一种N-糖基化修饰提高黑曲霉木聚糖酶热稳定性的方法与流程

一种n
‑
糖基化修饰提高黑曲霉木聚糖酶热稳定性的方法
技术领域
1.本发明涉及一种n
‑
糖基化修饰提高黑曲霉木聚糖酶热稳定性的方法，属于基因工程技术领域。


背景技术：

2.于食品、医药、饲料和新能源等方面。虽然木聚糖酶研究时间较长且来源广泛，但是面对不同应用条件，常因为酶解效率低，耐受性不足等问题而限制了其使用。木聚糖酶主要分布于第5、8、10、11、30和43家族。目前研究最多的木聚糖酶来源于第10和第11家族，其中，11家族的木聚糖酶表现出较广泛的ph耐受性和底物特异性，但是其热稳定性较差是亟需解决的问题。
3.前期研究中，王灵等比较了毕赤酵母和大肠杆菌中表达的xyna，前者的热稳定性和比酶活均高于后者，确定了n
‑
糖基化对xyna的影响。方程等人将木聚糖酶xynhb的214位糖基化位点氨基酸n突变为a，突变体在毕赤酵母表达的重组酶在60℃半衰期由12min提高到65min。n
‑
糖基化是真核生物中比较常见的蛋白质修饰现象，其可以通过糖链的作用影响蛋白质的结构或者起到保护的作用，从而提升蛋白质的催化效率和耐受性，但是正确位置的糖基化才能达到理想的效果，不是所有的糖基化位点的突变都能使木聚糖酶热稳定性提高，本发明旨在寻找合适的糖基化位点以期获得热稳定性提高的木聚糖酶。


