊断年龄相关性黄斑变性的组合物，其包含用于测量用于诊断年龄相关性黄斑变性的复合生物标志物的信使核糖核酸(mrna)或蛋白质水平的制剂，上述用于诊断年龄相关性黄斑变性的复合生物标志物包含igfbp2(胰岛素样生长因子结合蛋白2)、adamtsl2(adamts样蛋白2)、lgals3bp(半乳糖凝集素3结合蛋白)以及cfh(补充因子h)。13.在本发明的一优选实施例中，上述复合生物标志物还可包含选自由cp(铜蓝蛋白)、ddi2(蛋白质ddi1同源物2)、fcn2(纤维蛋白胶2)、mbl2(甘露糖结合蛋白c)、pnlip(胰腺三酰甘油脂肪酶)、sele(e‑选择素)、siglec14(唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素14)、thbs1(血小板反应蛋白‑1)及zg16b(酶原颗粒蛋白16同源物b)组成的组中的一种以上的生物标志物。14.在本发明的再一优选实施例中，用于测量上述复合生物标志物的信使核糖核酸水平的制剂可以为与上述生物标志物的基因特异性结合的引物对、探针或反义核苷酸。15.在本发明的另一优选实施例中，用于测量上述复合生物标志物的蛋白质水平的制剂还可包含与上述蛋白质或肽片段特异性结合的抗体、相互作用蛋白、配体、纳米粒子(nanoparticles)或适配体(aptamer)。16.并且，本发明提供包含上述用于诊断年龄相关性黄斑变性的组合物的用于诊断年龄相关性黄斑变性的试剂盒。17.在本发明的一优选实施例中，上述试剂盒可以为逆转录聚合酶链反应(rt‑pcr，reversetranscriptionpolymerasechainreaction)试剂盒、脱氧核糖核酸(dna)芯片试剂盒、酶联免疫吸附测定(elisa，enzymelinkedimmunosorbentassay)试剂盒、蛋白芯片试剂盒、快速(rapid)试剂盒或多反应监测(mrm，multiplereactionmonitoring)试剂盒。18.并且，本发明提供用于诊断年龄相关性黄斑变性的信息提供方法，其包括：步骤(a)，利用患者的生物学试样测量包含igfbp2(胰岛素样生长因子结合蛋白2)、adamtsl2(adamts样蛋白2)、lgals3bp(半乳糖凝集素3结合蛋白)及cfh(补充因子h)的用于诊断年龄相关性黄斑变性的复合生物标志物的信使核糖核酸或蛋白质水平；以及步骤(b)，与对照组试样比较上述信使核糖核酸或蛋白质表达水平。19.在本发明的一优选实施例中，上述复合生物标志物还可包含选自由cp(铜蓝蛋白)、ddi2(蛋白质ddi1同源物2)、fcn2(纤维蛋白胶2)、mbl2(甘露糖结合蛋白c)、pnlip(胰腺三酰甘油脂肪酶)、sele(e‑选择素)、siglec14(唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素14)、thbs1(血小板反应蛋白‑1)及zg16b(酶原颗粒蛋白16同源物b)组成的组中的一种以上的生物标志物。20.在本发明的再一优选实施例中，上述用于诊断年龄相关性黄斑变性的信息提供方法还可包含选自由患者的年龄、身体质量指数(bmi，bodymassindex)、是否患有高血压、是否患有高血脂、是否吸烟及是否患有心血管疾病组成的组中的一种以上的临床信息来与对照组进行比较。21.在本发明的另一优选实施例中，上述用于诊断年龄相关性黄斑变性的信息提供方法还可包括如下的步骤，即，若复合生物标志物的基因表达水平或蛋白质表达水平与对照组相比增加，则判断为年龄相关性黄斑变性。22.在本发明的还有一优选实施例中，上述信使核糖核酸表达水平测量可利用逆转录酶聚合酶反应、竞争性逆转录酶聚合酶反应、实时逆转录酶聚合酶反应、rna酶保护分析法、诺瑟杂交或脱氧核糖核酸芯片来执行。23.在本发明的又一优选实施例中，上述蛋白质表达水平测量可利用多反应监测(multiplereactionmonitoring，mrm)、平行反应监测(parallelreactionmonitoring，prm)、连续窗口数据独立获取总高分辨率(sequentialwindoweddataindependentacquisitionofthetotalhigh‑resolution，swath)、选择反应监测(selectedreactionmonitoring，srm)或免疫多反应监测(immunomultiplereactionmonitoring，imrm)来执行。24.在本发明的又一优选实施例中，上述步骤(b)的分析可通过统计学分析方法执行。