生产N-乙酰基-5-甲氧基色胺的基因工程菌、构建方法及应用与流程

生产n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺的基因工程菌、构建方法及应用
技术领域
1.本发明属于基因工程领域，涉及生产n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺的基因工程菌、构建方法及应用。


背景技术：

2.n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺(褪黑素)在脊椎动物中是一种由松果体在大脑中产生的激素，可调节动物的行为功能和昼夜节律。研究发现除脊椎动物之外、n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺还存在于所有已知生物体中，包括细菌，昆虫，真菌，动物和植物。n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺发挥着多种作用，从抗氧化剂活性到动植物的多种生物学功能，例如抗氧化效果、先天免疫、干细胞分化和dna修复等，在植物生长、发育和防御多种非生物和生物胁迫方面也具有多种生理作用。
3.n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺对人体的作用主要体现在改善睡眠和调节情绪，近年来研究发现还具有抗肿瘤、增强免疫、延缓衰老的作用，因此，n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺可做为保健品及疫疗药品使用。迄今为止，美国、加拿大、英国等国家把人工合成的n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺用做食品添加剂或药物，因此富含天然n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺的食品备受关注。
4.生物体中存在的n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺虽然安全可靠，但因其含量极少，使得天然n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺提取成本过高。化学合成法虽然能大量生产n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺，但却有着不可忽视的缺点：生产过程中用到有毒物质、合成步骤复杂繁琐、副产物过多、纯度低。相较与以上两种方法，生物合成n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺具有操作简便、无污染、产品质量稳定等优点。利用生物法合成n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺可弥补化学合成法不足之处，提高n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺产品质量。


技术实现要素：

5.本发明的一个目的在于提供一种用于生产n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺的基因工程菌。本发明的另一个目的在于提供一种上述基因工程菌的构建方法。本发明再一个目的在于提供一种n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺的生产方法，利用上述基因工程菌进行n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺的生物合成。
6.为实现上述发明目的，本发明包括以下内容：
7.提供一种生产n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺的基因工程菌，所述基因工程菌包含咖啡酸o
‑
甲基转移酶基因，以及甲硫氨酸腺苷转移酶基因或/和甲硫氨酸合成酶基因，能在细胞内大量表达，生成具有生物活性的咖啡酸o
‑
甲基转移酶，以及甲硫氨酸腺苷转移酶或/和甲硫氨酸合成酶。
8.按上述方案，所述咖啡酸o
‑
甲基转移酶基因源自水稻，其氨基酸序列如seq id no：1所示或由一个至多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与seq id no：1所示的原始序列具有90％以上同源性且功能相同的氨基酸序列；或所述咖啡酸o
‑
甲基转移酶基因源自拟南芥，其氨基酸酸序列如seq id no：2所示或由一个至多个氨基酸残基的取代
和/或缺失和/或添加得到的与seq id no：2所示的原始序列具有90％以上同源性且功能相同的氨基酸序列；或所述咖啡酸o
‑
甲基转移酶基因源自黑麦草，其氨基酸酸序列如seq id no：3所示或由一个至多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与seq id no：3所示的原始序列具有90％以上同源性且功能相同的氨基酸序列。
