一种通过迭代饱和突变提高木聚糖酶热稳定性的方法与流程

1.本发明涉及一种通过迭代饱和突变提高木聚糖酶热稳定性的方法，属于基因工程领域领域。


背景技术：

2.木聚糖酶酶系包括β
‑
1,4
‑
d
‑
木聚糖酶(ec 3.2.1.8)、β
‑
d
‑
1,4木糖苷酶(ec 3.2.1.37)、α
‑
l
‑
阿拉伯糖苷酶(ec 3.2.1.55)和α
‑
l
‑
葡萄糖醛酸苷酶(ec 3.2.1.139)，其中，β
‑
1,4
‑
d
‑
木聚糖酶是最关键的酶，它以内切的方式将β
‑
1,4
‑
糖苷键断裂。该酶在食品、医药、饲料和新能源等方面应用广泛，但由于其热稳定性较差，在生产过程中限制了其使用。其中，11家族木聚糖酶由于其ph耐受性和底物特异性具有较大潜力，但热稳定性差是亟需解决的问题。
3.随着蛋白质工程技术和分子生物学的发展，已有许多学者运用这项技术成功对蛋白的热稳定性进行了改造。如专利cn104911163b中，发明人构建了5个突变体，最适温度提高了2
‑
17℃，65
‑
80℃范围内的半衰期提高了2
‑
16倍。李治宏将11家族木聚糖酶loop区的t152突变为phe，在70℃条件下活性比野生型提高27％。但目前的并没有热稳定性提高的同时保持ph稳定性的木聚糖酶。