25.在本发明的又一优选实施例中，上述统计学分析方法可选自由线性或非线性回归分析方法、线性或非线性分类(classification)分析方法、逻辑回归分析方法(logisticregression)、方差分析(analysisofvariance，anova)、神经网络分析方法、遗传分析方法、支持向量机分析方法、层次分析或聚类分析方法、使用决策树的层次算法或核主成分(kernelprincipalcomponent)分析方法、马尔可夫毯(markovblanket)分析方法、回归特征消除(recursivefeatureelimination)或基于熵的回归特征消除分析方法、前向浮动搜索(floatingsearch)或后向浮动搜索(floatingsearch)分析方法及它们的组合组成的组中。26.发明的效果27.在本发明的用于诊断年龄相关性黄斑变性的复合生物标志物中，不仅确认了灵敏度及诊断性能与其他生物标志物的组合相比更优秀，还确认了若结合复合生物标志物的蛋白质定量值与基础临床信息来进行分析，则在早期及晚期黄斑变性两个阶段均示出高诊断能力。并且，本发明的复合生物标志物可利用患者血浆简单分析，而不是利用血液蛋白质进motifs)样蛋白亚家族的成员，是与细胞表面和细胞外基质结合的糖蛋白。adamtsl2与潜在转化生长因子β结合蛋白1(ltbp1，latenttransforminggrowthfactorbetabindingprotein1)相互作用，ltbp1蛋白参与作为调节细胞的生长及分裂的重要生长因子的tgf‑β1的储存，因此，adamtsl2调节tgf‑β1的可用性。并且，adamtsl2在癌组织中表达，因此用作用于诊断癌症的生物标志物。40.在本发明中，优选地，上述adamtsl2可包含seqidno:1的氨基酸序列，但还可以包含与seqidno:1的氨基酸序列相同90％以上、93％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列。41.cp(铜蓝蛋白)为在血液中运输铜的主要蛋白质，在铁代谢中起到重要作用。在健康的人的血浆中，约95％以上的铜以铜蓝蛋白(ceruloplasmin)形态存在。42.在本发明中，优选地，上述cp可包含seqidno:2的氨基酸序列，但还可以包含与seqidno:3的氨基酸序列相同90％以上、93％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列。43.cfh(补充因子h)为调节补体激活来在维持免疫反应时起到重要作用的糖蛋白。与细胞表面的相同糖链结构结合来起到防止补体激活及扩增的补体抑制剂作用。44.在本发明中，优选地，上述cfh可包含seqidno:3的氨基酸序列，但还可以包含与seqidno:3的氨基酸序列相同90％以上、93％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列。45.ddi2(蛋白质ddi1同源物2)为内部肽裂解酶，激活参与细胞生长及脱氧核糖核酸复制调节的核呼吸因子1(nrf1，nuclearrespiratoryfactor1)来补偿蛋白酶体异常引起的蛋白质降解(degradation)。46.在本发明中，优选地，上述ddi2可包含seqidno:4的氨基酸序列，但还可以包含与seqidno:4的氨基酸序列相同90％以上、93％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列。47.fcn2(纤维蛋白胶2)为一种寡聚凝集素，由短的n末端部分‑胶原(collagen)样结构域和纤维蛋白原(fibrinogen)样结构域组成。主要在肝中表达，与细菌细胞壁的n‑乙酰氨基葡萄糖(n‑acetylglucosamin)结合来起到如甘露糖结合(mannosebinding)蛋白的调理素(opsonin)作用，以在补体系统的凝集素途径中起重要作用而周知。48.在本发明中，优选地，上述fcn2可包含seqidno:5的氨基酸序列，但还可以包含与seqidno:5的氨基酸序列相同90％以上、93％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列。49.igfbp2(胰岛素样生长因子结合蛋白2)与胰岛素样生长因子(insulinlikegrowthfactor，igf)结合来调节细胞内各种过程，由此调节血管生成(angiogenesis)。并且，在各种癌症(前列腺癌及乳腺癌等)中促进癌细胞的生长而周知。