一种高通量单个免疫细胞表面受体核酸序列检测方法与流程

1.本发明涉及单细胞分析领域，具体涉及一种高通量单个免疫细胞表面受体核酸序列检测方法。


背景技术：

2.获得性免疫系统由b淋巴细胞和t淋巴细胞组成，其细胞表面均有负责特异性识别及结合抗原的分子，分别称为b细胞受体（bcrs）和t细胞受体( tcrs)。t细胞受体、b细胞受体和分泌型抗体的多样性构成复杂免疫系统的核心，并作为保护身体免受入侵病毒、细菌和其他物质的关键防御成分。tcr由异二聚体αβ链（~95％，tra，trb）或γδ链（~5％）组成，而bcr由两条重链（igh）和两条轻链（igk或igl）组装而成。在结构上，每条链可分为可变结构域和恒定结构域。由于可变结构域上v（d）j基因重排以及种系核苷酸的随机缺失，tcr和bcr谱呈巨大的多样性。在人类中，从理论上估计tcr
‑
αβ受体的多样性在胸腺中超过10
18
，tcr的多样性直接决定了tcr的抗原结合特异性。考虑到体细胞突变，b细胞受体的多样性甚至更大。
3.近年来，由于测序技术的发展，高通量测序（如rna
‑
seq）已被用于解析免疫受体多样性，并转化应用于疫苗接种、癌症和自身免疫疾病。但是，传统rna
‑
seq检测到的是组织样本或细胞群的平均表达量，这使得细胞之间的差异有可能被平均值所掩盖，并且不能具体描述构成免疫反应的淋巴细胞或克隆型的多样性。因此，建立在单细胞层面检测tcr、bcr多样性的方法，对于推动免疫受体应用于临床早期诊断 、疗效评估、预后判断显得尤为重要。
4.目前，已有一些用于检测单细胞免疫受体的方法和试剂，如clontech的smarter human sctcr a/b profiling kit试剂盒可以对tcr进行检测、10x genomics推出的chromium single cell v(d)j reagent kits试剂盒搭配配套仪器可以通过水油液滴包埋实现大量细胞的免疫受体序列的富集。但是上述的试剂或是检测通量小、不能同时检测bcr或转录本，或是对于一些类型的组织样本存在油滴包裹不完全的问题，且检测成本均比较高昂。急需开发一款检测成本低、高通量的检测单个免疫细胞表面受体核酸序列方法来实现对大量细胞的免疫受体序列的富集。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种高通量单个免疫细胞表面受体核酸序列检测方法。该方法所用的主要试剂价格低廉，不需要特殊的仪器设备，可在普通实验室中进行大通量的单个免疫细胞表面受体核酸序列检测，一次实验可以检测500~10000个细胞，且无样本偏好性。
6.为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：本发明提供了一种高通量单个免疫细胞表面受体核酸序列检测方法，所述方法包括如下步骤： （1）将pbmc细胞悬液台盼蓝染色后加至微流控芯片，通过微孔分离单个细胞，使
每个孔中得到一个细胞；（2）将能够捕获rna的磁珠注入微流控芯片中，使pbmc细胞和磁珠在同一个微孔中；（3）向微流控芯片中注入细胞裂解液，使细胞裂解释放出rna，释放出的rna被磁珠捕获；（4）捕获完成后，取出带有rna的磁珠，用反转录试剂进行反转录，合成cdna第一链；（5）反转录完成后的产物进行pcr富集tcr/bcr。
7.进一步地，步骤（1）中所述pbmc悬液的细胞浓度为1~2
×
10
5 cells/ml，细胞活性大于85%。
8.步骤（1）中所述微流控芯片的微孔数为1000~50000个。
9.步骤（2）中所述同一个微孔为每个微孔中同时含有一个pbmc细胞和一个能捕获rna引物的条形码的磁珠。
10.步骤（3）中所述细胞裂解液的组成成分中含有1 m ~2m tris
‑
hcl 5μl，0.5 m~1m licl 10 μl，10%~15%triton 0.5μl，5~10mm edta 2μl，5mm dtt 5μl，dnase/rnase
‑
free water 72.5μl，dntp mix 5μl。
11.优选地，所述的细胞裂解液的组成成分为：每100 μl的细胞裂解液中含有2m tris
‑
hcl 5μl，0.5m licl 10 μl，10%triton 0.5μl，10mm edta 2μl，5mm dtt 5μl，dnase/rnase
‑
free water 72.5μl，dntp mix 5μl。
12.步骤（4）中所述的反转录为在芯片中加入一定量的rt
‑
master mix体系，fc
‑
40氟化液油封后将芯片放置于烘箱中。
13.进一步地，所述烘箱的温度为40~45℃，时间为2~3h。
14.进一步地，所述的rt
‑
master mix体系中，每100 μl的rt
‑
master mix体系包含有2 x master mix 50μl、dtt 10μl、oligo dt 2.5μl、rt inibitor 2.5μl、enzymatic rt酶 10μl、dnase/rnase