技术实现要素：

4.[技术问题]
[0005]
本发明要解决的技术问题是提供一种热稳定性提高的木聚糖酶突变体。
[0006]
[技术方案]
[0007]
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种热稳定性提高的木聚糖酶突变体，所述木聚糖酶突变体的氨基酸序列如seq id no.3所示。
[0008]
本发明还提供了编码上述木聚糖酶突变体的基因。
[0009]
本发明还提供了携带上述基因的载体。
[0010]
在一种实施方式中，所述载体以pmd19为表达载体。
[0011]
本发明还提供了表达上述基因或上述载体的宿主细胞。
[0012]
在一种实施方式中，所述宿主细胞包括真菌、细菌和古细菌。
[0013]
在一种实施方式中，所述宿主细胞包括黑曲霉。
[0014]
本发明还提供了一种重组菌，所述重组菌表达上述的木聚糖酶突变体。
[0015]
在一种实施方式中，所述重组菌以pmd19为表达载体。
[0016]
在一种实施方式中，所述重组菌以黑曲霉为宿主细胞。
[0017]
本发明还提供了一种提高木聚糖酶热稳定性的方法，所述方法为将氨基酸序列如seq id no.2所示的木聚糖酶的第53位的甘氨酸突变为苏氨酸，第55位的丙氨酸突变为天冬酰胺，第57位的天冬氨酸突变为丝氨酸，第59位的苏氨酸突变为天冬酰胺，第61位的丝氨
酸突变为天冬酰胺和/或第65位的苏氨酸突变为天冬酰胺。
[0018]
在一种实施方式中，所述方法为将氨基酸序列如seq id no.2所示的木聚糖酶的第55位的丙氨酸突变为天冬酰胺，第57位的天冬氨酸突变为丝氨酸和/或第59位的苏氨酸突变为天冬酰胺。
[0019]
本发明还提供了一种用于降解木聚糖的组合物，所述组合物含有上述木聚糖酶突变体作为活性成分，以所述组合物的总重量为基准，所述木聚糖酶的含量为10
‑
90重量％。
[0020]
本发明还提供了上述木聚糖酶突变体，或上述基因，或上述载体，或上述重组菌，或上述组合物在降解木聚糖中的应用。
[0021]
[有益效果]
[0022]
1、本发明通过对氨基酸序列如seq id no.2所示的木聚糖酶的第55位苏氨酸，第57位丙氨酸和/或第59位异亮氨酸进行突变，得到的突变体酶a55n/d57s、t59n和a55n/d57s/t59n的最适反应温度从原始的50℃分别提升至65℃、58℃和68℃。
[0023]
2、突变体酶t59n的半衰期t
1/250℃
提高至340min，突变体酶a55n/d57s/t59n在50℃下孵育500min，酶活没有下降趋势，孵育1260min，酶活只损失25.6％。
[0024]
3、突变体酶a55n/d57s/t59n在ph 2.0
‑
9.0间很稳定，孵育1h仍能保持70％以上的酶活力。
[0025]
4、突变体酶a55n/d57s/t59n的比酶活为290.5u/mg，较野生型酶xyna提高了70.4％。
附图说明
[0026]
图1：重组质粒pmd19
‑
xyna/hyg的构建示意图。
[0027]
图2：野生型酶xyna和突变体的热稳定性图。
具体实施方式
[0028]
木聚糖酶酶活测定：采用3，5
‑
二硝基水杨酸测定木聚糖酶酶活的方法。将500μl稀释至适当浓度的酶液或发酵上清与500μl浓度为10mg/ml桦木木聚糖底物(ph 4.0)混合，在50℃条件下反应10min后用3，5
‑
二硝基水杨酸试剂终止反应。将终止反应后的样品于沸水内反应5min后立即用水冷却至室温，并在545nm条件下测定吸光度，失活的酶液作为空白组。
[0029]
酶活力单位(u/ml)定义：每分钟水解木聚糖所产生的1μmol还原糖所需的酶量。
[0030]
比酶活代表每单位质量蛋白质的催化能力，能够反应酶活性大小，其值越大，表明酶活性越高，比活力的计算公式为：比酶活(u/mg)＝总酶活力单位数/mg总蛋白。
[0031]
黑曲霉(a.niger)：公开于cn110438018b，保藏编号为cctcc m 2018881。
[0032]
实施例1木聚糖酶突变体的制备
[0033]
(1)重组黑曲霉a.niger/xyna/hyg的构建
[0034]
以黑曲霉(a.niger)的基因组为模板，通过设计上下游引物f1和r1(表2)进行pcr扩增木聚糖酶xyna表达框。以pmd19载体为模板，通过引物f2、r2扩增得到pmd19载体片段，将木聚糖酶xyna表达框和pmd19载体片段分别进行琼脂糖凝胶电泳，并胶回收产物，将回收的木聚糖酶xyna表达框和pmd19载体片段进行一步克隆连接，得到重组载体pmd19
‑
xyna，并
测序验证，成功构建表达野生型木聚糖酶基因xyna(核苷酸序列如seq id no.1所示)的重组质粒pmd19
‑
xyna。
[0035]
重组载体pmd19
‑
xyna经测序正确后，作为模板利用引物f3、r3进行pcr扩增获得pmd19
‑
xyna载体片段，以潮霉素抗性基因(hyg)表达框为模板利用引物f4、r4进行pcr扩增获得潮霉素抗性基因(hyg)表达框(核苷酸序列如seq id no.4所示)，将潮霉素抗性基因(hyg)表达框和pmd19
‑
xyna载体片段分别进行琼脂糖凝胶电泳，并胶回收产物，将回收的潮霉素抗性基因(hyg)表达框和pmd19
‑
xyna载体片段一步克隆连接，得到含有筛选标记基因hyg的重组载体pmd19
‑
xyna/hyg(图1)，将表达载体pmd19
‑
xyna/hyg转化至e.coli jm109，在含有50μg/ml氨苄青霉素的lb固体培养基培养过夜后，挑单克隆于50μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基培养过夜，提取质粒，并进行测序验证。
[0036]
以测序正确的pmd19
‑
xyna/hyg为模板，以引物f1和r4进行pcr扩增获得插入片段，将插入片段以同源重组的方法整合到黑曲霉的基因组上，获得重组黑曲霉a.niger/xyna/hyg。
[0037]
pcr反应体系均为：正向引物(10μm)1μl，反向引物(10μm)1μl，模板dna 1μl，2
