一种辅助治疗NAFLD的南极磷虾寡肽及其应用的制作方法

一种辅助治疗nafld的南极磷虾寡肽及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种辅助治疗非酒精性脂肪性肝病(nafld)的南极磷虾寡肽。


背景技术：

2.非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，nafld)是一种脂肪过度积累(≥5％肝细胞重量)、且与胰岛素抵抗(insulin resistance，ir)和遗传易感密切相关的代谢应激性肝损伤。nafld不仅可以导致肝病残疾和死亡，还与代谢综合征、2型糖尿病、心血管疾病、结直肠肿瘤等的高发密切相关，而且乙型肝炎病毒(hbv)慢性感染者常合并nafld。据估计，2018年全球约25％的人口患有nafld，其中10％
‑
20％为nash，后者10年内肝硬化发生率高达25％。随着我国肥胖和代谢综合征人群的快速增加，nafld已成为我国第一大慢性肝病和健康体检肝脏生物化学指标异常的首要原因，但临床上尚无有效治疗nafld的药物。因此，针对nafld发生发展的分子机制(脂质沉积、氧化损伤、炎症反应)开发高效的治疗药物成为研究的焦点。
3.南极磷虾的蕴藏量巨大，据1981～1990年，多个国家参加的两次《南大洋生物资源储量调查》统计，南大洋磷虾资源的蕴藏量保守的估算也有6～10亿吨，也有人估计有50亿吨之多。就以6～10亿吨的保守储量为基础，人类每年在南大洋捕捞0.6～1.0亿吨的南极磷虾资源量，而不会影响南大洋生物链的平衡，这一年度捕获量相当于全世界海洋水产品年捕获量的两倍，是南极最先提供给人类开发利用的资源。当前，已有俄罗斯、日本、波兰、挪威等国率先在南大洋进行南极磷虾的初级商业性捕捞。所以，南极磷虾资源被喻为人类未来的蛋白资源仓库。国内的南极磷虾产业龙头企业暂时主要集中在山东、辽宁、上海等地。辽宁远航渔业以加工虾丸、虾肉肠等食用产品为主，技术也在迅速提高中。上海南极磷虾企业以出口贸易为主。中国的南极磷虾产业发展势头良好，将成为世界主要南极磷虾产业发展地之一。但是，目前尚未见关于利用南极磷虾制备nafld治疗或者辅助治疗相关的药物或功能产品。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种可用于制备药品、保健食品和作为食品添加剂的辅助治疗nafld的南极磷虾寡肽。为达到上述发明目的，采用如下技术方案：
5.本发明公开了一种辅助治疗非酒精性脂肪性肝病(nafld)的南极磷虾寡肽的氨基酸序列为phe
‑
trp
‑
lys
‑
val
‑
val
‑
ile
‑
ala
‑
pro
‑
trp，单字母表示为：fwkvviapw。本发明南极磷虾寡肽可显著降低nafld细胞模型中活性氧自由基(ros)、甘油三酯(tg)和总胆固醇(tc)含量，具有显著的降脂和消除氧化应激损伤的功效，此外，本发明南极磷虾寡肽具有安全无毒副作用、降脂活性强等优点，可以制备药品和保健食品。
6.优选地，寡肽的相对分子质量为1145.4da。
7.本发明公开了一种上述南极磷虾寡肽的用途，具有以下至少一种：
8.(1)降低细胞中活性氧自由基的含量；
9.(2)降低细胞中甘油三酯的含量；
10.(3)降低细胞中总胆固醇的含量；
11.(4)降血脂；
12.(5)消除氧化应激损伤；
13.(6)制备辅助治疗nafld的药物；
14.(7)制备辅助治疗nafld的保健品；
15.(8)作为食品添加剂。
16.本发明还公开了一种制备辅助治疗nafld的南极磷虾寡肽的方法，包括如下步骤：
17.(1)南极磷虾预处理；
18.(2)南极磷虾虾粉的酶解；
19.(3)超滤收集不同组分；
20.(4)制备超滤酶解物；
21.(5)凝胶柱层析；
22.(6)反相高效液相色谱纯化。
23.优选地，步骤(1)中预处理包括脱脂。
24.更优选地，南极磷虾解冻，去头和皮、组织绞碎，按料液比1
‑
3g:5～40ml加入92
‑
98％乙醇溶液，组织捣碎机捣碎，110
‑
120w超声45
‑
60min脱脂，重复三次，过滤，固体物干燥，得脱脂虾粉。
25.更进一步优选地，南极磷虾预处理包括如下步骤：
26.南极磷虾解冻，去头和皮、组织绞碎，按料液比1g:5～8ml加入95％乙醇溶液，组织捣碎机捣碎，120w超声45
‑
60min脱脂，重复三次，过滤，固体物干燥，得脱脂虾粉。
27.优选地，步骤(2)中使用中性蛋白酶进行酶解，所述中性蛋白酶的酶活力≥5.0