50.在本发明中，优选地，上述igfbp2可包含seqidno:6的氨基酸序列，但还可以包含与seqidno:6的氨基酸序列相同90％以上、93％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列。51.lgals3bp(半乳糖凝集素3结合蛋白)为被lgals3bp基因编码的蛋白质，与mac‑2(人巨噬细胞相关凝集素(humanmacrophage‑associatedlectin))及半乳糖凝集素1(galectin1)特异性结合。lgals3bp以在癌症患者及感染人类免疫缺陷病毒(hiv)的患者血清中增加而周知，参与关于自然杀伤(nk，naturalkiller)细胞及淋巴因子激活杀伤(lak，lymphokine‑activatedkiller)细胞毒性的免疫反应。52.在本发明中，优选地，上述lgals3b可包含seqidno:7的氨基酸序列，但还可以包含与seqidno:7的氨基酸序列相同90％以上、93％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列。53.mbl2(甘露糖结合蛋白c)还称为甘露糖结合凝集素(mannose‑bindinglectin，mbl)或甘露聚糖结合蛋白(mannan‑bindingprotein，mbp)。mbl2具有寡聚结构(400kda～700kda)，由包含由约30kda组成的3个相同肽链的亚基组成。通过对于感染的反应，在肝中生成，属于称为急性期蛋白的诸多因素中的一部分。54.在本发明中，优选地，上述mbl2可包含seqidno:8的氨基酸序列，但还可以包含与seqidno:8的氨基酸序列相同90％以上、93％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列。55.pnlip(胰腺三酰甘油脂肪酶)为水解甘油三酯的酯键的脂肪分解酶家族，是在胰腺分泌的酶。pnlip通过胰管系统分泌到十二指肠，因此，以血清内浓度低而周知，若如胰腺炎或胰腺癌等胰腺功能极度紊乱，则包括pnlip的胰腺酶分泌到血清中，因此，以通过测量pnlip血清浓度来诊断急性胰腺炎而周知。56.在本发明中，优选地，上述pnlip可包含seqidno:9的氨基酸序列，还可以包含与seqidno:9的氨基酸序列相同90％以上、93％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列。57.sele(e‑选择素)还以cd62抗原样家族成员e(cd62e，cd62antigen‑likefamilymembere)、内皮‑白细胞粘附分子1(elam‑1，endothelial‑leukocyteadhesionmolecule1)或白细胞‑内皮细胞粘附分子2(lecam2，leukocyte‑endothelialcelladhesionmolecule2)周知，是在白细胞介素1β、肿瘤坏死因子、脂多糖类激活的血管内皮细胞以4小时至12小时为峰值一同表达、诱导的细胞粘附分子。sele在炎症组织内的血管内皮细胞中强烈表达，介导中性粒细胞和单核细胞在血管内皮细胞上的滚动现象，从而促进这些细胞向炎症部位浸润。还参与癌细胞与血管内皮细胞粘附而周知。58.在本发明中，优选地，上述sele可包含seqidno:10的氨基酸序列，但还可以包含与seqidno:10的氨基酸序列相同90％以上、93％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列。59.siglec14(唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素14)为siglec(唾液酸结合免疫球蛋白型凝集素(sialicacid‑bindingimmunoglobulin‑typelectins))的亚家族之一，siglec为与唾液酸结合的细胞表面蛋白，主要在免疫细胞的表面中表达。siglec与唾液酸的蛋白质相互作用起到打开或关闭免疫系统的开关作用，癌细胞也以利用siglec‑唾液酸反应来获取免疫反应的抵抗性而周知。60.在本发明中，优选地，上述siglec14可包含seqidno:11的氨基酸序列，但还可以包含与seqidno:11的氨基酸序列相同90％以上、93％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列。