×
phantamax master mix 25μl，加入双蒸水至50μl。
[0038]
pcr程序为：扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸50s，循环34次；最后72℃延伸5min。
[0039]
(2)表达木聚糖酶突变体的重组黑曲霉的构建
[0040]
以步骤(1)构建的pmd19
‑
xyna/hyg为模板，分别设计并合成突变体g53t、a55n/d57s、t59n、s61n、t65n、a55n/d57s/t59n的突变引物序列(表1)，对木聚糖酶xyna进行定点突变，分别测序验证木聚糖酶突变体的编码基因。分别以测序正确的pmd19
‑
g53t/hyg、pmd19
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a55n/d57s/hyg、pmd19
‑
t59n/hyg、pmd19
‑
s61n/hyg、pmd19
‑
t65n/hyg、pmd19
‑
a55n/d57s/t59n/hyg为模板，以引物f1和r4进行pcr扩增获得插入片段，将插入片段以同源重组的方法整合到黑曲霉的基因组上，分别获得重组黑曲霉a.niger/g53t/hyg、a.niger/a55n/d57s/hyg、a.niger/t59n/hyg、a.niger/s61n/hyg、a.niger/t65n/hyg、a.niger/a55n/d57s/t59n/hyg。
[0041]
表1各质粒构建引物表
[0042]
实施例2 xyna和突变体的表达纯化和酶学性质测定
[0043]
将实施例1构建的重组黑曲霉a.niger/xyna/hyg和a.niger/g53t/hyg、a.niger/a55n/d57s/hyg、a.niger/t59n/hyg、a.niger/s61n/hyg、a.niger/t65n/hyg和a.niger/a55n/d57s/t59n/hyg分别接种于pda液体培养基中，在28℃，180rpm条件下，过夜培养获得种子液，将种子液以体积比10％的量接种于30ml新鲜的pda液体培养基中，在28℃，180rpm条件下，培养36h后，收集培养液，将培养液12000rpm离心收集上清，并将上清经0.22μm滤膜过滤后用histrap
tm ff纯化，脱盐柱sephadex g25脱盐获得纯化的野生型酶xyna和突变体酶g53t、a55n/d57s、t59n、s61n、t65n和a55n/d57s/t59n，分别测定木聚糖酶的最适反应温度和温度稳定性。
[0044]
最适反应温度的测定：用ph 7.5，浓度为50mm的nah2po4‑
na2hpo4缓冲体系，在不同温度下(40
‑
60℃)进行酶促反应，分别测定酶活，以测定纯化的野生型酶xyna和突变体酶的最适温度。以最高酶活为100％，计算各温度下的相对酶活。结果显示，突变体酶a55n/d57s、t59n和a55n/d57s/t59n突变体的最适反应温度分别为65℃、58℃和68℃，较野生型酶xyna的50℃分别上升了15℃、8℃和18℃。而突变体g53t、s61n、t65n的最适反应温度和不同温度下的残余酶活与xyna无明显差异。
[0045]
温度稳定性的测定：将纯化的野生型酶xyna和突变体a55n/d57s/t59n分别在40
‑
60℃条件下孵育0
‑
80min后置于冰上保存，测定各条件下的酶活。以孵育0min时的酶活为
100％，计算各孵育时间下的相对酶活。突变体酶a55n/d57s/t59n在60℃下孵育5min，仍然能保持95.34％的酶活力，而野生型酶xyna在55℃下孵育5min时酶活仅剩不足10％(图2)。
[0046]
半衰期为拟合野生型酶xyna和突变体酶在不同温度下的相对酶活的回归方程后计算得到的，结果显示，野生型酶xyna的半衰期t
1/250℃
为18min，突变体酶t59n的半衰期t
1/250℃
提高至340min，突变体酶a55n/d57s/t59n在50℃下孵育500min，酶活没有下降趋势，孵育1260min，酶活只损失25.6％。
[0047]
测定突变体酶对桦木木聚糖的降解能力：结果显示，突变体酶a55n/d57s/t59n的比酶活为290.5u/mg，较xyna提高了70.4％。
[0048]
最适反应ph的测定：在40℃下，纯化的野生型酶xyna和突变体酶在不同ph值(ph 2.0
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9.0)的缓冲液中进行酶促反应以测定其最适ph值，所用缓冲液为na2hpo4‑
柠檬酸(ph 2.0
‑
5.0)、na2hpo4‑
nah2po4(ph 6.0
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7.0)、tris
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hcl(ph 8.0)和甘氨酸
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naoh(ph 9.0)缓冲液。结果显示，突变体酶a55n/d57s、t59n和a55n/d57s/t59n突变体和野生型酶xyna的最适ph值保持一致，均为4.0。
[0049]
ph稳定性的测定：将酶液在不同ph(ph 2.0
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9.0)的缓冲液中于40℃下处理1h，再测定酶活性以研究酶的ph稳定性，所用缓冲液如上所述。结果显示，突变体酶和野生型酶xyna的在ph 2.0
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9.0间很稳定，保持了70％以上的酶活力。
[0050]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。