×
104。
28.更优选地，南极磷虾虾粉的酶解包括如下步骤：
29.将上述南极磷虾虾粉按照料液比1g:8～10ml加入到磷酸盐缓冲液(0.5mol/l，ph7.0)中，搅匀，溶液调温至45～50℃，加入虾粉重量2.0～3.0％蛋白酶，酶解5～8h，溶液于90～100℃水浴中保温5～30min，冷却至常温，离心，收集上清液，即南极磷虾蛋白酶解液。
30.更进一步优选地，南极磷虾虾粉的酶解包括如下步骤：
31.将上述南极磷虾虾粉按照料液比1g:8～10ml加入到磷酸盐缓冲液(0.5mol/l，ph7.0)中，搅匀，溶液调温至45～50℃，加入虾粉重量2.0～3.0％蛋白酶，酶解5～8h，溶液于90～100℃水浴中保温10min，冷却至常温，9000rmp离心15min，收集上清液，即南极磷虾蛋白酶解液。
32.优选地，步骤(3)中使用的超滤膜的截留分子量为3.5kda。
33.更优选地，超滤收集不同组分包括如下步骤：
34.将上述南极磷虾蛋白酶解液经截留分子量为3.5kda的超滤膜进行分级，收集分级组分。
35.优选地，步骤(4)中使用的nafld细胞模型为hepg2细胞株。
36.更优选地，制备超滤酶解物包括如下步骤：
37.测定超滤所得的各个组分对降低nafld细胞模型中脂质堆积和活性氧自由基(ros)水平的能力，选择活性最好的组分冻干，得超滤酶解物。
38.更优选地，凝胶柱层析包括如下步骤：
39.将超滤酶解物溶于双蒸水配成浓度为20～25mg/ml的溶液，经过葡聚糖凝胶sephadex g
‑
25柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，流速0.5～0.8ml/min，根据220nm下的吸光度制作凝胶层析色谱图，收集各色谱峰，测定各个色谱峰组分降低nafld细胞模型中脂质堆积和活性氧自由基水平的能力，选择活性最好的色谱峰组分，冻干，得凝胶层析酶解物。
40.更优选地，rp
‑
hplc纯化包括如下步骤：
41.将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成45～50μg/ml的溶液，利用rp
‑
hplc进行纯化，根据制备肽的活性得1个高活性辅助治疗nafld的寡肽phe
‑
trp
‑
lys
‑
val
‑
val
‑
ile
‑
ala
‑
pro
‑
trp，esi
‑
ms测定分子量为1145.4da。
42.更进一步优选地，rp
‑
hplc条件为：
43.进样量10～15μl；色谱柱kromasil c18(250mm
×
4.6mm，5μm)；流动相：60％乙腈；洗脱速度0.5～0.8ml/min；紫外检测波长220nm。
44.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
45.本发明南极磷虾寡肽可显著降低nafld细胞模型中活性氧自由基、甘油三酯和总胆固醇含量，具有显著的降脂和消除氧化应激损伤的功效，此外，本发明南极磷虾寡肽具有安全无毒副作用、降脂活性强等优点，可以制备药品和保健食品。
附图说明
46.图1为南极磷虾酶解液超滤组分在10mg/ml浓度下对nafld细胞模型中脂质堆积的影响；
47.图2为南极磷虾酶解液超滤组分在10mg/ml浓度下对nafld细胞模型中活性氧自由基含量的影响；
48.图3为葡聚糖凝胶sephadex g
‑
25层析图；
49.图4为葡聚糖凝胶sephadex g
‑
25制备酶解物组分在10mg/ml浓度下对nafld细胞模型中脂质堆积的影响；
50.图5为葡聚糖凝胶sephadex g
‑
25制备酶解物组分在10mg/ml浓度下对nafld细胞模型中活性氧自由基含量的影响；
51.图6为葡聚糖凝胶sephadex g
‑
25制备酶解物的rp
‑
hplc分析；
52.图7为rp
‑
hplc分离组分在10mg/ml浓度下对nafld细胞模型中脂质堆积的影响；
53.图8为rp
‑
hplc分离组分在10mg/ml浓度下对nafld细胞模型中活性氧自由基含量的影响；
54.图9为fwkvviapw的结构；
55.图10为fwkvviapw的质谱图；
56.图11为fwkvviapw对nafld细胞模型中甘油三酯含量的影响；
57.图12为fwkvviapw对nafld细胞模型中总胆固醇含量的影响。
具体实施方式
