一种NAMPT酶生产菌及其应用的制作方法

一种nampt酶生产菌及其应用
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种nampt酶生产菌及其应用。


背景技术：

2.尼克酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamide phosphoribosyl transferase，nampt)是nad补救合成通路的限速酶，具有促血管生长、抗细胞凋亡、参与机体炎症应答、促进多种细胞分化成熟等生理功能。是防治心脑血管疾病、癌症的新靶标。
3.利用原核表达系统对外源基因进行表达，具有周期短、成本低、操作简便以及表达量高等优点。目前已有利用原核表达系统生产nampt的报道，例如：王峰以pcdna3.1
‑
hnampt为模板，通过pcr扩增获得两端分别为bamh i和nde i酶切位点的hnampt片段，将该片段与pet
‑
11a( )表达型载体连接，获得重组表达载体，并转化至bl21star大肠杆菌，以iptg诱导蛋白表达，以镍柱和分子筛纯化目标蛋白，制备得到重组人hampt蛋白(“老年小鼠脑和血清nampt变化及重组人的nampt的制备和鉴定”，浙江大学硕士毕业论文)。吕小群以bl21
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condonplus(de3)
‑
ril为宿主菌，将nampt的pet28a 重组原核表达质粒导入到宿主菌中，经诱导表达和ni
‑
nta亲和层析纯化，得到nampt蛋白(“nampt/visfatin酶活性筛选模型的建立”，第二军医大学硕士学位论文)。
4.但通过上述原核表达系统生产nampt，nampt的表达量仍有待进一步提高。


