一种基于基因膜芯片的多种呼吸道病毒检测方法与流程

1.本发明涉及一种基于基因膜芯片的多种呼吸道病毒检测方法，属于病毒检测技术领域。


背景技术：

2.呼吸道感染是临床常见的疾病之一，主要病原体包括细菌、病毒、支原体、衣原体、真菌等，其中超过90％是由呼吸道病毒感染引起，急性呼吸道感染是儿童最主要的威胁之一，多发于儿童、老年人及免疫功能低下者，常见的有甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒、鼻病毒、副流感病毒等，多数具有很强的感染力而且传播快、潜伏期短、发病急、临床表现相似，患者均表现为发热和上呼吸道感染症状，单从临床表现很难区分感染病原体。
3.目前常用的检测方法如下：病毒常规培养、血清学检验、抗原抗体检测及分子生物学方法(荧光聚合酶链式反应法及基因芯片法)；大多数病毒的检测采用病毒培养和血清学检测，前者通常被认为是诊断的“金标准”，但因细胞分离对培养技术的要求高，耗时长，不利于早期诊断。
4.血清学检测法虽方便易行，其检测双份血清需要间隔较长时间，检测结果不能及时应用于临床且血清学检测结果易受机体免疫水平的影响。
5.抗体抗原检测方法有免疫荧光法、酶联免疫吸附测定法等，此类方法检测速度快，但其敏感度较低，且病毒传播与抗体出现时间间隔较长，不利于微量感染会感染的早期诊断。
6.随着分子生物学技术的发展，呼吸道病原体核酸检测技术得到了蓬勃的发展，目前临床主要采用荧光定量聚合酶链式反应技术对疑似呼吸道病原体感染的患者进行筛查和确认，但该方法人工操作耗时长，难以在单次反应中检测多种病原体，部分号称能够同时检测多种病原体的产品或方法不外乎以下两种实现形式：第一，受限于荧光通道的数量，单体系扩增/检测不超过4个指标，若超过4个荧光通道则会出现荧光通路的相互干扰，出现假阴性或假阳性的结果，若需4个指标以上，需分成2个及以上的体系进行检测，相较于单体系检测，试剂价格成倍增加，工作量也大大增加，第二，单体系检测一个指标，分96或384孔板中进行检测，可同时检测30
‑
100多个靶标(算上质控及单样本的3个重复)，但该方法同样存在上述问题，试剂成本多倍增加，工作量极大。
7.除荧光定量聚合酶链式反应法外，基因芯片法也是现常用的分子生物学检测方法，其完美解决了荧光定量聚合酶链式反应技术检测通量低的问题，且通量可达成百甚至上千个靶标，但由于其设备、耗材等价格昂贵，目前在科研上使用较多，市场化程度较低。


技术实现要素：

8.本发明的主要目的是提供一种基于基因膜芯片的多种呼吸道病毒检测方法，解决了呼吸道病毒检测速度慢、耗时长、敏感度低、成本高以及难以在单次反应中检测多种病原
体的问题。
9.本发明的目的可以通过采用如下技术方案达到：
10.一种基于基因膜芯片的多种呼吸道病毒检测方法，包括以下检测步骤：
11.(1)样本前处理；
12.(2)核酸提取；
13.(3)多重pcr加样及扩增；
14.(4)膜芯片杂交；
15.(5)出具检测结果报告。
16.优选的，所述检测方法包括:通过多重pcr与反向斑点杂交的结合，同时检测6种常见呼吸道病毒，并以gapdh(甘油醛
‑3‑
磷酸脱氢酶基因)作为内对照监控核酸提取、pcr过程，pc(positive control)和nc(negative control)作为芯片质控监控杂交过程。
17.优选的，所述常见呼吸道病毒包括甲型流感病毒(以下简称甲流)、乙型流感病毒(以下简称乙流)、呼吸道合胞病毒(以下简称合胞病毒)、腺病毒、鼻病毒和副流感病毒；
18.其中，甲流的正向引物序列如seq id no.1所示、反向引物序列如seq id no.2所示；探针序列如seq id no.3所示；
