遗传性骨病的基因突变位点及其应用的制作方法

1.本发明涉及疾病诊断和筛查领域，具体地说，涉及新的遗传性骨病基因突变位点及其应用。
背景技术：
：：2.遗传性骨病是指由遗传物质改变而导致骨骼畸形的一类遗传性疾病，具有广泛临床和遗传异质性。遗传性骨病虽然罕见，但致畸率、致残率高。其确诊依赖于致病基因突变检测，及早确诊有助于治疗方案的选择和开展遗传咨询、干预等。新的致病基因或致病位点的成功鉴定，有利于提高临床确诊率，开展产前分子诊断等于预，进而改善预后和降低遗传性骨病的发病率。3.多指(趾)属于遗传性骨病之一，是一种最常见的先天重复性四肢畸形，表现为一个或多个指(趾)全部或部分的重复发生。据估计，多指(趾)在人群中的发生率为5‰～19‰。它常被分为综合征型和独立发生的非综合征型两大类。非综合征型根据多指(趾)发生部位不同分为轴前型(额外指在拇指侧)、中央型(额外指在食指、中指和环指侧)和轴后型(额外指在小指侧)。非综合征型多指(趾)的遗传方式多为常染色体显性遗传，也有报道为常染色体隐性遗传。从目前的研究结果来看，多个基因的突变均可引起非综合征型多指(趾)畸形这一表型。现已确定位于7p13的gli3基因突变、位于2q31的hoxd13基因突变可导致多指(趾)并(趾)畸形。还有家系的致多指(趾)畸形基因被分别定位于7q36、13q21‑q32和19p13.1‑p13.2等区域。专利文献也报道了一些非综合征型多指(趾)的致病基因和位点。如专利文献cn108251519a，公开日2018.07.06，公开了lmbr1基因第5个内含子的zrs区中c.446t→a导致轴前多指/趾i型。4.到目前为止，虽然对多指(趾)致病基因的研究和鉴定取得了一定的进展，但是发现更多的致病基因和突变位点对于该疾病的早诊、早治来说仍然是十分必要的。技术实现要素：5.本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供非综合征型多指(趾)的新的治病突变。6.第一方面，本发明提供了一种特异性检测受试者基因组dna中是否存在以下一种或几种突变的试剂在制备非综合征型多指(趾)诊断试剂盒或患病风险评估试剂盒中的应用：7.1)gli3c.714t>a；8.2)gli3c.739c>t；9.3)gli3c.2844g>a；10.4)gli3c.1486c>t；11.5)prezrschr7:156585336a>g；12.6)prezrschr7:156585421c>a；13.7)prezrschr7:156585247g>c；14.8)prezrschr7:156585420a>c。15.作为本发明的一种优选实施方式，所述试剂选自：引物、引物对、探针、抗体和核酸芯片中的一种或几种。16.第二方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有特异性检测受试者基因组dna中是否存在如上所述突变的试剂。17.第三方面，本发明提供了所述试剂盒的用途，选自：1)在制备诊断或辅助诊断非综合征型多指(趾)的产品中的应用；2)在制备筛查或辅助筛查非综合征型多指(趾)的产品中的应用；3)在制备预测非综合征型多指(趾)患病风险的产品中的应用；4)在制备检测与非综合征型多指(趾)相关的基因是否突变的产品中的应用；5)在制备检测与非综合征型多指(趾)相关的蛋白质是否突变的产品中的应用。18.第四方面，本发明提供了一种探针组合物，其包含特异性结合至目标基因的探针，所述探针至少能检测一种如上所述的突变。19.作为本发明的一种具体实施方式，所述探针组合物以混合物形式提供，或者以独立存在的形式提供。20.第五方面，本发明提供了一种基因捕获芯片，其包括固相载体和固定在固相载体上的探针的点阵，所述探针至少能检测一种如上所述的突变。21.本文中，所述“gli3”基因的序列参见http://genome.ucsc.edu/cgi‑bin/hgc？hgsid＝1125108795_vepafdvgoogz9txnndagrzg9ev8u&g＝htccdnaali&i＝nm_000168.6&c＝chr7&l＝42000546&r＝42276808&o＝42000546&alitable＝ncbirefseqpsl。gli3蛋白质氨基酸序列的ncbi登录号为np_000159.3。附图说明22.图1：(a)一个复杂指骨异常家系的谱系图。正方形和圆形分别表示男性和女性，黑色实心形状表示患者；箭头表示先证者；标有*的成员是本研究的参与者；(b)先证者临床表型(v‑1)；(c)患者临床表型(iii‑2)；(d)患者临床表型(iv‑2)。