9.按上述方案，所述甲硫氨酸腺苷转移酶基因源自人，甲硫氨酸腺苷转移酶氨基酸序列如seq id no：4所示或由一个至多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与前述原始序列具有90％以上同源性且功能相同的氨基酸序列；或所述甲硫氨酸腺苷转移酶基因源自羊，甲硫氨酸腺苷转移酶氨基酸序列如seq id no：5所示或由一个至多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与前述原始序列具有90％以上同源性且功能相同的氨基酸序列；或所述甲硫氨酸腺苷转移酶基因源自长春花，甲硫氨酸腺苷转移酶氨基酸序列如seq id no：6所示或由一个至多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与前述原始序列具有90％以上同源性且功能相同的氨基酸序列；或所述甲硫氨酸腺苷转移酶基因源自白杨，甲硫氨酸腺苷转移酶氨基酸序列如seq id no：7所示或由一个至多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与前述原始序列具有90％以上同源性且功能相同的氨基酸序列；或所述甲硫氨酸腺苷转移酶基因源自大肠杆菌，甲硫氨酸腺苷转移酶氨基酸序列如seq id no：8所示或由一个至多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与前述原始序列具有90％以上同源性且功能相同的氨基酸序列；或所述甲硫氨酸腺苷转移酶基因源自弗氏柠檬酸杆菌，甲硫氨酸腺苷转移酶氨基酸序列如seq id no：9所示或由一个至多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与前述原始序列具有90％以上同源性且功能相同的氨基酸序列。
10.按上述方案，所述甲硫氨酸合成酶基因源自人，甲硫氨酸合成酶氨基酸序列如seq id no：10所示或由一个至多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与前述原始序列具有90％以上同源性且功能相同的氨基酸序列；或所述甲硫氨酸合成酶基因源自马铃薯，甲硫氨酸合成酶氨基酸序列如seq id no：11所示或由一个至多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与前述原始序列具有90％以上同源性且功能相同的氨基酸序列；或所述甲硫氨酸合成酶基因源自大肠杆菌，甲硫氨酸合成酶氨基酸序列如seq id no：12所示或由一个至多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与前述原始序列具有90％以上同源性且功能相同的氨基酸序列；或所述甲硫氨酸合成酶基因源自铜绿假单胞菌，甲硫氨酸合成酶氨基酸序列如seq id no：13所示或由一个至多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与前述原始序列具有90％以上同源性且功能相同的氨基酸序列。
11.按上述方案，上述咖啡酸o
‑
甲基转移酶基因如seq id no：14、seq id no：15或seq id no：16所示；甲硫氨酸腺苷转移酶基因序列如seq id no：17、seq id no：18、seq id no：19、seq id no：20、seq id no：21或seq id no：22所示；甲硫氨酸合成酶如seq id no：23、seq id no：24、seq id no：25或seq id no：26所示。
12.提供一种生产n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺的基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌包含咖啡酸o
‑
甲基转移酶基因，能在细胞内大量表达，生成具有生物活性的咖啡酸o
‑
甲基转移酶，所述咖啡酸o
‑
甲基转移酶基因源自黑麦草，核苷酸序列如seq id no：16所示，氨基酸序列如seq id no：3所示或由一个至多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到
的与seq id no：3所示的原始序列具有90％以上同源性且功能相同的氨基酸序列。
13.按上述方案，所述基因工程菌为可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞。具体的包括但不限于大肠杆菌(escherichia coli)bl21(de3)或谷氨酸棒状杆菌(corynebacerium glutamicum)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtillis)、黄色短杆菌(brevibacterium flavum)、粘液沙雷氏菌(serratia marcescens)、低等真核细胞酿酒酵母(saccharomyces cerecisiae)、解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)和黑曲霉菌(aspergillus niger)细胞中的任一种。