61.thbs1(血小板反应蛋白‑1)为血小板反应蛋白家族(thrombospondinfamily)之一，是抑制心血管生成和肿瘤生成的糖蛋白。以与纤溶酶原(plasminogen)、尿激酶(urokinase)、基质金属蛋白酶(mmp)、凝血酶(thrombin)及组织蛋白酶(cathepsin)等的与血管生成相关的蛋白酶结合来调节内皮细胞的粘附、迁移、生长而周知。62.在本发明中，优选地，上述thbs1可包含seqidno:12的氨基酸序列，但还可以包含与seqidno:12的氨基酸序列相同90％以上、93％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列。63.zg16b(酶原颗粒蛋白16同源物b)为胰腺癌上调因子(pauf，pancreaticadenocarcinomaupregulatedfactor)，以与碳水化合物结合并激活内部上皮细胞、血管生成及通透性(permeability)而周知。64.在本发明中，优选地，上述zg16b可包含seqidno:13的氨基酸序列，但还可以包含与seqidno:13的氨基酸序列相同90％以上、93％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列。65.但是，没有可将上述生物标志物用于诊断年龄相关性黄斑变性的现有技术，尤其，完全没有可利用igfbp2、adamtsl2、lgals3bp及cfh复合生物标志物来提高年龄相关性黄斑变性的诊断性能的技术。66.在再一方面，本发明涉及用于诊断年龄相关性黄斑变性的组合物，其包含用于测量用于诊断年龄相关性黄斑变性的复合生物标志物的信使核糖核酸或者蛋白质水平的制剂，上述用于诊断年龄相关性黄斑变性的复合生物标志物包含igfbp2(胰岛素样生长因子结合蛋白2)、adamtsl2(adamts样蛋白2)、lgals3bp(半乳糖凝集素3结合蛋白)以及cfh(补充因子h)。67.本发明的特征在于，上述复合生物标志物还包含选自由cp(铜蓝蛋白)、ddi2(蛋白质ddi1同源物2)、fcn2(纤维蛋白胶2)、lgals3bp(半乳糖凝集素3结合蛋白)、mbl2(甘露糖结合蛋白c)、pnlip(胰腺三酰甘油脂肪酶)、sele(e‑选择素)、siglec14(唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素14)、thbs1(血小板反应蛋白‑1)及zg16b(酶原颗粒蛋白16同源物b)组成的组中的一种以上的生物标志物。68.本发明的特征在于，用于测量上述复合生物标志物的信使核糖核酸水平的制剂为与上述生物标志物的基因特异性结合的引物对、探针或反义核苷酸，上述基因的核酸信息在genebank等周知，因此普通技术人员可基于上述序列设计这些引物对、探针或反义核苷酸。69.在本发明中使用的术语“测量信使核糖核酸表达水平”是指为了诊断年龄相关性黄斑变性，在从年龄相关性黄斑变性怀疑患者分离的生物学试样中确认用于诊断年龄相关性黄斑变性的基因的信使核糖核酸存在与否和表达程度的过程，用于测量信使核糖核酸的量。用于其的分析方法具有逆转录酶聚合酶反应、竞争性逆转录酶聚合酶反应(competitivert‑pcr)、实时逆转录酶聚合酶反应(real‑timert‑pcr)、rna酶保护分析法(rpa，rnaseprotectionassay)、诺瑟杂交(northernblotting)、脱氧核糖核酸芯片等，但并不局限于此。70.在本发明中使用的术语“引物”为识别靶基因序列的片段，包括正向及反向的引物对，优选地，为提供具有特异性及灵敏度的分析结果的引物对。引物的核酸序列为与存在于试样中的非靶序列不一致的序列，当其为仅扩增包含互补引物结合位点的靶基因序列且不lcetal.,nature,355(6360):5646,1992；hoppe‑seylerfandbutzk,jmolmed.,78(8):42630,2000；cohenbaetal.,procnatlacadsciusa.,95(24):142727,1998)中详细公开。78.在另一方面，本发明涉及包含上述用于诊断年龄相关性黄斑变性的组合物的用于诊断年龄相关性黄斑变性的试剂盒。79.上述试剂盒可通过本领域周知的常规制备方法制备。例如，上述试剂盒可包含冻干形态的抗体和缓冲液、稳定剂、失活蛋白质等。80.上述试剂盒还可包含可检测的生物标志物。术语“可检测的生物标志物”是指在没有生物标志物的同一类分子中特异性检测包含生物标志物的原子或分子。上述可检测的生物标志物可粘附在上述蛋白质或与其片段特异性结合的抗体、相互作用蛋白、配体、纳米粒子或适配体。