23.图2：在gli3中检测到新的单核苷酸无义突变。a.gli3分子结构及其产物在外显子6上点突变c.714t>a，导致在第238位氨基酸终止编码。b.gli3点突变区域pcr产物的sanger测序图。自上而下：人类参考序列，然后是三个多指(趾)畸形患者(v‑i，iv‑2，iii‑2)的pcr序列，具有相同的突变c.714t>a。24.图3：多指(趾)畸形家系患者的临床特征和家系信息。(a)一个多指(趾)畸形复杂家系的谱系图。正方形和圆形表示男性和女性，实心形状表示多指(趾)畸形患者。标记有斜线符号表示人已去世。箭头表示先证者。标有*的成员是本研究的参与者。(b)先证者的临床特征(ⅳ‑1)显示双边ⅰ型大脚趾轴前多趾畸形，右脚脚趾外侧多趾，左脚脚趾内侧多趾。(c)先证者父亲(iii‑2)术后第3、4脚趾并趾及双手第1、2指并指并有孔的不完全并指(趾)。双边ⅰ型大脚趾轴前多趾畸形在大脚趾外多趾，双足第1、2、3、4趾并趾畸形。(d)先证者奶奶的临床特征(ⅱ‑2)右手轴后多指畸形，双手第3、4指间并指，且不完全并指畸形，双手第1、2并指间有孔，双侧ⅰ型大脚趾轴前多趾畸形，双脚大脚趾内有额外的脚趾。25.图4：全外显子测序实验获得的snvs信息。(a)单个核苷酸变异(snv)的基因组位置分布。(b)单个核苷酸变异(snv)的功能分类。26.图5：非综合征多指(趾)畸形家系成员中发现新的致病突变gli3c.739c>t。(a)gli3及其产物在外显子6中的结构为c.739c>t，其终止密码子位于247位。突变区pcr产物的sanger测序。自上而下：人类gli3参考基因序列，家系中具有c.739c>t突变的三个多指(趾)畸形患者(iv‑i，iii‑2，ii‑2)和一个正常成员(iii‑1)的pcr测序结果。(b)人gli3部分氨基酸序列与其他灵长类动物的比较。带阴影的氨基酸表示不同灵长类物种的保守残基。箭头表示人类gli3中氨基酸保守区的突变。物种缩写如下：hs，人；gg，大猩猩；pa，苏门答腊猩猩；mm，猕猴；pt，黑猩猩。ncbi相应蛋白质编号：hs，np_000159.3；gg，xp_0040‑45386.1；pa，xp_009241116.1；mm，xp_001098108.1；pt,np_001029362.1。(c)核质分析gli3野生型和突变型的表达蛋白在细胞核和细胞质中的表达情况。27.图6：phs、gcp和非综合征多指(趾)畸形致病突变在gli3蛋白结构图上的分布(ta/cbp：反式激活和cbp结合区，ta1：反式激活域1，ta2：反式激活域2)。28.图7：新的gli3c.739c>t突变阻断了shh通路信号传导。(a)hek293t细胞中gli3野生型和突变型的western印迹分析。gli3野生型、q247*突变型的表达载体瞬时转染hek293t细胞。48h后制备全细胞裂解液，westernblotting检测结果。(b)gli3野生型(wt)、gli3q247*突变型的hek293t细胞中shh信号通路中关键蛋白的表达水平。(c)核质分离检测发现gli3突变型蛋白在细胞质中积聚。(d)免疫沉淀(ip)和(e)western印迹分析检测gli3野生型和突变型蛋白与sufu互作。29.图8：sanger测序检测非综合征多指(趾)畸形患者shh基因突变(箭头：shhc.869g>a/g)。30.图9：sanger测序检测非综合征多指(趾)畸形患者gli3基因突变(箭头：scmc‑333gli3‑c.2844g>a；scmc‑567(gli3‑c.1486c>t)。31.图10：sanger测序检测非综合征多指(趾)畸形症患者prezrs基因突变的研究。具体实施方式32.下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。33.实施例1非综合征型多指(趾)畸形家系中gli3c.714t>a(p.y238*)无义致病突变34.1病例分析35.本研究征募一例包含5代的常染色体显性遗传多指(趾)家系。家系内患者均接受了检查，其中头围、头型、眶间距、身高、脚长与手指的长度均检查正常，排除了其他的先天性畸形，为非综合征型，表型为双侧轴前多指(趾)。患儿的父亲和奶奶都表现为轴前多指(趾)(图1)。通过对家族史进一步研究发现，该家系每一代都有患者产生，有些患者表型为大脚趾外多趾，且多趾与邻近脚趾不完全闭合，在之前的报道中未见该表型的报道。36.先证者进行了全外显子测序，并征募了21个散发病例作为对照。所有该项目参与人员，都签署了知情同意，采集血样。