技术实现要素：

4.[技术问题]
[0005]
本发明要解决的技术问题是提供一种热稳定性提高且保持ph稳定性的木聚糖酶。
[0006]
[技术方案]
[0007]
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种木聚糖酶突变体，所述木聚糖酶突变体的氨基酸序列如seq id no.3所示。
[0008]
本发明还提供了编码上述木聚糖酶突变体的基因。
[0009]
本发明还提供了携带上述基因的载体。
[0010]
在一种实施方式中，所述载体以pet
‑
22b( )为表达载体。
[0011]
本发明还提供了表达上述基因或上述载体的宿主细胞。
[0012]
本发明还提供了一种重组菌，所述重组菌表达上述木聚糖酶突变体。
[0013]
在一种实施方式中，所述重组菌以pet
‑
22b( )为表达载体。
[0014]
在一种实施方式中，所述重组菌以大肠杆菌为宿主细胞。
[0015]
在一种实施方式中，所述大肠杆菌包括e.coli jm109和e.coli bl21。
[0016]
本发明还提供了一种提高木聚糖酶热稳定性的方法，所述方法为将氨基酸序列如seq id no.2所示的木聚糖酶的第121位的苏氨酸突变为缬氨酸，第124位的丙氨酸突变为脯氨酸，第126位的异亮氨酸突变为缬氨酸，第129位的苏氨酸突变为亮氨酸和/或第130位的丙氨酸突变为天冬酰胺。
[0017]
本发明还提供了一种用于降解木聚糖的组合物，所述组合物含有上述木聚糖酶突
变体作为活性成分，以所述组合物的总重量为基准，所述木聚糖酶的含量为10
‑
90重量％。
[0018]
本发明还提供了上述木聚糖酶突变体，或上述基因，或上述载体，或上述重组菌，或上述组合物在降解木聚糖中的应用。
[0019]
[有益效果]
[0020]
1、本发明通过对氨基酸序列如seq id no.2所示的木聚糖酶的第121位苏氨酸，第124位丙氨酸，第126位异亮氨酸，第129位苏氨酸和第130位丙氨酸进行突变，得到的突变体酶分别在55℃、60℃和下70℃孵育5min，仍然能保持76.8％、68.4％和35.5％的酶活力；突变体酶在50℃下孵育1200min，酶活没有下降的趋势。
[0021]
2、木聚糖酶突变体在ph 2.0
‑
9.0间很稳定，孵育1h仍能保持70％以上的酶活力。
附图说明
[0022]
图1：重组质粒pet
‑
22b( )
‑
xyna的构建示意图。
[0023]
图2：迭代饱和突变线路图。
[0024]
图3：xyna和突变体的热稳定性图。
具体实施方式
[0025]
木聚糖酶酶活测定：采用3，5
‑
二硝基水杨酸测定木聚糖酶酶活的方法。将500μl稀释至适当浓度的酶液或发酵上清与500μl浓度为10mg/ml桦木木聚糖底物(ph 4.0)混合，在50℃条件下反应10min后用3，5
‑
二硝基水杨酸试剂终止反应。将终止反应后的样品于沸水内反应5min后立即用水冷却至室温，并在545nm条件下测定吸光度，失活的酶液作为空白组。
[0026]
酶活力单位(u/ml)定义：每分钟水解木聚糖所产生的1μmol还原糖所需的酶量。
[0027]
比酶活代表每单位质量蛋白质的催化能力，能够反应酶活性大小，其值越大，表明酶活性越高，比活力的计算公式为：比酶活(u/mg)＝总酶活力单位数/mg总蛋白。
[0028]
黑曲霉(a.niger)：公开于cn110438018b，保藏编号为cctcc m 2018881。
[0029]
实施例1木聚糖酶突变体的制备
[0030]
(1)重组质粒pet
‑
22b( )
‑
xyna的构建
[0031]
以黑曲霉(a.niger)的基因组为模板，通过引物f1和r1进行pcr扩增得到基因片段xyna。以pet
‑
22b( )载体为模板，用intron primef和intro primerr扩增得到pet
‑
22b( )载体片段，将基因片段xyna和pet
‑
22b( )载体片段分别进行琼脂糖凝胶电泳，并胶回收产物，将回收的基因片段xyna插入至pet
‑
22b( )载体的酶切位点ncoi和xhoi之间，并用磷酸化酶和solution i去除内含子得到表达载体pet
‑
22b( )
‑
xyna(图1)。将表达载体pet
‑
22b( )
‑
xyna转化至e.coli jm109，在含有50μg/ml氨苄青霉素的lb固体培养基培养过夜后，挑单克隆于50μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基培养12～16h，提取质粒，并进行测序验证，成功构建表达野生型木聚糖酶基因xyna(核苷酸序列如seq id no.1所示)的重组质粒pet
‑
22b( )
‑
xyna。
[0032]
pcr反应体系均为：正向引物(10μm)1μl，反向引物(10μm)1μl，模板dna 1μl，2
×
phanta max master mix 25μl，加入双蒸水至50μl。
[0033]
pcr扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸50s，循环
34次；最后72℃延伸5min。
[0034]
(2)含有木聚糖酶突变体的重组质粒的构建及筛选
[0035]
以步骤(1)构建的pet
‑
22b( )
‑