14.一种上述产n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺的基因工程菌的制备方法，为下述三种方法中的一种：
15.构建包含目的基因咖啡酸o
‑
甲基转移酶基因或/和甲硫氨酸腺苷转移酶基因或/和甲硫氨酸合成酶基因的重组载体，将重组载体转入基因工程菌中得到产n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺的基因工程菌；
16.或将一部分目的基因在工程菌基因组上整合表达，然后将包括另一部分目的基因的重组载体转入到工程菌中，得到生产n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺的基因工程菌；
17.或将全部目的基因串联后插入至基因组ttpr位点，利用t7启动子进行整合表达，得到产n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺的基因工程菌。
18.所述表达载体指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以使用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
19.按上述方案，所述的重组载体的构建中：扩增各咖啡酸o
‑
甲基转移酶comt基因、甲硫氨酸腺苷转移酶mat基因、甲硫氨酸合成酶ms基因的引物序列如下：
20.[0021][0022]
按上述方案，所述的工程菌为大肠杆菌，重组载体化到工程菌的转化方法为：(1)制备化学感受态的大肠杆菌；(2)质粒转化；(3)抗性筛选；和(4)质粒验证。具体步骤可为如下，包括：(1)氯化钙法制备大肠杆菌bl21(de3)化学感受态；(2)热激法转化所述重组质粒进入所述大肠杆菌；(3)在含卡那霉素培养皿上进行筛选；(4)pcr验证质粒转入情况，质粒验证使用多克隆位点两端的通用引物。
[0023]
按上述方案，在基因组上整合表达的方法为：
[0024]
(1)将需要在基因组上整合表达的comt基因、mat基因、ms基因通过无缝克隆连接、并插入至质粒载体的多克隆位点中；(2)利用包含大肠杆菌基因组上trpr基因同源片段的引物扩增包含上述整合表达的基因的表达框；(3)利用同源重组将表达框插入至基因组trpr位点。
[0025]
按上述方案，所述咖啡酸o
‑
甲基转移酶基因、甲硫氨酸腺苷转移酶基因、甲硫氨酸合成酶基因是密码子优化后人工合成的，或未优化之前的dna序列，或经过一个至多个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的dna序列。
[0026]
本发明具体采用了以下构建方法：
[0027]
构建方法一：
[0028]
使用对应扩增用引物扩增第一基因，利用酶切连接方式将所述扩增片段连接至质粒载体中，使用对应扩增用引物扩增第二基因，利用酶切连接方式将所述扩增片段连接至前述包括第一基因的质粒载体中得到包括第一基因和第二基因的重组载体；
[0029]
具体地，如使用第一引物扩增咖啡酸o
‑
甲基转移酶comt基因，利用酶切连接方式将所述扩增片段连接至质粒载体prsfduet
‑
1中得到重组质粒prsfduet1
‑
comt；使用第二引物扩增得到甲硫氨酸腺苷转移酶mat基因，利用酶切连接方式将所述扩增片段连接至质粒载体prsfduet1
‑
comt中得到重组质粒prsfduet1
‑
comt
‑
mat，将重组质粒转化到工程菌中，得到生成n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺的基因工程菌。
[0030]
构建方法二：
[0031]
采用无缝克隆方式以质粒为载体，将comt、mat基因串联表达，得到包含comt和mat基因的重组质粒；
[0032]
将包含comt和mat基因的重组质粒上的完整表达框整合至工程菌基因组上；
[0033]
使用引物扩增咖啡酸o
‑
甲基转移酶基因、将甲硫氨酸合成酶基因插入至质粒中，构建得到含有ms基因的重组质粒，将重组质粒转化上述基因组上整合了comt、mat基因的工程菌，得到过表达咖啡酸o
‑
甲基转移酶基因、甲硫氨酸腺苷转移酶基因和甲硫氨酸合成酶
基因的重组基因工程菌。
[0034]
具体地，如使用引物分别扩增咖啡酸o
‑
甲基转移酶基因、甲硫氨酸腺苷转移酶基因、甲硫氨酸合成酶基因；
[0035]
采用无缝克隆方式以质粒prsfduet
‑
1为载体，将comt、mat基因串联表达，得到重组质粒：prsfduet1
‑
t7
‑
comt
‑
mat；
[0036]
将重组质粒prsfduet1
‑
t7
‑
comt
‑
mat上完整表达框整合至大肠杆菌基因组上，得到大肠杆菌bl21(de3，pt7::comt::mat)；
[0037]