该项目通过了上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心伦理委员会批准。37.2dna准备38.依据dna提取标准操作，使用gentrapuregenekit(qiagen,germany)在全血中提取dna。核酸检测仪(nanodroptechnologies,wilmington,de,usa)、分光光度计和琼脂糖开始的变量数量(116，893)到“常见变异：<1％等位基因频率”(26325)到“预测有害：sift和polyphen‑2”(751)到“生物学背景：手指畸形”(6)。表1列出了候选的致病性变异。千人基因组项目和nhlbi外显子组测序项目的公开数据集也作为对照进行了分析。50.表1.21例变异体的染色体排列全外显子测序结果[0051][0052]7.2新的gli3无义突变[0053]我们在gli3基因中发现了一个新的杂合突变(c.714t>a，p.y238*，图2)，该突变很可能是基于表型和基因型的致病性变体。同时，通过sanger测序，在有/无分离轴前多指畸形家系的所有受试者中筛选并评估转录本nm000168.5外显子6中gli3的无义突变。如图2所示，sanger测序证实了外显子组测序结果，即该家系的先证者和其他患者表现出gli3无义突变c.714t>a(p.y238*)的杂合性，而其他成员没有携带该突变，进一步表明与该家系表型共分离为常染色体显性性状。[0054]7.3散发患者中sanger测序[0055]在21例散发的双侧多指(趾)畸形患者中，我们发现4例(4/21，19％)gli3基因突变(表2)。在这4个突变中，杂合突变[c.3855dupc(p.met1286hisfsx18)，c.4141dela(p.arg1381glyfsx38)，c.1927c>t(p.arg643x)，c.4694c>t(p.arg1537cys)]以前在1000个基因组中被报道或发现(http://browser.1000genomes.org/index.html)，蛋白质预测工具sift、polyphen‑2和突变等已预测这四种突变均为致病性突变gli3c.4694c>t(p.arg1537cys)的错义突变进一步揭示1537位的残基在种间高度保守，提示gli3基因在散发多指(趾)畸形的发病机制中起着关键作用。[0056]表2.21例散发的多指(趾)畸形异常症状[0057][0058]实施例2非综合征型多指(趾)畸形家系中gli3c.739c>t(p.q247*)无义致病突变[0059]1病例分析[0060]受试者接受检查排除其他先天畸形。测量头部形状、颌面部畸形、脑成像、内眦距离、瞳孔间距离、身高或肢体长度、生殖器、肛门和咽喉(会厌)以排除其他综合征。根据赫尔辛基宣言，本研究得到了上海儿童医学中心伦理委员会(scmcirb‑k2017008)的批准，研究者获得了受试者的书面知情同意(如有必要)。[0061]2全外显子测序[0062]使用truseq外显子组富集试剂盒(美国illumina)进行外显子组富集，然后通过2×使用hiseq2000测序系统进行100对末端测序(美国illumina)。序列读取由illuminaconsensusassessmentofsequenceandvariationv1.8软件、illuminaoff‑linebasecallerv1.8和illuminasequencycontrolv2.8产生。序列读取与人类参考基因组的burrows‑wheeler比对。通过基因组分析工具包(gatk)和varscan软件对突变进行鉴定。读取数据进行分析，匹配外显子区域，包括外显子‑内含子边界。以不同的方法筛选单核苷酸多态性(snps)和插入/缺失(indels)。[0063]3变异过滤[0064]国家生物技术信息中心dbsnp数据库最新版本中显示的所有变异都被排除在外，以及沉默突变。任何基因的低频移帧和截断突变都被认为是致病的。通过三种生物信息学工具(sift，http://sift.jcvi.org；polyphen‑2，http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/index.html；以及突变http://www.mutationtaster.org)。此外，蛋白质功能应与骨骼发育有关。[0065]4sanger验证[0066]上述候选变异体经sanger测序验证。