上述可检测的生物标志物可包括放射性物质(radionuclide)、荧光团(fluorophore)、酶(enzyme)。81.上述试剂盒可根据本领域周知的各种免疫分析法或免疫染色法利用。上述免疫分析法或免疫染色法可包括放射免疫测定、放射免疫沉淀、免疫沉淀、酶联免疫吸附测定、捕获‑酶联免疫吸附测定、抑制或竞争测定、夹心测定、流式细胞术、免疫荧光染色及免疫亲和纯化。优选地，上述试剂盒可以为逆转录聚合酶链反应试剂盒、脱氧核糖核酸芯片试剂盒、酶联免疫吸附测定试剂盒、蛋白芯片试剂盒、快速试剂盒或多反应监测。82.并且，上述试剂盒可用于质谱分析。在此情况下，上述蛋白质的特定氨基酸残基可具有肉豆蔻酰基化(myristoylation)、异戊二烯化、异戊烯化、糖基磷脂酰肌醇化(glypiation)、脂酰化(lipoylation)、酰化、烷基化、甲基化、脱甲基化、酰胺化、泛素化、磷酸化、脱酰胺化、糖基化、氧化或乙酰化等的修饰。83.在还有一方面，本发明涉及用于诊断年龄相关性黄斑变性的信息提供方法，其包括：步骤(a)，利用患者的生物学试样测量包含igfbp2(胰岛素样生长因子结合蛋白2)、adamtsl2(adamts样蛋白2)、lgals3bp(半乳糖凝集素3结合蛋白)及cfh(补充因子h)的用于诊断年龄相关性黄斑变性的复合生物标志物的信使核糖核酸或蛋白质水平；以及步骤(b)，与对照组试样比较上述信使核糖核酸或蛋白质表达水平。84.本发明的特征在于，上述步骤(a)的复合生物标志物还包含选自由cp(铜蓝蛋白)、ddi2(蛋白质ddi1同源物2)、fcn2(纤维蛋白胶2)、lgals3bp(半乳糖凝集素3结合蛋白)、mbl2(甘露糖结合蛋白c)、pnlip(胰腺三酰甘油脂肪酶)、sele(e‑选择素)、siglec14(唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素14)、thbs1(血小板反应蛋白‑1)及zg16b(酶原颗粒蛋白16同源物b)组成的组中的一种以上的生物标志物。85.在上述方法中，“生物学试样(biologicalsample)”是指由于年龄相关性黄斑变性的发病而使蛋白质表达水平或基因表达水平具有差异的组织、细胞、血液、血清、血浆、唾液、脑脊液或尿液等试样等，优选为血液、血浆、血清。86.上述用于诊断年龄相关性黄斑变性的信息提供方法还包含选自由患者的年龄、身体质量指数、是否患有高血压、是否患有高血脂是否吸烟及是否患有心血管疾病组成的组中的一种以上的临床信息。87.并且，用于诊断年龄相关性黄斑变性的信息提供方法还可包括如下的步骤，即，若复合生物标志物的基因表达水平或蛋白质表达水平与对照组相比增加，则判断为年龄相关性黄斑变性。88.上述步骤(a)的信使核糖核酸表达水平测量可利用与上述复合生物标志物的基因特异性结合的引物对、探针或反义核苷酸来测量及比较。89.上述信使核糖核酸表达水平测量或比较分析方法可使用逆转录酶聚合酶反应、竞争性逆转录酶聚合酶反应、实时逆转录酶聚合酶反应、rna酶保护分析法、诺瑟杂交或脱氧核糖核酸芯片等，但本发明并不局限于此。可通过上述测量方法确认正常对照组中的信使核糖核酸表达量和年龄相关性黄斑变性患者的信使核糖核酸表达量，可通过比较它们的表达量来诊断或预测年龄相关性黄斑变性是否发病。90.上述步骤(a)的蛋白质表达水平测量可利用与蛋白质或肽片段特异性结合的抗体、相互作用蛋白、配体、纳米粒子或适配体来测量及比较。91.上述蛋白质表达水平测量或比较分析方法具有蛋白质芯片分析、免疫测定、配体结合测定、基质解吸/电离飞行时间质谱(maldi‑tof，matrixdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry)分析、表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱(selditof，sulfaceenhancedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry)分析、放射免疫分析、放射免疫扩散、奥克特洛尼免疫扩散(ouchterlonyimmunodiffusion)、火箭免疫电泳、组织免疫染色、补体固定分析、二维电泳分析、液相色谱‑质谱(liquidchromatography‑massspectrometry，lc‑ms)、液相色谱‑质谱/质谱(lcms/ms，liquidchromatography‑massspectrometry/massspectrometry)、蛋白质印迹及酶联免疫吸附测定(elisa，enzymelinkedimmunosorbentassay)等，但并不局限于此。