将甲硫氨酸合成酶基因插入至质粒prsfduet
‑
1中，构建得到重组质粒prsfduet1
‑
ms，将重组质粒prsfduet1
‑
ms转化大肠杆菌bl21(de3，pt7::comt::mat)，得到过表达咖啡酸o
‑
甲基转移酶基因、甲硫氨酸腺苷转移酶基因和甲硫氨酸合成酶基因的大肠杆菌。
[0038]
本发明还提供n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺生产方法，包括使用上述任一的基因工程菌生产n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺。
[0039]
按上述方案，上述生产方法具体步骤为：将上述基因工程菌在含有卡那霉素的液体lb培养基中过夜培养，得到种子液；将种子液中的菌体接种至新的的液体lb培养基中培养至od
600
＝0.5
‑
1.0，其中od
600
表示含基因工程菌的溶液在600nm波长处的吸光值；添加诱导剂iptg诱导培养，收集诱导之后的菌体；使用含有底物n
‑
乙酰
‑
5羟色胺的转化液重悬菌体沉淀至od
600
＝5
‑
30，进行全细胞催化，获得n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺。
[0040]
具体地，将上述基因工程菌在含有卡那霉素的液体lb培养基中过夜培养，得到种子液；将种子液中的菌体接种至新的的液体lb培养基中培养至od
600
＝0.6，其中od
600
表示含基因工程菌的溶液在600nm波长处的吸光值；添加诱导剂iptg在37℃、200rpm条件下进行诱导培养16h，收集诱导之后的菌体；使用含有5mm底物n
‑
乙酰
‑
5羟色胺的转化液重悬菌体沉淀至od
600
＝5
‑
30，于37℃、150rpm条件下进行全细胞催化，获得n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺。
[0041]
具体地，所述的全细胞催化时间可为12
‑
48h。
[0042]
本发明通过基因重组技术引入外源物种咖啡酸o
‑
甲基转移酶基因，或进一步地引入甲硫氨酸腺苷转移酶基因或/和甲硫氨酸合成酶基因，将咖啡酸o
‑
甲基转移酶基因，或咖啡酸o
‑
甲基转移酶基因以及甲硫氨酸腺苷转移酶基因和甲硫氨酸合成酶基因中的一种或两种转化到基因工程菌中进行表达，重新构建了新的n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺的生物合成路径，通过咖啡酸o
‑
甲基转移酶基因的过表达，及进一步地，甲硫氨酸腺苷转移酶基因和甲硫氨酸合成酶基因中的一种或两种的表达，合成具有生物活性的咖啡酸o
‑
甲基转移酶和甲硫氨酸腺苷转移酶或/和甲硫氨酸合成酶，促进将底物n
‑
乙酰
‑
5羟色胺转化为n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺。
[0043]
本发明的有益效果：
[0044]
本发明通过在工程菌内表达高活性comt基因，以及进一步的将n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺合成途径中的comt基因和s
‑
腺苷甲硫氨酸循环途径中的mat或/和ms基因结合使用，在工程菌内重新构建s
‑
腺苷甲硫氨酸循环途径，可提高作为第二底物的s
‑
腺苷甲硫氨酸的表达量，有助于进一步增加n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺产量。由此达到了通过过表达咖啡酸
‑
o甲基转移酶comt基因，和甲硫氨酸腺苷转移酶基因或/和甲硫氨酸合成酶基因，重新构建n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺生物合成途径，明显提升n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺的合成产量的优异效果。
附图说明
[0045]
图1为过表达咖啡酸
‑
o甲基转移酶comt的大肠杆菌产n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺情况。
[0046]
图2为过表达咖啡酸
‑
o甲基转移酶comt和甲硫氨酸腺苷转移酶mat的大肠杆菌产n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺情况。
[0047]
图3为基因组整合表达咖啡酸
‑
o甲基转移酶comt的大肠杆菌产n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺情况。
[0048]
图4为过表达甲硫氨酸合成酶ms，及基因组整合表达咖啡酸
‑
o甲基转移酶comt的大肠杆菌产n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺情况。
具体实施方式
[0049]