19.乙流的正向引物序列如seq id no.4所示、反向引物序列如seq id no.5所示；探针序列如seq id no.6所示；
20.合胞病毒的正向引物序列如seq id no.7所示、反向引物序列如seq id no.8所示；探针序列如seq id no.9所示；
21.腺病毒的正向引物序列如seq id no.10所示、反向引物序列如seq id no.11所示；探针序列如seq id no.12所示；
22.鼻病毒的正向引物序列如seq id no.13所示、反向引物序列如seq id no.14所示；探针序列如seq id no.15所示；
23.副流感病毒的正向引物序列如seq id no.16所示、反向引物序列如seq id no.17所示；探针序列如seq id no.18所示。
24.优选的，所述样本处理具体为：取鼻/咽分泌物拭子于样本保存管中，涡旋震荡后，将所有溶液转移至新的离心管中离心5min后，弃上清。
25.优选的，所述核酸提取具体为：向离心管中加入核酸提取液和蛋白酶k并涡旋震荡15s后，放入56℃恒温金属浴中加热10
‑
15min，再调节温度至95℃加热2min，然后离心5min后，取上清液用作参与pcr反应的核酸溶液。
26.优选的，所述多重pcr加样及扩增具体为：在离心管中加入pcr扩增体系组分，充分混合后得到成多重呼吸道病毒pcr mix，然后在pcr管中加入所述多重呼吸道病毒pcr mix、核酸溶液和双蒸水，配制成pcr扩增溶液，最后将pcr扩增溶液进行扩增，得到pcr扩增产物。
27.优选的，所述膜芯片杂交具体为：步骤
①
，将所述pcr扩增产物加入含杂交液的膜芯片中，45℃加热30min；步骤
②
，加入杂交清洗液，52℃加热3min；步骤
③
，重复步骤
②
一次；步骤
④
，加入酶标液，42℃加热10min；步骤
⑤
，加入酶标清洗液ⅰ，42℃下加热3min；步骤
⑥
，加入酶标清洗液ⅱ，37℃加热3min；步骤
⑦
，重复步骤
⑥
一次；步骤
⑧
，加入显色液，37℃加热10min；步骤
⑨
，加入显色清洗液，37℃加热1min，步骤
⑩
，重复步骤
⑨
两次，其中，步骤
①
、
②
、
④
、
⑤
、
⑥
、
⑧
、
⑨
中的各步加热后均通过离心去除反应液。
28.优选的，所述pcr扩增体系组分为ung酶、datp、dttp、dctp、dgtp、dutp、taq dna聚合酶、反转录酶、pcr缓冲液和引物，所述pcr缓冲液主要为镁离子溶液，还包括钾离子、甜菜碱；多重pcr体系中包含一段与pc探针互补的含5
’‑
biotin修饰的pos
‑
oligo序列，用于与pc探针杂交，质控杂交过程。
29.优选的，所述甲型流感病毒包括甲型h1n1
‑
2009、季节性甲流h1n1、甲流h3n2、甲流h7n9亚型、所述乙型流感病毒包括乙流yamagata、victoria亚型、所述呼吸道合胞病毒包括呼吸道合胞病毒a、b亚型、所述腺病毒包括人腺病毒3、4、7、55亚型、所述副流感病毒包括人副流感病毒1，2，3亚型。
30.优选的，所述杂交液组成成分为2
×
sspe，0.1％sds，30％去离子甲酰胺。
31.杂交清洗液组成成分为2
×
sspe，0.5％sds。
32.酶标液组成成分为2
×
sspe，0.5％sds，0.4μg/mlap
‑
sa。
33.酶标清洗液ⅰ组成成分为2
×
sspe，0.5％sds。
34.酶标清洗液ⅱ组成成分为1m tris
‑
hcl，5mnacl，1m mgcl2。
35.显色液组成成分为0.15mg/ml bcip，0.30mg/ml nbt，100mmol/l tris