聚合酶链反应(pcr)引物(forward：tgatgtgggttgtgtaatgg(seqidno:3)；reverse：aagggaaccagagcaccag(seqidno:4))是用primer3在线工具设计的(http://bioinfo.ut.ee/primer3‑0.4.0/primer3/)包括先证者中发现的gli3突变。对于每个片段，在25μl总体积中进行pcr，含有约4mg/l基因组dna，12.5μl2×gc缓冲液i、2.5mmol/lmgcl2、0.2mmol/ldntps、40u/mltaqdna聚合酶(中国大连takara)和0.4μ摩尔/升每对引物。pcr产物扩增35个周期：95℃、30秒；60℃、30秒；和72℃、50秒(eppendorf,hamburg,germany)。pcr产物然后在abi3130xl测序仪上进行dna测序(appliedbiosystems，fostercity，ca，usa)。[0067]5质粒构建[0068]通过去除lenticas9blast(addgene#52962)中的cas9，我们构建了一个多克隆位点的lenti‑cast载体。用flag或gfp标记的全长gli3cdna克隆到该载体中。gli3变异体是利用通过定点突变gli3野生型获得克隆，使用软件primerx(http://www.bioinformatics.orgprimerx)设计点突变的诱变引物，正向引物，5'‑tgctaactggctagccctatgcca‑3'(seqidno:5)，和反向引物，5'‑gggctgcgctagtcaggcca‑3'(seqidno:6)。根据说明，使用q5定点突变试剂盒(neb，e0554s)进行反应。通过对突变质粒dna克隆进行正、反义测序，验证了目的突变，排除了其它突变。[0069]6hek293t细胞转染[0070]hek293t细胞(从atcc获得)于37℃在dulbecco改良的eagle's中高糖 10％胎牛血清(gibco，lifetechnologies，inc.)中培养，在含5％二氧化碳的潮湿大气中。hek293t接种在直径100mm的培养皿(5×每皿105个细胞)，并在接下来的两天内以24小时的间隔收集转染有pmd2.g(addgene#12259)和pspax2(addgene#12260)的上述慢病毒质粒的hek293t细胞的病毒上清两次。[0071]7hek293t细胞中gli3/gli3‑c739t蛋白的亚细胞定位[0072]用核蛋白提取试剂盒和细胞质蛋白提取试剂盒分别提取核蛋白和细胞质蛋白，用bca蛋白检测试剂盒(北京市生物技术研究所)按说明书定量。[0073]8westernblotanalysis[0074]总细胞裂解液制备于1×sds缓冲液，sds‑page直接分析，转移到硝化纤维素膜上。在含有0.1％吐温‑20和5％牛血清白蛋白的tris缓冲盐水中封闭膜，然后与针对flag(sigma，inc.)的抗体一起培养；gli3，gli1，ptch1，shh(abcam)β‑肌动蛋白(杭州，中国)。抗原‑抗体复合物进行免疫染色，通过红外成像技术(bio‑radlaboratories，inc.)检测。本实验进行至少三次。[0075]9sufu、gli3、gli3‑t739免疫沉淀实验[0076]2个表达结构分别转染至hek293t细胞，培养48h。细胞接种于10cm培养皿，培养10小时。细胞用ripa缓冲液(beyotimeinstituteofbiotechnology，beijing，china)裂解30分钟。离心后收集的上清液用抗m2磁珠(sigma，inc.)孵育16小时，然后对洗涤3次的珠子进行如上所述的western印迹。[0077]10免疫荧光[0078]将含有融合蛋白(gli3或gli3‑c739t)的hek293t细胞接种约24小时后，用磷酸盐缓冲液(pbs)冲洗至少3次，pbs中4％多聚甲醛固定15min，pbs中0.3％tritonx‑100渗透15min，pbs中10％山羊血清封闭至少2h。用pbs洗涤两次后，用抗flag抗体(在pbs中稀释1:500，sigma)在4℃孵育细胞过夜，然后与二抗‑alexa488(在pbs中稀释1:500，lifetechnologies)孵育。细胞核用dapi染色，然后用免疫荧光显微镜(carl‑zeiss，jena，德国)和las‑af‑lite3.3.0软件观察细胞。[0079]11结果[0080]11.1多指症家系的临床评价[0081]一个来自中国上海的常染色体显性多指四代家系被纳入研究。根据家庭成员的陈述，这个家庭没有近亲婚姻史。先证者是一名来自中国上海的5岁女孩。