58.这里将详细地对示例性实施例进行说明，以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本公开相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本公开的一些方面相一致的方法的例子。
59.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
60.实施例1
61.人肝癌细胞hepg2细胞模型的建立与实验分组
62.用含10％胎牛血清(fbs)的rpmi1640培养基培养人肝癌细胞hepg2细胞。取对数生长期的hl7702细胞制成悬液，接种至96孔板，每孔200μl，于37℃，5％co2培养箱中贴壁5h。将培养细胞分为4组：
①
空白对照组：含10％胎牛血清(fbs)的rpmi1640培养基培养24h；
②
模型组：1.0mm的游离脂肪酸(油酸：棕榈酸＝2:1)的rpmi1640培养基培养24h；
③
阳性对照组：1.0mm的ffa和gsh(20μm)的rpmi1640培养基培养24h；
④
样品组：1.0mm的游离脂肪酸和样品的rpmi1640培养基培养24h。
63.实施例2
64.制备辅助治疗nafld的南极磷虾寡肽，具体步骤为：
65.1)南极磷虾预处理：南极磷虾解冻，去头和皮、绞碎，按料液比1g:6ml加入95％乙醇溶液，组织捣碎机捣碎，120w超声60min脱脂，重复三次，过滤，固体物干燥，得脱脂虾粉。
66.2)南极磷虾虾粉的酶解：将上述脱脂虾粉按照料液比1g:10ml加入到磷酸盐缓冲液(0.5mol/l，ph7.0)中，搅匀，溶液调温至45℃，加入虾粉重量2.5％中性蛋白酶(酶活力≥5.0
×
104)，酶解6h，溶液于95℃水浴中保温10min，冷却至常温，9000rmp离心15min，收集上清液，即南极磷虾蛋白酶解液(aph)。
67.3)南极磷虾寡肽的制备：将南极磷虾蛋白酶解液经截留分子量为3.5kda的超滤膜进行分级，收集分级组分aph1(mw≤3.5kda)和aph2(mw≥3.5kda)，测定各组分降低nafld细胞模型中脂质堆积和活性氧自由基含量的能力；测定步骤如下：
68.测定各组分降低细胞模型中脂质堆积的能力：
69.按实施例1所述方法将空白对照组、模型组、阳性对照组、样品组hepg2细胞孵育24h后，弃掉培养基，用pbs(室温)缓冲液洗1次，弃pbs，每孔加入70μl 4％多聚甲醛固定液室温避光固定30min，弃多聚甲醛，pbs洗1次，弃pbs，60％异丙醇60μl/孔润洗10min，弃异丙醇，然后每孔加入60μl 0.3％油红o染液室温避光染色1h，弃油红o，pbs缓冲液洗3次，弃pbs；用dmso溶解，100μl/孔，酶标仪358nm处测od值。将空白组设置为100％，其余各组的脂质堆积水平(％空白组)＝(od样品组/od空白组)
×
100％。将实验结果计算并整理后绘制成图1，由图1可知aph1活性最好，降低脂质含量的能力最强。
70.测定各组分降低细胞模型中活性氧自由基的能力：
71.按实施例1所述方法将空白对照组、模型组、阳性对照组、样品组hepg2细胞孵育24h后，加入10μl荧光探针dcfh
‑
da，于37℃、5％co2细胞恒温培养箱中避光孵育2h。经冰凉的pbs缓冲液轻柔洗涤细胞，重复两次。于暗室中，通过荧光倒置显微镜(激发波长为485nm/发射波长为535nm)观察、拍摄细胞形态。使用荧光酶标仪测定光强，并统计学分析数据。测试结果经处理后绘制成图2，由图2可知aph1活性最好，降低活性氧自由基的能力最强。
72.由测定结果可以判断，应取组分aph1进行后续制备步骤。将aph1冻干后依次经凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化，得到辅助治疗非酒精性脂肪性肝病的南极磷虾寡肽。具体步骤如下：
73.凝胶色谱层析：将上述aph1用双蒸水配成浓度为20mg/ml的溶液，经过葡聚糖凝胶sephadex lh
‑
20柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据220nm下的吸光度曲线收集洗脱组分aph1
‑
a、aph1
‑
b和aph1
‑
c，层析结果见图3；测定3个组分对nafld细胞模型中脂质堆积和活性氧自由基水平的影响，测定结果见图4和图5，可知选择活性最好的色谱峰组分aph1
‑
b，冻干，得凝胶层析酶解物。
74.rp
‑
hplc精制：将上述aph1
‑
b用双蒸水配成浓度为50μg/ml的溶液，用rp