‑
hcl，5mmol/l mgcl2。
36.显色清洗液组成成分为1
×
pbs。
37.本发明的有益技术效果：
38.本发明提供的一种基于基因膜芯片的多种呼吸道病毒检测方法，具备以下有益效果：
39.1、该一种基于基因膜芯片的多种呼吸道病毒检测方法，通过结合多重pcr和反向斑点杂交技术实现检测单个呼吸道样本中多种呼吸道病毒的筛检，结合全自动核酸分子杂交仪及其配套的杂交试剂体系，可实现单次反应同时检测样本中多种呼吸道病原体并自动出具检测结果报告，操作简单，检测灵敏度高，能在4个小时内完成1
‑
24个样本的检测，大大节省了检测试剂成本和人力成本。
40.2、该一种基于基因膜芯片的多种呼吸道病毒检测方法，使用ung酶可有效降解pcr产物中含尿嘧啶的序列，在pcr反应液配制时，将dutp和dttp按一定的比例混用，使得扩增产物含有脱氧尿嘧啶，这种产物对ung酶敏感，所以可以在pcr前对新配制的反应体系用ung酶处理，可在一定程度上防止气溶胶污染。
41.3、该一种基于基因膜芯片的多种呼吸道病毒检测方法，通过以gapdh作为内对照监控核酸提取、pcr过程，pc和nc作为芯片质控监控杂交过程，保证了检测结果的特异性和准确性。
附图说明
42.图1为本发明整体点阵图。
43.图2为本发明引物比例调试检测结果图。
44.图3为体系性能测试点阵图。
45.图4为本发明特异性检测结果图
46.图5为本发明检测限检测结果图。
47.图6为本发明稳定性检测结果图。
48.图7为本发明检测方法获得的检测结果报告模板。
具体实施方式
49.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
50.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
51.实施例基于基因膜芯片的多种呼吸道病毒检测方法
52.s1、序列分析及引物设计：根据目的检测靶标选取检测物种特异并与其他物种差异大的序列作为目的片段设计备选引物，选取的方法为查找相关资料及特异序列，利用相关软件或数据库如primer、oligo、ncbi blast等进行序列分析，不同于普通的单重引物体系，只要单引物扩增效率高即可，设计多重反应引物时需注意，除了考虑引物自身的情况，还要考虑不同引物之间的相互作用、引物错配、引物竞争等情况；
53.s2、引物效果测试：用标准模板测试引物扩增效率，选取扩增效率高的引物，再将所选引物进行特异性测试，选择扩增效率高且扩增非目的靶标模板无非特异扩增的引物，特异性测试的具体实现方法为：以非目的靶标模板，如检测靶标为甲流，筛选出引物后，用甲流引物来扩增乙流、合胞病毒、腺病毒、鼻病毒、副流感病毒、肺炎支原体、立克次体、肺炎衣原体等非目的靶标模板，电泳检测，选择扩增效率高且无非特异扩增的引物；最终引物序列如表1所示：
54.表1 7种呼吸道常见病毒引物序列
[0055][0056]
[0057]
pc及pos
‑
oligo序列如表2所示：
[0058]
表2质控探针序列
[0059][0060]
pcr扩增体系组分为：ung酶、datp、dttp、dctp、dgtp、dutp、taq dna聚合酶、反转录酶、pcr缓冲液(mg
2
)、引物、核酸模板、双蒸水，其中所述pcr缓冲液主要为镁离子溶液，还包括钾离子、甜菜碱等；各组分的具体配制情况如下表3所示：
[0061]
表3 pcr扩增体系组分及比例(50μl体系)
[0062][0063][0064]
pcr扩增体系组分及比例(50μl体系)扩增程序如表4所示：
[0065]
表4 pcr扩增过程