以下所述实施例便于更好地理解本发明，且所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。以下所述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0050]
实施例1
[0051]
通过基因工程技术，将咖啡酸o
‑
甲基转移酶comt基因以在质粒上表达的方式，在大肠杆菌内重新构建n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺生物合成途径。以n
‑
乙酰
‑
5羟色胺作为底物，经全细胞催化后可将n
‑
乙酰
‑
5羟色胺转化为n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺。具体步骤如下：
[0052]
1.构建prsfduet1
‑
comt重组质粒
[0053]
使用第一引物从人工合成的三种comt基因中扩增得到咖啡酸o
‑
甲基转移酶comt基因，利用酶切连接方式将所述片段连接至质粒载体prsfduet
‑
1的多克隆位点i中得到重组质粒prsfduet1
‑
comt。
[0054]
2.化学感受态的大肠杆菌的制备
[0055]
将大肠杆菌(escherichia coli)bl21(de3)接种至无抗生素的lb平板培养基上，37℃过夜培养。挑取长势良好的单菌落接种至3ml液体lb培养基，于37℃和200rpm的条件下培养12h。接着，按1％的接种量将种子液接种至50ml液体lb培养基中，于37℃和200rpm条件下培养大肠杆菌。当od
600
为0.6时，迅速将菌液置于冰上。然后，将菌液转移至冰预冷的50ml离心管中，在4℃下，4000rpm离心10min，弃上清液，收集菌体至50ml离心管中。用30ml冰预冷无菌的0.1m的cacl2冲洗菌体两次，在4℃下，4000rpm离心10min，弃去上清液，收集菌体沉淀。用2ml预冷0.1m的cacl2(含10wt％甘油)重悬菌体，按每管100μl分装至预冷的1.5ml离心管，得到大肠杆菌bl21(de3)化学感受态细胞，迅速置于
‑
80℃保存保存。
[0056]
3.质粒转化
[0057]
将含有化学感受态大肠杆菌细胞的离心管置于冰上融化，加入1μl的重组质粒prsfduet1
‑
comt，冰浴处理30min，在42℃水浴中热激90s，取出立即冰浴处理2min。最后，加入700μl的lb液体培养基至离心管内，并置于37℃摇床上，200rpm培养45min；培养结束后，5000rpm离心2min，留少量上清重悬菌体沉淀，涂布至含有卡那霉素的lb固体培养基上，37℃过夜倒置培养。挑取抗性平板上的单菌落进行pcr验证，所用引物为mcs
‑
1f:ggatctcgacgctctccct，mcs
‑
1r:gattatgcggccgtgtacaa。取验证成功的菌株于甘油管中，置于
‑
80℃保存备用。
[0058]
4.转基因工程菌诱导培养及全细胞催化
[0059]
将三种含有prsfduet1
‑
comt质粒的大肠杆菌接种至具有卡那霉素的lb固体平板上，37℃过夜培养。挑取单菌落接种至3ml具有卡那霉素的液体lb培养基中，于37℃、200rpm下培养12h，得到种子液。将种子液按1％接种至100ml的lb培养基。在37℃、200rpm条件下培养至od
600
＝0.6，添加终浓度为0.5mm的iptg，在25℃和200rpm的条件下培养16h，在16℃和4000rpm的条件下离心20min，获得诱导培养后的菌体。
[0060]
5.全细胞催化
[0061]
加入转化液，重悬诱导培养之后的菌体沉淀至od
600
＝10，在37℃、150rpm条件下进行全细胞催化，催化时间24h。转化液中含有ph 7.0、50mm tris
‑
hcl缓冲液和5mm的n
‑
乙酰5
‑
羟色胺。
[0062]
6.n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺产量的检测
[0063]
取500ul反应后的转化液，用甲醇1:1稀释，离心后取上清液，上清液经过0.22μm的滤膜过滤至液相瓶中。使用高效液相色谱仪hplc对液相瓶中的n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺进行测定。
[0064]
检测条件设定如下：
[0065]
流动相a为高纯水，占60wt％；
[0066]
流动相b为甲醇，占40wt％；
[0067]
流速为1ml/min；
[0068]
进样量10μl；
[0069]
洗脱方式为等度洗脱；
[0070]
反向柱为c18，检测器选用紫外检测器，波长设定为222nm。
[0071]
经检测，过表达comt基因的大肠杆菌的n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺产量为111
‑
237mg/l，其中过表达黑麦草comt基因的大肠杆菌的n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺产量最高，为237mg/l，如图1。
[0072]
实施例2
[0073]
通过基因工程技术，将咖啡酸o
‑
