异形根孢囊霉菌根共生早期标记基因及其应用的制作方法

1.本发明涉及农林业微生物领域，尤其是涉及丛枝菌根真菌即异形根孢囊霉的菌根共生早期标记基因及其应用。


背景技术：

2.丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi,amf)amf能与72％以上的陆生维管束植物根系形成丛枝菌根(bonfante et al,2018；)。amf庞大的根外菌丝网不仅能促进植物对氮、磷、钾、硫、锌、铁、铜等矿质营养元素和水分的吸收和利用，改善菌根化植物的营养状况(ferrol et al.,2019；hartmann et al.,2019)，还能分泌球囊霉素、海藻糖等有机物以改良土壤理化性质、固定土壤中的重金属、去除有机污染物、招募有益微生物以及诱导宿主植物合成激素和抗氧化物(wang et al.,2017；zhang et al.,2018；janeeshma et al.,2019；deja
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sikora et al.,2019)，从而促进植物生长，增加植物生物量并提高植物对干旱、盐碱、病虫害和污染物等的耐受性，在农林业可持续发展和生态环境保护中发挥着十分重要的积极作用(rasmann et al.,2017；kaushal et al.,2019；chandrasekaran et al.,2019；hao et al.,2019；begum et al.,2019；陈保冬等,2019)。菌根化的比非菌根化的农林作物在生长状况、产量和品质上有显著的优越性。然而，由于amf在漫长的进化过程中失去了降解有机物的酶系而无法自养，只能与宿主植物之间形成糖类和脂质
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矿物质交换的专性共生体系，其专性营养共生的生活方式，导致人们难以对其进行纯培养，极大地阻碍了相关科学研究与实际生产，相关领域仍存在许多方面有待改善。
3.在目前的菌根苗生产过程和相关研究中，amf接种剂量、逆境胁迫程度等都能影响植物的菌根化水平和amf的植物促生效果，人们通常采用统计侵染率的方法来检测菌根侵染水平和发育状况，以确保菌根植物种苗已实现菌根化并达到良好水平。该方法即在共生体发育成熟后取菌根化根系，进行消化、染色，在显微镜下检测包括以丛枝丰度(arbuscule abundance,a％)、侵染频度(frequency of colonization,f％)和菌根化强度(mycorrhizal intensity,m％)等指标为代表的侵染率，存在耗时较长、流程较繁琐且工作量较大的问题。另外，人们也可采用qrt
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pcr方法检测在丛枝细胞内大量表达的am真菌单糖转运基因mst2和菌根植物丛枝特异的磷酸盐转运基因pt4的表达水平，来表征和评判丛枝发育状况和菌根侵染情况，该方法相比于检测侵染率的方法较简便，但仍存在耗时较长的问题。采用这两种方法来判断菌根植物种苗能否实现菌根化，都存在耗时较长的局限性，是因为它们都涉及了需要接种后长达数周时间才能达到的丛枝发育成熟的共生时期。而以常规的野生型菌根植物为宿主，amf完整的生活史必定包括非共生时期的分子对话，共生早期的附着胞/附着足形成，共生时期的根内菌丝延伸、丛枝发育与成熟，共生后期的根外菌丝产生和产孢等过程，通过检测宿主植物根系样品中在共生早期大量表达的基因的表达水平，就能够提前评判菌根植物种苗能否实现菌根化，即把“是否已经形成菌根”的评判标准转化为“是否即将形成菌根”。因此，鉴定amf在共生早期大量表达的基因尤为重要。而近年来，包括模式amf异形根孢囊霉(rhizophagus irregularis daom197198)在内的8个amf的
基因组已经被公开释放，这将为揭示相关科学问题和突破相关技术瓶颈提供重要依据。