[0066][0067]
反向斑点杂交技术；
[0068]
s3、序列分析及杂交探针设计：根据目的检测靶标尤其是扩增产物序列利用相关软件或数据库如primer、oligo、dnaman、dnastar等进行产物序列分析，根据杂交探针设计相关原则设计特异杂交探针；
[0069]
杂交效果测试；
[0070]
s4、膜芯片处理：将带负电荷的尼龙膜裁切成20
×
24cm大小，用打印机在膜上打印出边长11.5cm的正方形表格；在94ml1
×
pbs溶液中加入50％戊二醛溶液6ml；把打印好的膜浸泡于含戊二醛的pbs溶液中，摇床缓慢震荡孵育2小时，倒掉溶液；用1
×
pbs洗膜4次，每次震荡孵育5分钟；最后将膜放置在空气中干燥后密封或在真空干燥器中保存；
[0071]
s5、探针点制：根据nanodrop测定探针浓度值，用已加入适量丽春红染料、ph为8.4的nahco3溶液将探针稀释至15μm，总体积为70/100μl(点样量为155时体积为70μl，点样量为155
×
2时体积为100μl)；按点样顺序将探针分别加入点样仪上指定384孔点样板中，根据点制芯片行列数调用已编制好的点样程序，调整点样针起始位置及其他参数后点样；点样结束后将芯片置于80℃烘箱中烘烤1.5h，以增强探针与膜交联；
[0072]
s6、去活化处理：将点有探针的尼龙膜浸泡于0.1m的naoh溶液中，10分钟后取出放置于60℃预热的杂交液(2
×
sspe，0.1％sds)中浸泡5分钟，最后将膜放置在60℃烘箱中烘干1.5h；
[0073]
s7、膜芯片杂交：用上述筛选出的引物(对应引物进行生物素标记)分别扩增后进行杂交，根据膜芯片核酸分子杂交仪自动分析杂交效果，选择杂交探针灰度值≥60，且无非目的靶标探针显色的探针作为备选探针；
[0074]
杂交试剂和流程为：
[0075]
步骤1、pcr产物于95℃热变性5min，放置冰上冷却后转移至含杂交液的杂交管中，混匀，将杂交管中所有溶液转移至膜芯片中，45℃加热30min；杂交液的组成成分为：2
×
sspe，0.1％sds和30％去离子甲酰胺；
[0076]
步骤2、在上述膜芯片中加入杂交清洗液，52℃加热3min；杂交清洗液的组成成分为：2
×
sspe和0.5％sds；
[0077]
步骤3、重复步骤2一次；
[0078]
步骤4、在上述膜芯片中加入酶标液，42℃加热10min；酶标液的组成成分为：2
×
sspe、0.5％sds和0.4μg/ml ap
‑
sa，现配现用；
[0079]
步骤5、在上述膜芯片中加入酶标清洗液ⅰ，42℃加热3min；所述酶标清洗液ⅰ的组成成分为：2
×
sspe和0.5％sds；
[0080]
步骤6、在上述膜芯片中加入酶标清洗液ⅱ，37℃加热3min；酶标清洗液ⅱ的组成成分为：1mtris
‑
hcl、5mnacl和1m mgcl2；
[0081]
步骤7、重复步骤6一次；
[0082]
步骤8、在上述膜芯片中加入显色液，37℃加热10min；显色液的组成成分为：0.15mg/mlbcip、0.30mg/mlnbt、100mmol/l tris
‑
hcl、5mmol/l mgcl2；
[0083]
步骤9、在上述膜芯片中加入显色清洗液，37℃加热1min；显色清洗液的组成成分为：1
×
pbs；
[0084]
步骤10、重复步骤9两次；
[0085]
其中，步骤1、步骤2、步骤4、步骤5、步骤6、步骤8、步骤9的各步加热反应后均通过离心去除反应液。
[0086]
上述杂交液、杂交清洗液、酶标液、酶标清洗液ⅰ、酶标清洗液ⅱ、显色液、显色清洗液的容积均为150
‑
250μl，优选200μl。