甲基转移酶comt基因和甲硫氨酸腺苷转移酶基因mat以在质粒上共同表达的方式，在大肠杆菌内重新构建n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺生物合成途径。以n
‑
乙酰
‑
5羟色胺作为底物，经全细胞催化后可将n
‑
乙酰
‑
5羟色胺转化为n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺。具体步骤如下：
[0074]
1.构建prsfduet1
‑
comt
‑
mat重组质粒
[0075]
使用第二引物从人工合成的六种mat基因中扩增得到甲硫氨酸腺苷转移酶基因mat，利用酶切连接方式将所述片段分别连接至质粒载体prsfduet1
‑
comt的多克隆位点ⅱ中得到重组质粒prsfduet1
‑
comt
‑
mat。
[0076]
2.化学感受态的大肠杆菌的制备
[0077]
将大肠杆菌(escherichia coli)bl21(de3)接种至无抗生素的lb平板培养基上，37℃过夜培养。挑取长势良好的单菌落接种至3ml液体lb培养基，于37℃和200rpm的条件下培养12h。接着，按1％的接种量将种子液接种至50ml液体lb培养基中，于37℃和200rpm条件下培养大肠杆菌。当od
600
为0.6时，迅速将菌液置于冰上。然后，将菌液转移至冰预冷的50ml离心管中，在4℃下，4000rpm离心10min，弃上清液，收集菌体至50ml离心管中。用30ml冰预冷无菌的0.1m的cacl2冲洗菌体两次，在4℃下，4000rpm离心10min，弃去上清液，收集菌体
沉淀。用2ml预冷0.1m的cacl2(含10wt％甘油)重悬菌体，按每管100μl分装至预冷的1.5ml离心管，得到大肠杆菌bl21(de3)化学感受态细胞，迅速置于
‑
80℃保存保存。
[0078]
3.质粒转化
[0079]
将含有化学感受态大肠杆菌细胞的离心管置于冰上融化，加入1μl的重组质粒prsfduet1
‑
comt
‑
mat，冰浴处理30min，在42℃水浴中热激90s，取出立即冰浴处理2min。最后，加入700μl的lb液体培养基至离心管内，并置于37℃摇床上，200rpm培养45min；培养结束后，5000rpm离心2min，留少量上清重悬菌体沉淀，涂布至含有卡那霉素的lb平板培养基上，37℃过夜倒置培养。挑取抗性平板上的单菌落进行pcr验证，所用引物为mcs
‑
2f:ttgtacacggccgcataatc，mcs
‑
2r：gctagttattgctcagcgg。取验证成功的菌株于甘油管中，置于
‑
80℃保存备用。
[0080]
4.转基因工程菌诱导培养及全细胞催化
[0081]
将六种含有prsfduet1
‑
comt
‑
mat质粒的大肠杆菌接种至具有卡那霉素的lb固体平板上，37℃过夜培养。挑取单菌落接种至3ml具有卡那霉素的液体lb培养基中，于37℃、200rpm下培养12h，得到种子液。将种子液按1％接种至100ml的lb培养基。在37℃、200rpm条件下培养至od
600
＝0.6，添加终浓度为0.5mm的iptg，在25℃和200rpm的条件下培养16h，在16℃和4000rpm的条件下离心20min，获得诱导培养后的菌体。
[0082]
5.全细胞催化
[0083]
加入转化液，重悬诱导培养之后的菌体沉淀至od
600
＝10，在37℃、150rpm条件下进行全细胞催化，催化时间24h。转化液中含有ph 7.0、50mm tris
‑
hcl缓冲液和5mm的n
‑
乙酰5
‑
羟色胺。
[0084]
6.n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺产量的检测
[0085]
取500ul反应后的转化液，用甲醇1:1稀释，离心后取上清液，上清液经过0.22μm的滤膜过滤至液相瓶中。使用高效液相色谱仪hplc对液相瓶中的n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺进行测定。
[0086]
检测条件设定如下：
[0087]
流动相a为高纯水，占60wt％；
[0088]
流动相b为甲醇，占40wt％；
[0089]
流速为1ml/min；
[0090]
进样量10μl；
[0091]
洗脱方式为等度洗脱；
[0092]
反向柱为c18，检测器选用紫外检测器，波长设定为222nm。
[0093]
经检测，过表达comt基因及mat基因的大肠杆菌的n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺产量，与单独过表达comt基因的大肠杆菌相比，有进一步提高，提高率达6.8—79.3％。其中过表达黑麦草comt基因及白杨mat基因的大肠杆菌的n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺产量最高，为425mg/l，如图2。
[0094]
实施例3
[0095]
通过基因工程技术，将咖啡酸o
‑
甲基转移酶comt基因和甲硫氨酸腺苷转移酶基因mat以在基因组整合表达的方式，在大肠杆菌内重新构建n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺生物合成途径，以n