头部对称，正常周长45.1厘米(参考范围：42.6‑47.8厘米)。该家系的家族史符合常染色体显性遗传模式。在我们的报告中，四分之三的患者接受了检查(图3)。在参与个体中观察到表型变异。先证者(ⅳ‑1)呈双侧型ⅰ大脚趾的轴前多趾，右脚脚趾外侧和左脚脚趾内侧多指。参与人ⅲ‑2临床表型为双侧ⅰ型大脚趾轴前多趾畸形，双足大脚趾外多趾畸形，双足第1、2、3、4指并指畸形。参与人ⅱ‑2的临床表型为，右手轴后多指畸形，双手第3、4指间并指，不完全并指畸形1、2指间有孔，双侧ⅰ型大脚趾轴前多趾畸形，双脚大脚趾内有额外的趾(图3b‑d和表3)。所有参与者头部对称，头围正常(男性参考范围：56.1‑59.2cm；女性参考范围：54.0‑56.9cm)。头部形态、颌面部畸形、脑显像、内眦距离、瞳孔间距、身高或肢体长度、生殖器器官、肛门和咽喉(会厌)未见异常，体格发育和智力发育未见异常。所以我们确定这个家族是非综合征性多指(趾)畸形。[0082]表3.4例患者相关信息[0083][0084]11.2全外显子测序鉴定的突变[0085]对先证者进行全外显子组测序，找出该家系潜在的致病基因突变。测序数据平均72.05m的读数，先证者96.87％的读数质控q值大于30(表4)。从整个外显子组测序中获得约133443个单核苷酸变异(snvs)，27044个snvs(20.26％)位于外显子区域(图4a)。突变包括移码缺失、移码插入、非移码缺失、非移码插入、非同义snv、无义突变、同义突变等(图4b)。通过omim注释、go分析、kegg通路分析、hgmd和生物信息学工具，一个新的无义突变gli3c.739c>t(p.q247*)被成功鉴定为该家系的致病基因突变。[0086]表4.变异分析筛选后的基因列表[0087]染色体位置类型基因转录本id转录变异体蛋白变异体基因类型314561629错义突变hoxd11nm_021192c.734g＞ap.g245d杂合突变742085095无义突变gli3nm_000168.5c.739c＞tpy247＊杂合突变2220779975插入scarf2nm_1533346c.2292dupgp.e765fs＊9杂合突变2220780032插入scarf2nm_1533346c.2234dupgp.r756fs＊28杂合突变x152864480插入fam58anm_001130997.2c.54dupgp.q19fs＊39杂合突变x152864515插入fam58anm_001130997.2c.17dupgp.g7fs＊51杂合突变[0088]11.3gli3c.739c＞t(p.q247*)突变的验证[0089]通过sanger测序筛选gli3c.739c＞t(p.q247*)突变的家族成员。如图5a所示，sanger测序显示该家系中只有先证者和其他患者携带杂合子gli3c.739c＞t(p.q247*)(图5a)。因此，此突变与家系中的多指(趾)畸形共分离，遵循显性遗传模式，外显率为3/3(100％)。氨基酸序列的比较显示gli3q247残基在不同的灵长类物种中是保守的(图5b)。基因不同区域的突变导致多指(趾)畸形的不同综合征，故非综合征性多指(趾)畸形相关的gli3突变的发病机制与基因特异性功能区无关(图5c)。[0090]11.4gli3p.q274*的功能研究[0091]为了探讨我们报告中检测到的gli3无义突变是否影响shh信号通路，我们构建了gli3‑wt和gli3‑c.739c＞t‑flag融合蛋白慢病毒质粒，分别瞬时转染hek293t细胞。westernblot分析显示q247*突变体比wt短(图7a)。截短蛋白降低了ptch1和gli1的表达，而shh的表达没有被破坏(图7b)。然后将野生型和突变型质粒分别转染hek293t细胞，观察p.q247*影响gli3的细胞内定位。首先，分离转染细胞的细胞质和细胞核蛋白。westemblot结果表明，野生型gli3在胞浆和细胞核中均有分布，而突变型gli3仅在胞浆中可见(图7c)。与此结果一致，免疫荧光结果显示野生型构建体广泛分布于细胞质和细胞核内，但gli3q274*的分布集中在细胞质中(图7d)。在shh信号传导过程中，融合抑制物(sufu)通过结合细胞质中的gli3蛋白并阻止它们到达细胞核发挥抑制作用。在我们的报告中，免疫沉淀(ip)和western印迹分析显示gli3q274*突变体不能与sufu结合(图7e)，表明gli3的截短蛋白破坏了sufu‑gli3调控。