[0087]
试剂和流程如表5所示：
[0088]
表5杂交检测过程
[0089]
序号杂交试剂杂交流程反应温度反应时间循环数1buffer a(杂交液)杂交45℃30min12buffer b(杂交清洗液)杂交清洗52℃3min23buffer c(酶标液)酶标42℃10min14buffer d(酶标清洗液ⅰ)酶标清洗142℃3min15buffer e(酶标清洗液ⅱ)酶标清洗237℃3min26buffer f(显色液)显色37℃10min17buffer g(显色清洗液)显色清洗37℃1min3
[0090]
最终选择的探针序列如表6所示:
[0091]
表6各病毒探针序列
[0092][0093]
s8、体系优化：使用上述筛选出的各引物均以0.2μm为起始工作浓度，配制成多重pcr引物mix，配制好后，使用上述各靶标模板，按照检测流程进行体系效果的测试并进行引物比例的调试，再根据整体检测结果(如图2所述，图2中(1)为甲流0.2μm/0.2μm，(2)为甲流0.6μm/0.4μm，(3)为腺病毒0.2μm/0.2μm，(4)为腺病毒0.2μm/0.3μm，(5)为鼻病毒0.2μm/0.2μm，(6)为鼻病毒0.2μm/0.3μm)进行个别靶标引物浓度的调试；调整后的引物终浓度如表7所示：
[0094]
表7各病毒引物浓度
[0095][0096]
s9、样本前处理：取鼻/咽分泌物拭子于1ml含样本保存液的样本保存管中，涡旋震荡15s充分洗涤后将所有液体转移至1.5ml的离心管中，12000rpm离心5min，弃上清；
[0097]
s10、核酸提取：向离心管中加入50μl核酸提取液、3μl蛋白酶k，涡旋震荡15s，56℃金属浴加热10
‑
15min，然后95℃加热2min。12000rpm离心5min，取上清液作为核酸溶液进行多重pcr扩增反应；
[0098]
s11、pcr扩增：按pcr扩增体系组分及比例配制成多重呼吸道病毒pcr mix，进行多重pcr加样及扩增，pcr扩增体系为50μl体系，引物mix按照调整后各引物终浓度进行配制；
[0099]
所述多重pcr加样的流程为：
[0100]
一、首先在pcr管中加入26μl多重呼吸道病毒pcr mix；
[0101]
二、再在pcr管中加入2
‑
5μl步骤s10中所得的核酸溶液；
[0102]
三、最后在pcr管中补足双蒸水至溶液总容积为50μl。
[0103]
多重pcr加样(50μl)各组分体积如表8所示：
[0104]
表8多重pcr加样各组分体积
[0105]
序号组分名称加入体积/体系备注
1多重呼吸道病毒pcr mix26μl 2样本核酸2
‑
5μl* 3ddh2o补足50μl [0106]
样本核酸为样本初提液，加入体积一般为反应体系的5％
‑
10％，加入体积过大可能引入过多的pcr抑制剂，影响pcr反应。多重pcr扩增程序中对应的参数设置如表9所示。
[0107]
表9多重pcr扩增程序
[0108][0109]
s12、膜芯片杂交：使用上述pcr扩增产物进行膜芯片杂交检测；
[0110]
s13、检测结果判读：以gapdh作为内参对照监控核酸提取、pcr过程，pc和nc作为芯片质控监控杂交过程，结合仪器的自动判读及出具检测结果，结果图例如图2所示。
[0111]
本实施例中，目的检测标靶为甲流、乙流、合胞病毒、腺病毒、鼻病毒、副流感病毒。所述甲流包括甲型h1n1
‑
2009、季节性甲流h1n1、甲流h3n2、甲流h7n9亚型、所述乙流包括乙流yamagata、victoria亚型、所述呼吸道合胞病毒包括呼吸道合胞病毒a、b亚型、所述腺病毒包括人腺病毒3、4、7、55亚型、所述副流感病毒包括人副流感病毒1，2，3亚型。