‑
free water 25μl。
15.进一步地，本发明还提供了一种细胞裂解液，每100 μl 细胞裂解液中含有1 m ~2m tris
‑
hcl 5μl，0.5 m~1m licl 10 μl，10%~15%triton 0.5μl，5~10mm edta 2μl，5mm dtt 5μl，dnase/rnase
‑
free water 72.5μl，dntp mix 5μl。
16.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供一种低成本、简便的高通量单个免疫细胞表面受体核酸序列检测方法。本发明利用泊松分布原理使每个单细胞分配一个捕获磁珠，通过链特异性pcr可以完成单细胞tcr的富集，可有效提高细胞检测的通量，一次实验可以检测500
‑
10000个细胞，且无样本偏好性，具有较高的准确率。本发明所提供的检测方法中使用的主要试剂均为常用分子细胞生物学试剂，耗材中的微流控芯片以及捕获磁珠价廉易得，有效降低检测成本；整个检测操作过程简单，无需特殊仪器设备，具有很强的实用性。
附图说明
17.图1是反转录的流程图；图2是cdna的流程图；
图3是tcr富集的全流程示意图；图4是tcr富集的产物条带分布峰图；图5是第二轮富集后的主要测序指标图。
具体实施方式
18.以下将结合说明书附图及具体实施方式，对本发明的技术方案及优点做出更加详细的解释和说明。应当理解的是，说明书、具体实施方式及说明书附图中所呈现的内容，仅仅为了更加清楚地说明本发明的技术方案及其优点，并不对本发明的保护范围构成限制。
19.试剂耗材：微流控芯片、磁珠均购自于新格元南京生物科技有限公司。
20.实施例1本实施例中基于微流控芯片进行外周血pbmc中t细胞单个免疫细胞表面受体核酸序列的检测。具体步骤如下：（1）取200μl 0.02%磷酸盐吐温缓冲液（pbst）加至微流控芯片（以下简称为芯片）内，在芯片两边圆形孔洞中加入适量的0.02%pbst缓冲液；芯片用真空泵抽真空15min后取出，室温静置15min后用200μl pbs缓冲液冲洗芯片两次，待用；（2）pbmc中提取t细胞，台盼蓝染色后，用血球计数仪或细胞计数仪测定细胞活力并进行计数，培养pbmc细胞浓度至1~2
×
105个/ml，活性达85%以上时将细胞匀速缓慢装载至芯片上，每张芯片装载100μl细胞，保证芯片的每个视野中有40~60个细胞，装载完细胞后静置5min；用200μlpbs缓冲液冲洗芯片两次，在显微镜下随机选取芯片三个视野计数；（3）取磁珠用200μlpbs冲洗磁珠（beads）3次，加入100μl pbs重悬，每张芯片装载50μl（约5万beads/芯片），匀速缓慢装载磁珠至芯片中，加入50μlpbs缓冲液推进芯片内磁珠2~3次至磁珠铺满整张芯片，使pbmc细胞和磁珠在同一个微孔中；显微镜下观察磁珠铺满芯片或达90%以上，用200μl pbs冲洗芯片两次；（4）在每张芯片中加入97.5μl细胞裂解液和2.5μl的rt抑制剂（rt inhibitor），在室温静置15min，待细胞充分裂解；用200μl 1x rt buffer冲洗芯片1次；每100 μl细胞裂解液的组成成分中含有2m tris
‑
hcl 5μl、0.5m licl 10μl、10%triton 0.5μl、10mm edta 2μl、5mm dtt 5μl、dnase/rnase
‑
free water 72.5μl、dntp mix 5μl。
21.（5）反转录：配置rt
‑
master mix体系并充分混匀，加100μl rt
‑
master mix体系至芯片中；在芯片两边的圆形孔洞里滴入适量的fc
‑
40氟化液油封，将芯片放置烘箱中40~45℃反应2~3h。
22.每100 μl的rt
‑
master mix组成成分中含有2 x master mix 50μl、dtt 10μl、oligo dt 2.5μl、rt inibitor 2.5μl、enzymatic rt酶 10μl、dnase/rnase
‑
free water 25μl。
23.（6）pcr 反应：拆除芯片，取出芯片内pdms，放置在7ml 6 x ssc缓冲液中充分震荡，适当超声离心，取出至少95%以上的磁珠；将取出的磁珠放置在磁力架上，用0.5%te
‑
sds溶液，0.01%te
‑
tween各冲洗一次，nfw冲洗两次；每张芯片加300μl配置好的pcr mix，并分装成6管，每管50μl；放入pcr仪进行反应；pcr程序为：95 3min、98℃ 20s、65℃ 45s、72℃3min、goto step 2，3x、98℃ 20s、67℃ 20s，72℃ 3min，goto step 6，9x、72℃ 5min、4℃
保存。
24.每50 μl pcr mix的组成成分中含有5x hifi with mgcl buffer 10μl、10mm dntp mix1.5μl、hifi hotstart 1μl、磁珠扩增引物0.4 μl、dnase/rnase