92.更优选地，在本发明中，还可利用多反应监测、平行反应监测、连续窗口数据独立获取总高分辨率、选择反应监测或免疫多反应监测来测量。93.上述多反应监测为如下的方法：确定物质的精确片段，在质谱仪将其破碎后，再次从破碎的离子中选择特定离子，并利用连续连接的检测器获取数量。当利用多反应监测方法时，在正常个体、怀疑年龄相关性黄斑变性的个体的血液试样中可利用质谱仪定量相应蛋白质或其片段。94.在上述步骤(b)的分析中，为了提高诊断的准确率，可通过使用统计学方法或算法来分析，可利用选自由线性或非线性回归分析方法、线性或非线性分类分析方法、逻辑回归分析方法、方差分析、神经网络分析方法、遗传分析方法、支持向量机分析方法、层次分析或聚类分析方法、使用决策树的层次算法或核主成分分析方法、马尔可夫毯分析方法、回归特征消除或基于熵的回归特征消除分析方法、前向浮动搜索或后向浮动搜索分析方法及它们的组合组成的组中的分析方法。在本发明中，作为上述统计学方法，优选使用逻辑回归分析方法，但并不局限于此。95.本发明的一具体实例中，为了定量分析血浆蛋白质组学中的用于诊断年龄相关性黄斑变性的生物标志物，分析了184个血浆试样(表1)，利用多反应监测分析由igfbp2(胰岛素样生长因子结合蛋白2)、adamtsl2(adamts样蛋白2)、cfh(补充因子h)、cp(铜蓝蛋白)、ddi2(蛋白质ddi1同源物2)、fcn2(纤维蛋白胶2)、lgals3bp(半乳糖凝集素3结合蛋白)、mbl2(甘露糖结合蛋白c)、pnlip(胰腺三酰甘油脂肪酶)、sele(e‑选择素)、siglec14(唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素14)、thbs1(血小板反应蛋白‑1)及zg16b(酶原颗粒蛋白16同源物b)组成的13个生物标志物。如表2所示，为了定量分析，筛选对于各个生物标志物的肽，并利用sis执行多反应监测质谱定量(mrm‑ms)分析。96.在本发明的具体再一实例中，当结合复合生物标志物组结果与临床信息时，为了确认诊断能力提高效果，利用逻辑回归模型输入生物标志物表达量转换信息及临床信息转换数值来推测分类为年龄相关性黄斑变性的概率。如表3所示，基于临床信息 igfbp2 adamtsl2 lgals3bp cfh，一一添加对于cp、ddi2、fcn2、lgals3bp、mbl2、siglec14、sele、pnlip、thbs1及zg16b的表达程度并分析的结果，确认了随着生物标志物的数量的增加，年龄相关性黄斑变性的诊断能力提高。97.并且，如图1至图3及表4所示，利用逻辑回归模型结合对于上述13个生物标志物的蛋白质定量值与基础临床信息来进行统计处理的结果，确认了对于正常组和黄斑变性(第一阶段(stage1)，auc＝0.840)、正常组和早期年龄相关性黄斑变性(第二阶段(stage2)，auc＝0.810)及正常组和晚期年龄相关性黄斑变性(第三阶段(stage3)，auc＝0.859)的诊断能力优秀。98.在本发明的具体另一实例中，确认了诊断性能是否根据生物标志物的组合示出差异。如图2所示，确认了13个靶中的igfbp2、adamtsl2、lgals3bp及cfh的组合(组合1，auc＝0.783)具有与其他9个蛋白质cp、ddi2、fcn2、mbl2、siglec14、sele、siglec14、pnlip、thbs1及zg16b组合(组合2，auc＝0.624)相比具有更高的诊断能力。99.以下，通过实施例更加详细地说明本发明。100.这些实施例仅用于例示本发明，不应解释为本发明的范围局限于这些实施例，这对本
技术领域：
：的普通技术人员而言是显而易见的。101.实施例1：选择年龄相关性黄斑变性患者及采集血浆102.获得盆唐首尔大学医院的临床试验审查委员会的批准来采集年龄相关性黄斑变性患者的血浆试样。为了生物标志物的定量检测，利用血浆蛋白质组学分析了共184个血浆试样，在下述表1示出作为分析对象的正常组(nonamd)及年龄相关性黄斑变性(amd)疾病组的临床特征。103.表1104.