xyna为模板，针对木聚糖酶xyna的第121～130位的单个氨基酸位点设计简并引物(表1)，分别通过pcr进行饱和突变，构建获得含有木聚糖酶突变体的重组质粒。
[0036]
pcr反应体系均为：正向引物(10μm)1μl，反向引物(10μm)1μl，模板dna 1μl，2
×
phanta max master mix 25μl，加入双蒸水至50μl。
[0037]
pcr扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸50s，循环34次；最后72℃延伸5min。
[0038]
将含有木聚糖酶突变体的重组质粒转入大肠杆菌e.coli jm109感受态细胞37℃培养12～16h，挑取不同的转化子至含有lb培养基的96孔板中发酵培养，37℃、750r/min下恒温摇床振荡培养到od
600
至0.8，加入终浓度为0.5mm的iptg(异丙基硫代半乳糖苷，isopropylβ
‑
d
‑
thiogalactoside)，25℃、750rpm诱导24h后取上清初次测定酶活。再将上清置于55℃下孵育10min后再次测定酶活，计算在50℃和55℃测定的突变体酶的酶活相对值来表征突变体酶的热稳定性。
[0039]
当木聚糖酶xyna的氨基酸位点第121、124、126、127、129、130发生单点突变时，可以提高木聚糖酶的热稳定性，其余位点不能提高木聚糖酶xyna的热稳定性。在最佳突变体a124p、i126v的基础上依次对剩余的正向突变位点121、127、129、130再次进行饱和突变，逐步形成更加稳定的结构(图2)，每次突变都进行热稳定性的筛选以得到最佳突变体。经过5轮饱和突变和热稳定性筛选后，最终得到重组质粒pet
‑
22b( )
‑
a124p/a130n/t121v/t129l/i126v。突变的pcr反应体系和扩增程序与步骤(1)相同。
[0040]
表1各质粒构建引物表
[0041][0042]
注：下划线为酶切位点。
[0043]
实施例2：xyna和突变体的表达纯化及酶学性质测定
[0044]
(1)表达与纯化
[0045]
将实施例1构建的重组质粒pet
‑
22b( )
‑
xyna和pet
‑
22b( )
‑
a124p/a130n/t121v/t129l/i126v分别转入e.coli bl21感受态细胞中，并涂布于lb固体培养基37℃过夜培养，挑取单菌落接种于lb液体培养基，在37℃，220rpm条件下，过夜培养获得种子液，将种子液以体积比2％的量接种于30ml新鲜的pda液体培养基中，在37℃，220rpm条件下，培养至od
600
为0.8时，用终浓度为0.5mm的iptg诱导并在25℃，220rpm条件下培养24h。收集发酵液12000rpm离心收集上清，并将上清用0.22μm滤膜过滤后经histrap
tm ff纯化，脱盐柱sephadex g25脱盐，获得纯化的野生型酶xyna和突变体酶。sds
‑
page电泳显示纯化的野生型酶和突变体酶的的分子量一致，且大小与理论值相同。
[0046]
(2)酶学性质测定
[0047]
最适反应温度的测定：用ph 7.5，浓度为50mm的nah2po4‑
na2hpo4缓冲体系，在不同温度下(40
‑
60℃)进行酶促反应，分别测定酶活，以测定纯化的野生型酶xyna和突变体酶的最适温度。以最高酶活为100％，计算各温度下的相对酶活。结果显示，突变体a124p/a130n/t121v/t129l/i126v的最适反应温度为60℃，较野生型酶xyna上升了10℃。
[0048]
温度稳定性的测定：将纯化的野生型酶xyna和突变体酶分别在50
‑
70℃条件下孵育0
‑
80min后置于冰上保存，测定各条件下的酶活。以孵育0min时的酶活为100％，计算各孵育时间下的相对酶活。突变体酶在55℃下孵育5min，仍然能保持76.8％的酶活力，在60℃下
孵育5min，仍然能保持68.4％的酶活力，在70℃下孵育5min，仍然能保持35.5％的酶活力而野生型酶xyna在55℃下孵育10min时几乎全部失活(图3)。
[0049]
半衰期为拟合野生型酶xyna和突变体酶在不同温度下的相对酶活的回归方程后计算得到的，结果显示，野生型酶xyna的半衰期t
1/250℃
为18min，突变体酶在50℃下孵育1200min，酶活没有下降趋势。
[0050]
最适反应ph的测定：在40℃下，纯化的野生型酶xyna和突变体酶在不同ph值(ph 2.0
‑
9.0)的缓冲液中进行酶促反应以测定其最适ph值，所用缓冲液为na2hpo4‑
柠檬酸(ph 2.0
‑
5.0)、na2hpo4‑
nah2po4(ph 6.0
‑
7.0)、tris
‑
hcl(ph 8.0)和甘氨酸
‑
naoh(ph 9.0)缓冲液。结果显示，突变体a124p/a130n/t121v/t129l/i126v和野生型酶xyna的最适ph值保持一致，均为4.0。
[0051]
ph稳定性的测定：将酶液在不同ph(ph 2.0
‑
9.0)的缓冲液中于40℃下处理1h，再测定酶活性以研究酶的ph稳定性，所用缓冲液如上所述。结果显示，突变体酶在ph 2.0
‑
9.0间均很稳定，保持了70％以上的酶活力。
[0052]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。