‑
乙酰
‑
5羟色胺作为底物，经全细胞催化后可将n
‑
乙酰
‑
5羟色胺转化为n
‑
乙酰基
‑
5
‑
甲氧基色胺。具体步骤如下：
[0096]
1.获得敲除trpr的第一步同源重组片段i
[0097]
以pxz
‑
sc质粒(tan et al,2013aem)为模板，使用引物trpr
‑
f和trpr
‑
r进行pcr扩增，得到3kb左右的pcr产物，即为第一步同源重组片段dna，含cat,sacb基因和50bp上下游同源臂。
[0098]
2.将敲除trpr基因的dna片段用于第一步同源重组
[0099]
将ptkred(cox et al，2010nuclei acid res)工具酶质粒通过电转化的方法转化至bl21菌株，然后将同源重组片段i电转至携带ptkred质粒的bl21菌株内。
[0100]
电转条件：预先制备带有ptkred质粒的大肠杆菌bl21感受态细胞，(dower et al.1998nuclei acid res)；将50ul感受态细胞置于冰上，加入50ng dna片段i，转移至1mm的bio
‑
rad电转杯。使用micro pulser(bio
‑
rad)电穿孔仪进行电击，点击后将感受态细胞转至1ml的lb液体培养基内，30℃75rpm孵育3h后涂布含有大观霉素(终浓度100ug/ml)和氯霉素(34ug/ml)的平板上，37℃过夜培养后，使用cat
‑
f和sacb
‑
r引物进行验证，挑选结果正确的单克隆，命名为bl21
‑
trprc。
[0101]
3.获得同源重组的第二步片段ii
[0102]
以prsfduet1
‑
comt3质粒为载体，利用无缝克隆的方式以mat4
‑
f、mat4
‑
r、p3
‑
f和p3
‑
r为引物，将黑麦草咖啡酸o
‑
甲基转移酶基因与白杨甲硫氨酸腺苷转移酶基因在质粒上串联表达，构建得到prsfduet1
‑
t7
‑
comt3
‑
mat4重组质粒。以prsfduet1
‑
t7
‑
comt3
‑
mat4质粒为模板，以t7p
‑
f和t7t
‑
r为引物，扩增得到含trpr基因上游50bp，t7启动子、comt3基因，mat4基因和trpr基因下游50bp的同源线性片段。
[0103]
4.将扩增的片段电转至bl21
‑
trprc菌株。
[0104]
电转条件：准备携带ptkred质粒的bl21
‑
trprc的电转化感受态细胞(制备方法参见dower et al.1988)；将50ul感受态细胞置于冰上，加入50ng dna片段，转移至1mm电转杯。使用micro pulser(bio
‑
rad)电穿孔仪进行电击，点击后将感受态细胞转至1ml的lb液体培养基内，30℃75rpm孵育4h后转接至含有10％蔗糖的无盐蔗糖的lb液体培养基(含终浓度100ug/ml的大观霉素)中，30℃220rpm振荡培养24h后在含有6％蔗糖的无盐lb培养基(含终浓度100ug/ml的大观霉素)上划线。使用t7
‑
comt3和mat4
‑
r引物对单克隆进行验证，取验证成功的菌株于甘油管中，置于
‑
80℃保存备用。其中所述引物序列如下：
[0105]
[0106][0107]
5.转基因工程菌诱导培养及全细胞催化
[0108]
将基因组上整合comt和mat基因的大肠杆菌接种至具有大观霉素的lb固体平板上，37℃过夜培养。挑取单菌落接种至3ml具有大观霉素的液体lb培养基中，于37℃、200rpm下培养12h，得到种子液。将种子液按1％接种至100ml的lb培养基。在37℃、200rpm条件下培养至od
600
＝0.6，添加终浓度为0.5mm的iptg，在25℃和200rpm的条件下培养16h，在16℃和4000rpm的条件下离心20min，获得诱导培养后的菌体。
[0109]
6.全细胞催化
[0110]
加入转化液，重悬诱导培养之后的菌体沉淀至od
600
＝10，在37℃、150rpm条件下进行全细胞催化，催化时间24h。转化液中含有ph 7.0、50mm tris
‑
hcl缓冲液和5mm的n
‑
乙酰5
‑
羟色胺。
[0111]
7.n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺产量的检测
[0112]
取500ul反应后的转化液，用甲醇1:1稀释，离心后取上清液，上清液经过0.22μm的滤膜过滤至液相瓶中。使用高效液相色谱仪hplc对液相瓶中的n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺进行测定。
[0113]
检测条件设定如下：
[0114]
流动相a为高纯水，占60wt％；
[0115]
流动相b为甲醇，占40wt％；
[0116]
流速为1ml/min；
[0117]
进样量10μl；
[0118]
洗脱方式为等度洗脱；
[0119]
反向柱为c18，检测器选用紫外检测器，波长设定为222nm。
[0120]
经检测，在基因组上整合表达黑麦草comt基因及白杨mat基因的大肠杆菌的n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺最高产量为760mg/l，如图3。