‑
free water37.1 μl。
25.（7）纯化：将分装成6管的pcr产物合并，并在产物中加入40μl磁珠，混匀室温孵育5min，简单离心后磁力架上静置2min，弃上清，用200μl的新鲜80%酒精清洗2遍，晾干；加20μl的nfw溶解，孵育5min，简单离心，磁力架上静置2min，吸取20μl上清液至干净的离心管，检测产物浓度。
26.（8）另根据寡核苷酸序列上的通用引物结合位点和tcr可变区的序列设计引物，通过链特异性pcr实现单细胞tcr的富集。取10ng步骤（7）中的纯化产物作为模板，配置50μl一轮富集pcr体系并混匀，放入pcr仪进行反应；pcr程序为：95℃ 15min，94℃ 30s，62℃ 1min30s，goto step 2，10x，72℃ 1min30s，72℃ 10min，4℃ 保存；pcr仪热盖温度为105℃。
27.50μl一轮富集pcr体系组成成分中包括：25μl mp master mix、4.44μl tcr r1 primer、1.5μl t1 primer、10ng扩增产物cdna和nuclease
‑
free water。
28.（9）纯化：并在产物中加入40μl磁珠（0.8
×
产物体积），混匀室温孵育5min，简单离心后磁力架上静置2min，弃上清，用200μl的新鲜80%酒精清洗2遍，晾干；加20μl的nfw溶解，孵育5min，简单离心，磁力架上静置2min，吸取20μl上清液至干净的离心管，检测产物浓度。
29.（10）取 10
µ
l 第一轮富集产物作为模板，配置50
µ
l二轮富集pcr体系并混匀，放入pcr仪进行反应，pcr程序为：95℃ 15min，94℃ 30s，64℃ 1min30s，goto step 2，10x，72℃ 1min30s，72℃ 10min，4℃ 保存；pcr仪热盖温度为105℃。
30.50
µ
l二轮富集pcr体系组成成分中包括：25
µ
l mp master mix、3
µ
ltcr r2 primer、1.5
µ
lt2 primer、10
µ
l一轮富集扩增产物和10.5
µ
lnuclease
‑
free water。
31.（11）纯化：在产物中加入40μl磁珠（0.8
×
产物体积），混匀室温孵育5min，简单离心后磁力架上静置2min，弃上清，用200μl的新鲜80%酒精清洗2遍，晾干；加20μl的nfw溶解，孵育5min，简单离心，磁力架上静置2min，吸取20μl上清液至干净的离心管，检测产物浓度。
32.（12）富集文库构建：取20ng纯化产物作为模板，配置50
µ
l文库构建pcr体系并混匀，放入pcr仪进行反应；pcr程序为：95℃ 3min，98℃ 20s，64℃ 30s，goto step 2，8x，72℃ 1min，72℃ 5min，4℃保存；pcr仪热盖温度为105℃。
33.50
µ
l文库构建pcr体系组成成分中包括：10
µ
l al buffer，1.5
µ
ldntp mix7.5
µ
lal primer mix，20ng第二轮富集产物，1
µ
lgexscope
®ꢀ
al enzyme和 nuclease
‑
free water。
34.图1是反转录的流程图；图2是cdna的流程图；图3是tcr富集的全流程示意图；图4是tcr富集的产物条带分布峰图；由附图1~4可见，从细胞悬液制备到通过微流控芯片完成单个细胞的分离，cell barcoding bead捕获细胞内的mrna，并给每个细胞加上分子标签，一链合成完成后，一部分cdna用于构建转录组文库，另一部分cdna用于富集免疫受体序列。经过链特异性扩增之后，tcr的条带分布在900
‑
1100bp。
35.实施例2上述实施例1中的tcr各轮富集及文库产物浓度测定分别为：第一轮富集的产物浓
度为2ng/
µ
l；第二轮富集的产物浓度为2.32ng/
µ
l；文库产物浓度为37.2ng/
µ
l。下面展示的是该测试各项评估指标情况：表1. 第二轮富集后各项测序指标对照表测序指标数值readsmappedtoanyvdjgene：vdj比对到参考序列99.11%estimatednumberofcells：t细胞数717cellwithconfidentcd3：含有cdr3的t细胞占比100.00�llwithtraandtrb：tra和trb配对的t细胞数82.57%mdiantraumispercell：含有tra的细胞的中值umi数16mdiantrbumispercell：含有trb的细胞的中值umi数25图5是第二轮富集后的主要测序指标图；显示为评估免疫受体（tcr）富集的富集效率的各项重要指标。如表1及图5所示，第二轮富集后各指标均达较优水平。
36.应当理解，以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。