[0092]实施例3散发非综合征型多指(趾)畸形人群两个gli3突变(c.2844g＞a/m948i；c.1486c＞t/q496x)和四个prezrs突变(chr7：156585336a＞g；chr7：156585421c＞a；chr7：156585247g＞c；chr7：156585420a＞c)[0093]1病例准入[0094]该研究的纳入标准与先前报道的相同，受试者接受检查排除其他先天畸形。测量头部形状、颌面部畸形、脑成像、内眦距离、瞳孔间距离、身高或肢体长度、生殖器、肛门和咽喉(会厌)以排除其他综合征。根据赫尔辛基宣言，本研究得到了上海儿童医学中心伦理委员会(scmcirb‑k2017008)的批准，研究者获得了受试者的书面知情同意(如有必要)。[0095]在这项研究中，研究对象是从各种医学文献和挨家挨户调查中确定的。每例均由上海儿童医学中心放射科、儿童发育科、行为科、骨科等相应的检查科室进行体格检查，排除其他先天畸形。获得了几乎所有受影响个体的x射线照片。测量包括枕额(头)围、头型、瞳孔间距离、内眦距离、身高、足长和手指长度均正常。所有指标病例均采集血液。根据上海市儿童医疗中心病案信息系统的临床文献，收集非综合征性多指畸形患者的回顾性资料。病例分为6种多指型：轴前ⅰ型(拇指和/或大脚趾多指)；轴前ⅱ型(三指拇指多指)；轴前iii型(食指/第二脚趾多指)；轴前iv(交叉多指)；轴后a(尺骨/腓骨边缘形成良好的额外手指)；轴后b(尺/腓骨侧不完全非功能性额外指)。[0096]2基因组dna制备[0097]使用gentrapuregene试剂盒(德国qiagen)按照标准方案从患者和亲属的每个外周血样本中提取基因组dna。使用分光光度计(nanodroptechnologies，wilmington，de，usa)测量dna的纯度和浓度。用primer3设计扩增shh、gli3基因全编码区及其侧翼区、prezrs和zrs非编码区的pcr引物。[0098]3sanger测序[0099]shh(mim#600725)和gli3(mim#165240)的编码序列和prezrs和zrs区域的非编码序列(chr7:1565864‑15658727；ucsc基因组浏览器，http://genome.ucsc.edu；hg19版本；g.104811105583参考序列ac007097.4)，并通过sanger测序直接测序。利用primer3在线工具设计了覆盖候选基因或调控序列的整个编码区及其侧翼区域的聚合酶链反应(pcr)引物(http://bioinfo.ut.ee/primer3‑0.4.0/primer3/)。扩增反应体系为25μl，含100ngdna，2×gc缓冲液i，2mmolmgcl2，0.2mmol/ldntps，0.2μmol引物和1utaqdna聚合酶(takara,大连,中国)。扩增过程中，95℃变性30秒，60℃退火持续30秒，72℃延长50秒，共35个循环。最后，通过abi3130xl测序仪对pcr产物进行dna测序。[0100]4生物信息学分析[0101]利用polyphen(基因型多态性分析)服务器(http://coot.embl.de/polyphen/)和sift在线软件(http://blocks.fhcrc.org/sift/sift.html)预测氨基酸变化对蛋白质结构和功能的影响。ucsc(http://genome.ucsc.edu/)用于序列保守性的鉴定。[0102]5结果[0103]5.1临床特征[0104]在上海儿童医学中心对102例患儿进行了仔细的临床检查。所有患者的牙齿、指甲、出汗和听力均正常。在所有受累个体中均未观察到神经系统问题和筋膜畸形。多指畸形均为偶发性多指畸形。表5和表6中总结了详细的表型特征。[0105]表5.102例患者的多指(趾)的性别、偏侧性和对称性[0106][0107]表6.患者四肢畸形分布统计[0108][0109]5.2散发多指(趾)畸形患者中致病基因筛查[0110]sanger测序最初在23个扩增子(19个gli3和4个shh扩增子)上进行，这些扩增子覆盖这些基因的编码区，2.1千碱基(kb)区域包含102例非综合征多指(趾)畸形患者的zrs和前zrs。筛选到的dna变异与公共snp数据库中报告的dna变异进行了比较(表7)。[0111]为了评估一种罕见的变异是否具有潜在的危害性，我们考虑了(i)这种变化是否影响编码序列(cds)，(ii)对蛋白质结构/功能的影响，(iii)dna/蛋白质水平的保守性，(iv)生物信息预测。表8总结了根据生物信息学预测发现的变体/突变的功能后果(表8)。[0112]表7.筛选到的dna变异与公共snp数据库中报告的dna变异的比较[0113][0114]polyphen、sift与mutationt@ster均为治病风险的预测软件[0115]表8.