[0121]
实施例4
[0122]
甲硫氨酸合成酶(methionine synthase，ms)可催化同型半胱氨酸形成甲硫氨酸。通过基因工程技术，将甲硫氨酸合成酶基因ms以在质粒上表达的方式，在基因组上已经整合黑麦草comt基因及白杨mat基因的大肠杆菌内重新构建n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺生物合成途径，以n
‑
乙酰
‑
5羟色胺作为底物，经全细胞催化后可将n
‑
乙酰
‑
5羟色胺转化为n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺。
[0123]
具体步骤如下：
[0124]
1.构建prsfduet1
‑
ms重组质粒
[0125]
使用第三引物从人工合成的四种mat基因中扩增得到甲硫氨酸合成酶基因ms，利用酶切连接方式将所述片段分别连接至质粒载体prsfduet
‑
1的多克隆位点i中得到重组质粒prsfduet1
‑
ms。
[0126]
2.化学感受态的大肠杆菌的制备
[0127]
将实施例3中，已在基因组上整合表达comt3和mat4的大肠杆菌接种至大观生素的lb平板培养基上，37℃过夜培养。挑取长势良好的单菌落接种至3ml液体lb培养基，于37℃和200rpm的条件下培养12h。接着，按1％的接种量将种子液接种至50ml液体lb培养基中，于37℃和200rpm条件下培养大肠杆菌。当od
600
为0.6时，迅速将菌液置于冰上。然后，将菌液转移至冰预冷的50ml离心管中，在4℃下，4000rpm离心10min，弃上清液，收集菌体至50ml离心管中。用30ml冰预冷无菌的0.1m的cacl2冲洗菌体两次，在4℃下，4000rpm离心10min，弃去上清液，收集菌体沉淀。用2ml预冷0.1m的cacl2(含10wt％甘油)重悬菌体，按每管100μl分装至预冷的1.5ml离心管，得到大肠杆菌bl21(de3)化学感受态细胞，迅速置于
‑
80℃保存保存。
[0128]
3.质粒转化
[0129]
将含有化学感受态大肠杆菌细胞的离心管置于冰上融化，加入1μl的重组质粒prsfduet1
‑
ms，冰浴处理30min，在42℃水浴中热激90s，取出立即冰浴处理2min。最后，加入700μl的lb液体培养基至离心管内，并置于37℃摇床上，200rpm培养45min；培养结束后，5000rpm离心2min，留少量上清重悬菌体沉淀，涂布至含有卡那霉素的lb平板培养基上，37℃过夜倒置培养。挑取抗性平板上的单菌落进行pcr验证，所用引物为mcs
‑
1f:ggatctcgacgctctccct，mcs
‑
1r:gattatgcggccgtgtacaa。取验证成功的菌株于甘油管中，置于
‑
80℃保存备用。
[0130]
4.转基因工程菌诱导培养及全细胞催化
[0131]
将四种含有prsfduet1
‑
ms质粒，且基因组整合表达comt3、mat4的大肠杆菌接种至具有卡那霉素的lb固体平板上，37℃过夜培养。挑取单菌落接种至3ml具有卡那霉素的液体lb培养基中，于37℃、200rpm下培养12h，得到种子液。将种子液按1％接种至100ml的lb培养基。在37℃、200rpm条件下培养至od
600
＝0.6，添加终浓度为0.5mm的iptg，在25℃和200rpm的条件下培养16h，在16℃和4000rpm的条件下离心20min，获得诱导培养后的菌体。
[0132]
5.全细胞催化
[0133]
加入转化液，重悬诱导培养之后的菌体沉淀至od
600
＝10，在37℃、150rpm条件下进行全细胞催化，催化时间24h。转化液中含有ph 7.0、50mm tris
‑
hcl缓冲液和5mm的n
‑
乙酰5
‑
羟色胺。
[0134]
6.n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺产量的检测
[0135]
取500ul反应后的转化液，用甲醇1:1稀释，离心后取上清液，上清液经过0.22μm的滤膜过滤至液相瓶中。使用高效液相色谱仪hplc对液相瓶中的n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺进行测定。
[0136]
检测条件设定如下：
[0137]
流动相a为高纯水，占60wt％；流动相b为甲醇，占40wt％；流速为1ml/min；进样量10μl；洗脱方式为等度洗脱；
[0138]
反向柱为c18，检测器选用紫外检测器，波长设定为222nm。
[0139]
经检测，过表达comt基因、mat基因和ms基因的大肠杆菌的n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺产量，与单独过表达comt基因、mat基因的大肠杆菌相比，有进一步提高，提高率达1.7％—22.8％。其中质粒过表达大肠杆菌ms基因，及基因组上整合黑麦草comt基因及白杨mat基因的大肠杆菌的n
‑
乙酰基
‑5‑
甲氧基色胺产量最高，为933mg/l，如图4。