‑
hplc进行纯化(进样量20μl；色谱柱kromasil c18(250mm
×
4.6mm，5μm)；流动相60％乙腈；紫外检测波长220nm)，根据220nm下的吸光度曲线收集寡肽aph
‑
p1、aph
‑
p2、aph
‑
p3、aph
‑
p4和aph
‑
p5，rp
‑
hplc测定结果见图6；测定5个寡肽对nafld细胞模型中脂质堆积和活性氧自由基水平的影响；测定结果见图7和图8，可知aph
‑
p3在降低细胞模型中脂质堆积和清除细胞活性氧自由基的效果最好，因此取aph
‑
p3为辅助治疗nafld的高活性寡肽。
75.由以上制备过程可知，所制得的南极磷虾寡肽具有良好的降低细胞内脂质堆积水平和降低活性氧自由基的能力，进而说明南极磷虾寡肽具有消除氧化应激损伤的功效。
76.试验例1
77.南极磷虾寡肽氨基酸序列及分子量的测定
78.取实施例2中的aph
‑
p3，采用edman降解法，用abi 494蛋白/多肽测序仪测定所得多肽的氨基酸序列，测定结果见图9。使用esi
‑
ms测定分子量，测定结果见图10。经测定，氨基酸序列为phe
‑
trp
‑
lys
‑
val
‑
val
‑
ile
‑
ala
‑
pro
‑
trp，单字母表示为：fwkvviapw，分子量为1145.4da。
79.试验例2
80.南极磷虾寡肽性对细胞中甘油三酯和总胆固醇含量的影响
81.使用细胞总胆固醇和甘油三酯定量试剂盒按照制造商提供的使用说明进行细胞内甘油三酯和总胆固醇的量，并使用bca蛋白定量试剂盒按照制造商提供的使用说明测定样品中的蛋白含量。进而计算细胞内的甘油三酯和总胆固醇含量。具体操作步骤如下：
82.1)甘油三酯(tc)含量测定
83.①
样品制备：双蒸水配制含5％np
‑
40的细胞裂解液，取106个细胞为一个样本，加入100μl裂解液，放入金属浴中，并开始升温，到90℃后维持5min直到裂解液浑浊(此时可同时加热标准品)。然后冷却到室温，重复加热一次，90℃，5min。微型离心机上低速离心2min。同时，取平行样本进行bca蛋白含量测定。离心完的样品取适量用双蒸水稀释10倍，然后取稀释后的样品20μl加到96孔板中，用缓冲液补足体积到50μl。
84.②
做标准曲线：甘油三酯标准品需90℃加热1min直到浑浊，微型离心机离心30秒，直到澄清。然后重复加热并离心一次。甘油三酯标准品取40μl加到160μl缓冲液中混匀，稀释成0.2mm。取0、10、20、30、40和50μl加到96孔板中，用缓冲液调整成终体积50μl/孔，终浓度为0、2、4、6、8和10nmol/孔。
85.③
加脂肪酶：每孔加入2μl脂肪酶，震板器上混匀并室温孵育20min。每孔加入酶混合液，室温孵育60min，避光，测od570。
86.实验结果经计算和整理后总结为图11。
87.2)总胆固醇(tg)含量测定
88.①
样品制备：
89.氯仿：异丙醇：np
‑
40按7:11:0.1(1.4ml:2.2ml:0.02ml)体积比制备细胞裂解液。取106个细胞为一个样本，加入200μl裂解液用枪头底部刮(一个孔一个孔的裂解)。转移至ep管，15000g离心5
‑
10分钟后取上清转移到新的ep管中，50℃烘干除去氯仿。(同时，取平行样本进行bca蛋白含量测定)。烘干后真空中放置30min以彻底去除有机溶剂(此时做标准曲线)。加入200μl缓冲液涡旋混匀。取42μl样品用于实验，buffer补足体积到50ul/孔。
90.a：42μl样品 8μl buffer
91.b：42μl样品 8μl标准品(0.25μg/μl)
92.②
做标准曲线：
93.胆固醇标准品(放冰上)取20μl加到140μl缓冲液中混匀，稀释成0.25μg/μl。取0、4、8、12、16和20μl加到96孔板中，用缓冲液调整50、46、42、38、34和30μl成终体积50μl/孔，终浓度为0、1、2、3、4和5μg/孔。每个样本孔需另外加入50μl酶混合液37℃孵育60min，避光，测od570。
94.实验结果经计算和整理后总结为图12。
95.由图11和图12可知，fwkvviapw组的甘油三酯含量和总胆固醇含量较模型组有大幅下降，接近正常细胞。说明南极磷虾寡肽可显著降低nafld细胞模型中甘油三酯和总胆固醇含量，由此说明南极磷虾寡肽可以减少细胞中脂质的堆积，发挥降脂的作用。
96.以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。