根据生物信息学预测发现的变体/突变的功能后果[0116][0117]5.3shh(7q36；nc000007.12；nm000193；np：000184)[0118]在7.8％(8/102)的患者中发现一个外显子变异[rs104894047(c.869g/a，pgly290asp)]，有这种变化的8名患者均为非综合征性ⅰ型轴前多指(趾)患者(图8)。在dbsnp数据库中，rs104894047在非综合征性多指(趾)畸形患者中的频率高于西双版纳地区的中国人和北京地区的汉族人。在一例3型前脑无裂症(hpe)(一种可能由shh突变引起的疾病)患者中观察到g290d，并被认为影响shh蛋白的加工域(nanni等人，1999)。然而，g290d替代物：(i)被sift预测为可耐受的，并且可能被多酚和抗氧化剂破坏mutation；(ii)在dna或蛋白质水平上不保守；(iii)在健康个体中发现，我们倾向于认为g290d可能不会导致多指(趾)畸形。[0119]5.4gli3(7p13；nc000007.12；nm000168；np：000159)[0120]发现了两个gli3外显子变异，这在以前没有报道过。表7描述了这些基因中鉴定出的dna变异。生物信息学预测支持该位点的任何功能效应都可能存在损伤。两例gli3基因突变患者均为非综合征性ⅰ型轴前多指(趾)畸形(图9)。[0121]外显子变异m948i(c.2844g>a)：(a)polyphen,sift和mutation在线软件分析具有危害性；(b)在dna和蛋白质水平上不保守；(c)我们倾向于认为m948i可能对多指(趾)畸形有损害。[0122]外显子变异q496x(c.1486c＞t)是gli3基因第10外显子(转录本nm000168.5)中的一个新杂合突变，很可能是基于表型和基因型的致病性变体(图9)。[0123]5.5zrs和prezrs(chr7：156583564‑15658787；ucsc基因组查询软件；http：//genome.ucsc.edu；hg19；g.104811105583(参考序列ac007097.4)[0124]根据～800bpzrs在原始区域内的位置，未在其内发现突变(chr7：156583770‑156584570)(表9)。四种突变(chr7：156585787‑156585155；位于zrs上游585bp处的632bp区域(park等人，2008年)在轴前多指(趾)畸形患者中发现率为5.9％(6/102)(图10)。这些变异在dbsnp中没有发现(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)或者在1000个基因组项目数据库中(http：//www.1000genomes.org/)。其中两个位点在进化上是保守的。[0125]在所有散发病例中，两个健康的父母都排除了突变的存在，从而证实了他们在患者中的重新发生。dna测序可检测7.8％先证者(8/102)中gli3和prezrs的致病性变化。其余94例(92.2％，94/102)shh和zrs突变阴性。我们总共证实了6种不同的突变，在gli3基因中发现了2种可能的致病性改变(2.0％)，而在prezrs中发现了6种(5.9％)。这些变体在dbsnp中没有发现(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)或者在1000个基因组项目数据库中(http：//www.1000genomes.org/)。[0126]表9.突变情况[0127]编号样本标号突变位置(hg19)序列类型1scmc‑215a＞gchr7：156585336prezrs1型轴前多指(趾)2scmc‑224c＞achr7：156585421prezrs1型轴前多指(趾)3scmc‑236c＞achr7：156585421prezrs1型轴前多指(趾)4scmc‑384a＞gchr7：156585336prezrs1型轴前多指(趾)5scmc‑387g＞cchr7：156585247prezrs1型轴前多指(趾)6scmc‑404a＞cchr7：156585420prezrs1型轴前多指(趾)[0128]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
：的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。当前第1页12当前第1页12