试样临床信息[0105][0106]实施例2：选择肽及利用多反应监测质谱定量分析肽[0107]2‑1：选择肽及设计合成肽[0108]在本发明中，作为用于诊断年龄相关性黄斑变性的生物标志物，筛选了如下的13个：igfbp2(胰岛素样生长因子结合蛋白2)、adamtsl2(adamts样蛋白2)、cfh(补充因子h)、cp(铜蓝蛋白)、ddi2(蛋白质ddi1同源物2)、fcn2(纤维蛋白胶2)、lgals3bp(半乳糖凝集素3结合蛋白)、mbl2(甘露糖结合蛋白c)、pnlip(胰腺三酰甘油脂肪酶)、sele(e‑选择素)、siglec14(唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素14)、thbs1(血小板反应蛋白‑1)及zg16b(酶原颗粒蛋白16同源物b)。[0109]为了对于上述生物标志物进行多反应监测分析，选择对于13个生物标志物的蛋白质特异性的具有荷质比(m/z)的代表性肽(q1)，在通过电击破坏该肽来产生的碎片离子(fragmentationion)中，选择强度最高的离子(q3)。[0110]测量每个蛋白质的灵敏度高的一种以上的肽，基于此注入至质谱仪来获得每个转换的破碎能量优化值，基于强度选择了3个以上的顶级碎片离子(表2)。[0111]表2[0112]13个生物标志物的顶级碎片离子[0113][0114]为了确认定量，利用了与13个蛋白质相对应的稳定同位素标记标准(sis，stable‑isotopelabeledstandard)肽，利用通过校准确认线性的实验来确定加标重肽(spikedheavypeptide)的浓度。sis肽为将肽c‑末端的赖氨酸(lys，k)或精氨酸(arg，r)氨基酸中的12c和14n取代为13c和15n的肽。这与血液中存在的内源性肽(endogenouspeptide)具有质量值的差异，但具有相同的序列，因此，肽疏水性(hydrophobicity)相同，由此在层析谱上以相同的保留时间(retentiontime，rt)洗脱。[0115]2‑2：预处理血浆试样及多反应监测质谱定量分析[0116]直接使用在上述实施例1中获取的各个血浆，或者为了更精确的蛋白质定量，实施去除以高丰度(highabundant)存在的14种蛋白质(白蛋白(albumin)、免疫球蛋白g(igg)、抗胰蛋白酶(antitrypsin)、免疫球蛋白a(iga)、转铁蛋白(transferrin)、触珠蛋白(haptoglobin)、纤维蛋白原(fibrinogen)、α2‑巨球蛋白(alpha2‑macroglobulin)、α1‑酸性糖蛋白(alpha1‑acidglycoprotein)、免疫球蛋白m(igm)、载脂蛋白ai(apolipoproteinai)、载脂蛋白aii(apolipoproteinaii)、补体c3(complementc3)、运甲状腺素蛋白(transthyretin))的消耗过程(depletion)。当执行消耗时，按照制造公司的方法利用高丰度蛋白质分离系统(mars，multipleaffinityremovalsystem，agilent，美国)柱来去除14种蛋白质，洗脱剩余少量存在的蛋白质来用于分析。向该洗脱的耗损试样添加尿素(urea)以成为8m，之后，添加2‑羰基乙基三膦(tris(2‑carboxyethyl)‑phosphine，tecp)以成为80mm，并添加2‑氯乙酰胺(2‑chloroacetamide)以成为320mm，在25℃的温度下反应1小时来将二硫键还原及烷基化。对其，加入水稻酶来使血浆蛋白与水稻(wako)酶的质量比成为100∶1，并在室温条件下反应4小时。之后，利用50mm的tris(ph8.0)溶液稀释10倍，并添加能够进行测序的水平的胰蛋白酶(promega)来使蛋白质与胰蛋白酶的质量比成为50∶1，在37℃的温度下反应12小时以上来分解为肽片段。添加甲酸(formicacid)溶液以成为0.3％，将ph值酸化至2.0以下，并停止胰蛋白酶反应。[0117]在此，进行脱盐，通过在上述实施例2‑1中确定的内部标准物质(sis肽)添加(spiking)重标记(heavy‑labeled)肽，由此进行多反应监测分析。与nanoultra2dplus(eksigent)结合，利用作为三重四极杆质谱仪的qtarp5500(sciex)设备以预定多反应监测(scheduledmrm)模式监测各选择蛋白质的转换。[0118]具体地，使用5500伏的离子电压，并将q1(四极杆1(quadruple1))和q3(四极杆3(quadruple3))中的分辨率设定为一个单元(unit)。将转换设置为使得总循环时间为1.5秒。使用20个单元(unit)的雾化气体(nebulizinggas)，将加热器的温度设置为350℃。