技术实现要素：

5.针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种nampt酶生产菌及其应用。本发明将nampt酶的重组表达载体和parp1蛋白的重组表达载体导入到宿主菌中，获得了nampt酶生产菌，通过parp1蛋白的少量表达，显著提高了nampt酶的表达量和活性。
6.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.本发明的第一方面，提供一种nampt酶生产菌，所述nampt酶生产菌中含有表达nampt酶的重组表达载体和表达parp1蛋白的重组表达载体。
8.本发明的第二方面，提供上述nampt酶生产菌的构建方法，包括以下步骤：
9.将编码nampt的核苷酸片段连入质粒pllp
‑
ompa，获得第一重组表达载体；将编码parp1的核苷酸片段连入质粒pet
‑
42a( )，获得第二重组表达载体；再将获得的第一重组表达载体和第二重组表达载体导入到同一宿主菌中，构建得到nampt酶生产菌。
10.优选的，编码nampt的核苷酸片段的序列如seq id no.5所示。
11.优选的，编码parp1的核苷酸片段的序列如seq id no.6所示。
12.优选的，所述宿主菌为大肠杆菌b21(de3)。
13.本发明的第三方面，提供上述nampt酶生产菌在尼克酰胺磷酸核糖转移酶生产中的应用。
14.本发明的有益效果：
15.(1)本发明首次将nampt酶的重组表达载体和parp1蛋白的重组表达载体导入到同
一宿主菌中，通过parp1蛋白的少量表达，显著提高了nampt酶的表达量和活性；与单一nampt酶的原核表达系统相比，采用本发明的nampt酶生产菌，nampt酶的表达量提高了25％以上。
16.(2)为了使nampt酶和parp1蛋白的编码基因能够更适用于原核表达系统，本发明还对编码基因进行了密码子优化，采用优化后的编码基因进行原核表达，进一步提高了nampt酶的表达量。
附图说明
17.图1：优化前nampt酶编码基因的密码子相对适应度图。
18.图2：优化后nampt酶编码基因的密码子相对适应度图。
19.图3：优化前parp1蛋白编码基因的密码子相对适应度图。
20.图4：优化后arp1蛋白编码基因的密码子相对适应度图。
21.图5：实施例2构建的表达nampt酶的第一重组表达载体的酶切验证结果；图中，m1、m2为dna marker，泳道1和泳道3为bamhⅰ/nhelⅰ双酶切pllp
‑
ompa
‑
nampt，泳道2为pllp
‑
ompa
‑
nampt。
22.图6：实施例3构建的表达parp1蛋白的第二重组表达载体的酶切验证结果；图中，m为dna marker，泳道1为pet
‑
42a( )
‑
parp1，泳道2和泳道3为sacⅱ/sphⅰ双酶切pet
‑
42a( )
‑
parp1。
具体实施方式
23.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
24.正如背景技术部分所介绍的，nampt酶具有多种生理功能，具有广泛的需求。利用原核表达系统对外源基因进行表达，具有周期短、成本低、操作简便以及表达量高等优点。但现有原核表达系统生产nampt酶的表达量仍有待进一步的提高。
25.parp是参与聚腺苷二磷酸核糖(poly(adp
‑
ribose)，par)合成的酶，其包括18种亚型，parp1是parp的其中一种亚型，由长度为1014个氨基酸的单条肽链构成，可划分为3个区域，分别为n端dna结合域、自身修饰域和c端催化域。parp1主要参与dna损伤修复、作为细胞凋亡信号和参与基因转录调控。
26.本发明在研究nampt酶的原核表达时意外的发现，少量的parp1蛋白能够促进nampt酶的表达，由此发明人考虑在nampt酶原核表达系统中引入parp1蛋白编码基因。发明人首先尝试将parp1蛋白的编码基因和nampt酶的编码基因连接到同一表达载体上，但是，由于parp1蛋白的编码基因太长，将其和nampt酶的编码基因连接到同一表达载体上，会导致这两个基因的表达量都特别的差。因此，发明人又考虑将nampt酶的重组表达载体和parp1蛋白的重组表达载体导入到同一宿主菌中，但这样又面临至少以下两个问题：
27.一是如何选择表达nampt酶的载体和表达parp1蛋白的载体；
28.二是nampt酶和parp1蛋白在同一生产体系中表达后如何有效的分离。
29.本发明进一步研究发现，parp1蛋白的表达量会影响nampt酶的表达，parp1蛋白表
达量过高，会导致宿主菌的直接死亡；parp1蛋白表达量过低，则对nampt酶表达的促进作用不显著。而选择何种表达载体会直接影响nampt酶和parp1蛋白的表达。本发明从现有的原核表达载体中进行了筛选考察，最终选择质粒pllp
‑
ompa作为nampt酶的原核表达载体，选择质粒pet
‑
42a( )作为parp1蛋白的原核表达载体。在选择好质粒表达载体之后，为了使nampt酶和parp1蛋白的编码基因能够更适用于所选择的原核表达系统，本发明还对编码基因进行了密码子优化。
30.质粒pllp
‑
ompa和pet
‑
42a( )均为诱导表达型质粒，在不加诱导剂时不会表达nampt酶和parp1蛋白，这样就减少了菌种上来就表达parp1蛋白而导致直接自溶的风险；而且，选择质粒pet
‑
42a( )一方面能使parp1蛋白的表达量适中，既能有效促进nampt酶的表达，又能避免parp1蛋白表达过多导致菌体死亡；另一方面，质粒pet
‑
42a( )能使两个基因的诱导剂相同，也减少了操作步骤。
31.质粒pllp
‑
ompa采用e.coli强启动lpp和ompa分泌信号肽，同时在c端添加了6个his，本发明利用质粒pllp
‑
ompa来表达nampt酶，所表达的nampt酶加上原来nampt带的总共有8个his尾，通过his尾和镍离子亲和的原理，可以有效的将nampt酶和parp1蛋白分离。
32.因此，本发明有效解决了上述载体选择和蛋白分离的问题；而且通过parp1蛋白的少量表达，可以显著提高了nampt酶的表达量和活性。
33.需要说明的是，本发明nampt酶生产菌的构建方法，是本领域技术人员能够重复实施的方法，故无需对生产菌进行生物保藏。对于本发明构建nampt酶生产菌所用的材料以及所构建的nampt酶生产菌，申请人声明自申请日起20年内可向公众提供以用于重复验证本发明。
34.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本技术的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本技术的技术方案。
35.本发明实施例和对比例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
36.实施例1：密码子优化
37.发明人从现有数据库中获得的nampt酶的氨基酸序列如seq id no.1所示；nampt基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。parp1蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示；parp1基因的核苷酸序列如seq id no.4所示。