[0112]
进一步的是，s2中标准模板测试引物扩增效率具体方法为，选取临界模板浓度以上1
‑
2个浓度梯度的模板进行测试，比如试剂盒研发目的检测限为1.0e 03copies/ml，则引物测试选取1.0e 04～1.0e 05copies/ml浓度的模板，检测方法为凝胶电泳，目的产物浓度最好达到50ng/μl以上。
[0113]
更进一步的是，pc和nc作为芯片质控监控杂交过程的具体方法为：设计一段与靶标序列均无关的positivecontrol probe(阳性对照探针)，同各检测靶标探针一并点制于膜芯片上，并在体系中加入与阳性对照探针互补配对且带上生物素修饰的一段pos
‑
oligo寡核苷酸，作为杂交反应过程中的阳性质控；此外，还设计了一段与靶标序列均无关的negativecontrol probe(阴性对照探针)，同各检测靶标探针及阳性对照探针一并点制于膜芯片上，作为杂交反应过程中的阴性质控。
[0114]
值得注意的是，s8中的各靶标引物中均包含一条带5’生物素修饰的引物。
[0115]
实验例：根据已经建立的检测体系，进行特异性测试、检测限、稳定性测试，测试系统检测性能，探针布局如图3所示；
[0116]
特异性测试：使用调整好的多重pcr引物mix分别扩增甲流、乙流、合胞病毒、腺病毒、鼻病毒、副流感病毒、肺炎支原体、立克次体、肺炎衣原体的核酸；杂交测试结果如图4所示，能够快速分析健康人中得出阴性检测的样本占健康人总数的百分比；
[0117]
检测限：分别使用ia
‑
1.0e 03copies/ml、ib
‑
1.0e 04copies/ml、rsv
‑
1.0e 04copies/ml、hadv
‑
1.0e 04copies/ml、hrv
‑
1.0e 04copies/ml、hpiv
‑
1.0e 04copies/ml临界浓度的病毒核酸进行多重pcr加样、扩增及杂交检测；结果如图5所示；
[0118]
稳定性测试：分别对甲流
‑
1.0e 03copies/ml(1)、乙流
‑
1.0e 04copies/ml(2)、合胞病毒
‑
1.0e 04copies/ml(3)、腺病毒
‑
1.0e 04copies/ml(4)、鼻病毒
‑
1.0e 04copies/ml(5)、副流感病毒
‑
1.0e 04copies/ml(6)使用检出限浓度的样本进行稳定性测试，每个样本同时测3次；测试结果如图6所示。
[0119]
综上所述，该一种基于基因膜芯片的多种呼吸道病毒检测方法，通过结合多重pcr和反向斑点杂交技术实现单个呼吸道样本中多个呼吸道病毒的筛检，结合全自动核酸分子杂交仪及其配套的杂交试剂体系，可实现样本中多种呼吸道病原体的自动化筛检并同时出具检测结果报告，示例性的检测报告模板如说明书图7所示，操作简单，检测灵敏度高(ia检测限为1.0e 03copies/ml，其余靶标检测限为1.0e 04copies/ml)，能在4个小时内完成1
‑
24个样本的检测，大大节省了检测试剂成本和人力成本；使用ung酶可有效降解pcr产物中含尿嘧啶的序列，在pcr反应液配制时，将dutp和dttp按一定的比例混用，使得扩增产物含有脱氧尿嘧啶，这种产物对ung酶敏感，所以可以在pcr前对新配制的反应体系用ung酶处理，可在一定程度上防止气溶胶污染；通过以gapdh作为内参对照监控核酸提取、pcr过程，pc和nc作为芯片质控监控杂交过程，保证了检测结果的特异性和准确性。
[0120]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。