为了校正批次(batch)之间的变异，向每个试样加入内部标准物质，并同时监测。[0119]2‑3：数据分析[0120]利用skyline(mccosslab，universityofwashington，美国)处理原始数据(rawdata)来计算转换的峰值面积。对于内部标准物质肽(内源性/重标记肽(endogenous/heavylabeledpeptide))使用峰值面积来比较相对浓度。利用由此测量的结果值生成t‑检验(t‑test)及接受者操作特征下的面积(auroc，areaunderthereceiveroperatingcharacteristic)数值，来测量各蛋白肽的疾病预测力(predictiveability)，为了确认结合复合生物标志物组结果与临床信息的预测力，利用逻辑回归分析(logisticregression)模型输入上述表达量转换信息及上述表1的临床信息转换程度，由此推测分类为年龄相关性黄斑变性的概率。使用medcalver17.1(medcalc)来执行所有统计分析。[0121]在上述临床信息反映通过门诊确保的通过身高和体重计算的身体质量指数、是否吸烟、是否患有高血脂、是否患有高血压、是否患有心血管疾病。其中，使用存在或不存在的信息转换为是＝1、否＝0(禁烟＝0.5)来反映。[0122]实施例3：确认根据结合复合生物标志物组结果与临床信息的诊断能力的提高[0123]在本发明中，当结合13个复合生物标志物组结果与临床信息时，为了确认诊断能力的提高效果，利用逻辑回归模型输入生物标志物表达量转换信息及临床信息转换程度，由此推测分类为年龄相关性黄斑变性的概率。[0124]表3[0125]确认根据复合生物标志物结合数的年龄相关性黄斑变性诊断性能[0126][0127]1.临床信息，2.igfbp2，3.adamtsl2，4.lgals3bp，5.cfh，6.thbs1，7.siglec14，8.cp，9.sele，10.ddi2，11.mbl2，12.pnlip，13.zg16b，14.fcn2[0128]表4[0129]确认根据结合复合生物标志物组与临床信息的诊断能力[0130][0131]c：临床信息，p：蛋白质定量信息，com：临床信息及蛋白质定量信息的整合，auc：曲线下面积(areaunderthecurve)，se：标准误差(standarderror)(delongetal.，1988)，95％ci：95％的置信区间(confidenceinterval)[0132]如表3所示，基于临床信息 igfbp2 lgals3bp adamtsl2 cfh，一一添加对于cp、ddi2、fcn2、mbl2、siglec14、sele、siglec14、pnlip、thbs1及zg16b的定量值来分析的结果，确认了随着生物标志物的数的增加，年龄相关性黄斑变性的诊断能力(auc)提高。[0133]并且，如图1至图3及表4所示，利用逻辑回归模型结合对于上述13个生物标志物的蛋白质定量值与基础临床信息来进行统计处理的结果，确认了对于正常组和黄斑变性(nonamdvsamd)的诊断能力(auc＝0.840，图1)、正常组和早期黄斑变性(nonamdvsearlyamd)的诊断能力(auc＝0.810，图2)及正常组和晚期黄斑变性(nonamdvslateamd，图3)的诊断能力(auc＝0.859)均优秀。[0134]实施例4：确认根据生物标志物的组合的年龄相关性黄斑变性诊断性能[0135]在本发明中，确认了年龄相关性黄斑变性的诊断性能是否根据13个生物标志物的组合存在差异。在13个生物标志物中，分为igfbp2、lgals3bp、adamtsl2及cfh组合和cp、ddi2、fcn2、mbl2、sele、siglec14、thbs1及zg16b组合来执行分析，与上述实施例3的stage1相同地，与临床信息一同执行分析。[0136]如图4所示，在13个生物标志物中，确认了igfbp2、lgals3bp、adamtsl2及cfh(组合1，auc＝0.778)与其他9个蛋白质即cp、ddi2、fcn2、mbl2、sele、siglec14、thbs1及zg16b组合(组合2，auc＝0.624)相比示出更高的诊断能力。[0137]产业上的可利用性[0138]在本发明中提供的用于诊断年龄相关性黄斑变性的复合生物标志物的灵敏度及诊断性能与其他生物标志物的组合相比更优秀，若结合复合生物标志物的蛋白质定量值与基础临床信息来进行分析，则在早期及晚期黄斑变性两个阶段中均示出高诊断能力，因此可有用地用于年龄相关性黄斑变性早期诊断。当前第1页12当前第1页12