38.为了使nampt酶和parp1蛋白的编码基因能更好的适应于原核表达系统，本发明分别对nampt酶和parp1蛋白的编码基因进行了密码子优化。
39.经密码子优化后的nampt酶的编码基因的核苷酸序列如seq id no.5所示；优化前的密码子相对适应度图如图1所示；优化后的密码子相对适应度图如图2所示。
40.经密码子优化后的parp1蛋白的编码基因的核苷酸序列如seq id no.6所示；优化前的密码子相对适应度图如图3所示；优化后的密码子相对适应度图如图4所示。
41.由图1
‑
图4可以看出，经密码子优化后的nampt酶和parp1蛋白的编码基因的密码子相对适应度可以达到1.00，显著提高了蛋白编码基因在原核表达系统中的适应性。
42.实施例2：表达nampt酶的第一重组表达载体的构建
43.将质粒pllp
‑
ompa用bamhⅰ和nhelⅰ进行双酶切，然后通过dna连接酶将密码子优化后的seq id no.5所示的核苷酸片段连接到pllp
‑
ompa载体上，构建得到表达nampt酶的第
一重组表达载体(pllp
‑
ompa
‑
nampt)。
44.对构建的第一重组表达载体(pllp
‑
ompa
‑
nampt)进行双酶切验证，将pllp
‑
ompa
‑
nampt用bamhⅰ和nhelⅰ进行双酶切，若产生1.5kb和7.5kb两条带，则证明重组表达载体构建成功。本实施例构建的第一重组表达载体双酶切验证结果见图5。结果表明：经密码子优化后的seq id no.5所示的核苷酸片段已经成功插入到pllp
‑
ompa载体中。
45.实施例3：表达parp1蛋白的第二重组表达载体的构建
46.将质粒pet
‑
42a( )用sacⅱ和sphⅰ双酶切，然后通过dna连接酶将密码子优化后的seq id no.6所示的核苷酸片段连接到pet
‑
42a( )载体上，构建得到表达parp1蛋白的第二重组表达载体(pet
‑
42a( )
‑
parp1)。
47.对构建的第二重组表达载体(pet
‑
42a( )
‑
parp1)进行双酶切验证，将pet
‑
42a( )
‑
parp1用sacⅱ和sphⅰ进行双酶切，若产生3.0kb和4.9kb两条带，则证明重组表达载体构建成功。本实施例构建的第二重组表达载体双酶切验证结果见图6。结果表明：经密码子优化后的seq id no.6所示的核苷酸片段已经成功插入到pet
‑
42a( )载体中。
48.实施例4：nampt酶生产菌的构建
49.将实施例2构建的第一重组表达载体和实施例3构建的第二重组表达载体通过钙离子诱导导入到同一大肠杆菌b21(de3)中，获得转化子。
50.将转化子在lb平板上涂布，等长出单菌落之后用影印法分别在kan平板(含100μg/ml kan的lb平板)和amp平板(含100μg/ml amp的lb平板)上接种，待两个抗性平板上都长出单菌落之后，通过对比位置，在lb平板中挑出能同时在kan和amp中生长的单菌落，将其作为阳性转化子。
51.将阳性转化子接种含有100μg/ml kan和100μg/ml amp的lb培养基中，33℃培养至od
600
＝0.6，加入iptg(使iptg的终浓度为0.5mmol/l)，20℃诱导培养12h。诱导培养结束后，超声破菌，加入非离子型去垢剂triton x
‑
100去除包涵体，离心，分离出上清液，调节ph至7.2
‑
7.4，通过sds
‑
page和western blot鉴定nampt酶。
52.选取能够表达nampt酶的阳性转化子，传代5代，最终选择能够表达nampt酶、且能稳定遗传的阳性转化子，将其作为nampt酶生产菌。
53.对比例1：
54.将实施例2构建的第一重组表达载体导入到大肠杆菌b21(de3)，获得转化子；通过含有100μg/ml amp的lb平板对转化子进行筛选，挑取生长旺盛的菌株作为阳性转化子。
55.将阳性转化子接种含有100μg/ml amp的lb培养基中，33℃培养至od
600
＝0.6，加入iptg(使iptg的终浓度为0.5mmol/l)，20℃诱导培养12h。诱导培养结束后，超声破菌，加入非离子型去垢剂triton x
‑
100去除包涵体，离心，分离出上清液，调节ph至7.2
‑
7.4，通过sds
‑
page和western blot鉴定nampt酶。
56.选取能够表达nampt酶的阳性转化子，传代5代，最终选择能够表达nampt酶、且能稳定遗传的阳性转化子，将其作为nampt酶的生产菌a。
57.对比例2：
58.将seq id no.2所示的nampt基因通过现有基因工程的方法连接到质粒pllp
‑
ompa上，得到重组表达载体pllp
‑
ompa
‑
nampt。
59.将seq id no.4所示的parp1基因通过现有基因工程的方法连接到质粒质粒pet
‑
42a( )上，得到重组表达载体pet
‑
42a( )
‑
parp1。
60.将重组表达载体pllp
‑
ompa
‑
nampt和重组表达载体pet
‑
42a( )
‑
parp1导入到同一大肠杆菌b21(de3)，挑选阳性菌株，筛选方法同实施例4，构建得到生产菌b。
61.对比例3：
62.按实施例2的方法将密码子优化后的seq id no.5所示的核苷酸片段连接到pllp
‑
ompa载体上，构建得到表达nampt酶的第一重组表达载体(pllp
‑
ompa
‑
nampt)。
63.通过现有基因工程的方法将密码子优化后的seq id no.6所示的核苷酸片段连接到pet
‑
28a( )载体上，构建得到表达parp1蛋白的第二重组表达载体(pet
‑
28a( )
‑
parp1)。
64.将重组表达载体pllp
‑
ompa
‑
nampt和重组表达载体pet
‑
28a( )
‑
parp1导入到同一大肠杆菌b21(de3)。结果发现：导入载体后的大肠杆菌b21(de3)直接死亡，无法获得重组菌。
65.将实施例4、对比例1
‑
对比例2构建的生产菌接入到同样的lb液体培养基中进行诱导培养，诱导培养条件相同(iptg终浓度均为0.5mmol/l，20℃诱导培养12h)，诱导培养结束后，超声破菌，加入非离子型去垢剂triton x
‑
100去除包涵体，离心，分离出上清液，调节ph至7.2
‑
7.4。采用nampt酶检测试剂盒(human nicotinamide phosphoribosyltransferase(nampt)elisa kit，购自abbexa公司)对上清液中的nampt酶进行检测。结果见表1。
66.表1：
67.生产菌nampt酶表达量实施例413g/l对比例15g/l对比例2≤1g/l
68.结果表明：采用本发明构建的nampt酶，能够显著提高nampt酶的表达量。
69.以上所述仅为本技术的优选实施例而已，并不用于限制本技术，对于本领域的技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。