技术实现要素：

4.为了克服现有技术中常规镜检统计侵染率方法和qrt
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pcr方法检测丛枝特异性基因表达水平来评价菌根植物能否实现菌根化及评价菌根化水平的过程中存在的耗时较长、工作量较大的缺点与不足，本发明的目的在于提供异形根孢囊霉菌根共生早期标记基因。
5.本发明的另一目的在于提供一种异形根孢囊霉菌根共生早期标记基因的应用。
6.本发明的目的通过下述技术方案实现：
7.本发明提供异形根孢囊霉菌根共生早期标记基因，包括camp合成酶编码基因cyr1、camp水解酶编码基因pde2、snf1催化亚基编码基因snf1、pka调节亚基编码基因bcy1、pka催化亚基编码基因tpk1、tor关键基因tor2、tor关键基因tip41、主要营养信号通路下游共同靶标转录因子编码基因msn2、热激蛋白编码基因ssa3、自噬相关蛋白编码基因atg8；
8.所述基因是通过采用酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)营养信号通路中10个关键组分的蛋白序列对异形根孢囊霉基因组进行同源序列搜索，并对同源序列进行生物信息学分析和筛选鉴定而获得；通过转录组分析，发现这些蛋白编码基因在异形根孢囊霉孢子和共生时期有不同的表达水平；采用实时荧光定量qpt
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pcr方法，检测到这些基因在异形根孢囊霉菌根共生体中的共生早期阶段有较高的表达水平，表明这些营养信号通路关键基因都能够作为异形根孢囊霉菌根共生体中共生早期阶段的标记基因。
9.所述10个基因分别编码camp依赖的蛋白激酶a(camp
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dependent protein kinase a,pka)通路中的camp合成酶cyr1、camp水解酶pde2、pka调节亚基bcy1、pka催化亚基tpk1，蔗糖非酵解型蛋白激酶(sucrose non
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fermenting1related protein kinase,snf1)通路中的催化亚基snf1，雷帕霉素受体(target of rapamycin kinase,tor)通路中的关键蛋白tor2、tip41，以及信号通路下游靶标转录因子msn2、热激蛋白ssa3和自噬相关蛋白atg8。
10.所述基因及其编码蛋白在ncbi数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的序列登录号如表1所示：
11.表1基因及其编码蛋白的登录号
[0012][0013]
本发明还提供一种上述基因的应用，即通过检测上述异形根孢囊霉菌根共生早期标记基因的表达水平，以评价已接种异形根孢囊霉的宿主菌根植物能否实现菌根化或评价
daom197198,taxid:747089)的基因组中进行蛋白质同源序列搜索。通过保守结构域数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/structure/cdd/wrpsb.cgi)，对匹配度较高的目标序列进行保守结构域分析，舍弃不含关键结构域的序列，进一步确定目标基因同源序列。目标基因及编码蛋白如表1所示。
[0025]
实施例2菌根样品制备
[0026]
将已经过表面消毒的紫云英种子(xie et al.,2013)置于25℃暗培养2
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3天等待萌发，移至植物生长室(白天25℃、16h，夜晚18℃、8h)培养10天。将通过三叶草扩繁的异形根孢囊霉菌剂接种至紫云英根部，每株接种约100个孢子，随后每周浇灌一次含30μm kh2po4的改良long
‑
ashton营养液(hewitt，1966)，分别于接种后的第14、21、28、35、42、56天分批收取菌根样品，每次收取3株置于
‑
80℃储存。
[0027]
实施例3qrt
‑
pcr检测共生早期标记基因表达水平
[0028]
将在不同时期收取的菌根样品从
‑
80℃中取出，在液氮中粉碎后，采用植物rna提取试剂盒plant rna kit(omega，usa)根据操作流程提取菌根总rna，采用反转录试剂盒iii rt supermix for qpcr( gdna wiper)kit(vazyme,nanjing,china)根据操作步骤反转录合成cdna。通过实时定量pcr引物设计工具(https://sg.idtdna.com/scitools/applications/realtimepcr/)设计目标基因序列的特异性引物，扩增产物长度为70～150bp。以cdna为模板，采用qrt
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pcr试剂chamq univeral sybr qpcr master mix(vazyme,nanjing,china)根据操作手册在qrt
‑
pcr仪cfx connect
tm real
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time pcr detection system(bio
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rad,usa)中检测目标基因表达水平。异形根孢囊霉的内参基因为rief1α，紫云英的内参基因为asactin。采用2
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δδct
相对定量法计算基因的相对表达量。使用spss 22软件(spss inc.,chicago,il,usa)进行统计分析，采用duncan式进行多重比较，p<0.05，显著性差异以不同字母表示，误差线为
±
标准差sd。结果如图1所示，结果显示异形根孢囊霉cyr1、pde2、bcy1、tpk1、snf1、tor2、tip41、atg8、ssa3和msn2共10个基因在接种后的第14天(共生早期)大量表达，而可作为菌根共生时期标记基因的异形根孢囊霉mst2和宿主植物紫云英aspt4基因在接种后第56天表达量最高，表明上述异形根孢囊霉的10个基因可作为菌根共生早期标记基因，对其表达水平的检测可将评判已接种异形根孢囊霉的宿主菌根植物能否实现菌根化或评价其潜在的菌根化水平的所需时间缩短至两周及以内。
[0029]
目标基因序列的特异性引物，如表2所示。
[0030]
表2目标基因序列的特异性引物
[0031]
基因正义链引物(5'
→
3')反义链引物(5'
→
3')ricyr1tcgtgtgcttggtcttatggacctaaagtatcagccatgccripde2tcacaactttactcacgccgttgctacttttaccccgtcgribcy1ggcggtagttttggtgaattgctagagcccaaagaacagagtcritpk1aatggtttaagggaattgaatgggccgtaaggttctctttcctcgrisnf1taatggaatacgctggaggtgggtttcaaatctcggtgtgcritor2actcttggtgtgatgcgttggtagccattgacttgcgatttgritip41tgacataaattggataaattcaaagttaccactgcaatgaccaattcaaagacriatg8agagaaatcagacatcgccacatgaagatcgctttctcaggg
rissa3aacgtacactatcggcatcaggacaggttccattgtagatcggrimsn2cccgcatccacattgtacatggagtgaaattactaaacgttcttgrief1αccaaagttaagggcaaaacgcttgaagtggaagacgaagggrimst2ggcaggatatttgtctgataggcaataactcttcccgtatacaspt4cagaaacaaagggaagatcattggcatgtaattcagatccttcacactgasactingttcttttccagccttctatgaatgtttccgtacagatcctttc
[0032]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。