GhMYB44基因在棉花愈伤组织分化发育中的应用的制作方法

ghmyb44基因在棉花愈伤组织分化发育中的应用
技术领域
1.本发明属于转基因技术领域，具体涉及一种ghmyb44基因在棉花遗传转化中的应用。


背景技术：

2.棉花是世界上最主要的经济作物之一，其纤维是纺织工业的重要原料，种子是重要的油料来源，棉花纺织加工业和种植业是国民经济的重要组成部分。目前我国棉花品种的综合竞争力弱，在纤维品质，产量，抗病，耐旱及耐盐碱等方面亟需提高，培育出具有竞争力的新品种迫在眉睫，利用基因工程改良棉花品种是快速有效的途径。但现有的转基因体系，存在着转化周期长、体细胞胚畸形率高和正常再生苗数量少等问题，严重限制了基因工程在棉花品种改良中的应用。
3.为解决这个瓶颈问题，我们需要解析调控棉花体细胞胚胎发生的调控网络，筛选改良棉花遗传转化体系的关键基因，优化棉花体细胞胚胎发生体系，为高效创制棉花新品种奠定基础。
4.因此，如何提供一种可加快棉花愈伤组织分化发育的基因是本领域亟待解决的问题。


技术实现要素：

5.本发明公开了ghmyb44基因在棉花胚性愈伤组织分化发育中的应用。
6.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.ghmyb44基因在加快棉花愈伤组织分化发育中的应用；所述ghmyb44基因序列如seq id no.1所示；
8.ghmyb44蛋白在加快棉花愈伤组织分化发育中的应用；所述ghmyb44蛋白序列如seq id no.2所示；
9.一种ghmyb44基因超表达棉花植株的愈伤组织诱导培养基，包括：含有0. 5mol/l2,4
‑
d和0.5mol/l kt的msb培养基；
10.一种ghmyb44基因超表达棉花植株的胚性愈伤组织诱导培养基，包括：含有0.5mol/l kt的msb培养基；
11.一种ghmyb44基因超表达棉花植株的组织培养方法，包括以下步骤：
12.(1)取棉花幼苗下胚轴，置于权利要求3所述的愈伤组织诱导培养基中，适宜条件下，培养30
‑
40天；
13.(2)待长出愈伤组织后，将愈伤组织转移至权利要求4所述的胚性愈伤组织诱导培养基中，适宜条件下培养，得胚性愈伤组织。
14.优选的，步骤(1)和步骤(2)中，所述适宜条件为：28
±
2℃，光照强度 2000lx，光照周期16h/8h；
15.优选的，步骤(1)中，培养周期为30天；
16.还包括以下步骤：
17.(3)将胚性愈伤组织继代到胚状体诱导培养基中进行胚状体诱导，得胚状体；
18.还包括以下步骤：
19.(4)将胚状体继代到成苗培养基中培养得转基因幼苗；
20.还包括以下步骤：
21.(5)将转基因幼苗继代到生根培养基，长出白根后炼苗，移栽温室；
22.所述棉花品种为中棉所24；
23.综上所述，本发明公开了ghmyb44基因在棉花愈伤组织分化发育中的应用；通过超表达ghmyb44基因，使中棉所24植株外植体7d形成层中细胞结构发生了重组、30d愈伤组织的细胞呈现小而圆的特征、45d愈伤组织的有细胞团出现，组织共培养时间仅需182d，比对照缩短了24.7％，为棉花组织培养和快速育种做出贡献。
附图说明
24.图1：为外植体诱导培养7d后组织学观察图片，a和b为超表达ghmyb44基因材料myb44
‑
559和myb44
‑
572，c为对照zm24，d和e为抑制子材料my b44
‑
srdx
‑
9和myb44
‑
srdx
‑
55。。
25.图2：转基因材料和对照材料胚性愈伤组织分化率折线图；myb44
‑
559和myb 44
‑
572为超表达材料，zm24为常规对照，myb44
‑
srdx
‑
9和myb44
‑
srdx
‑
5 5为myb44基因抑制子材料。
26.图3：转基因材料与对照材料在愈伤组织诱导培养基上培养30天，然后继代到胚性愈伤组织诱导培养基20天后的形态；a和b为转基因株系，c和d为对照 zm24。
27.图4：转基因材料与对照材料光学和扫描电镜图片；a依次为myb44
‑
559、my b44
‑
572、zm24、myb44
‑
srdx
‑
9和myb44
‑
srdx
‑
55在愈伤组织培养基上培养30天的解剖镜图片；b依次为myb44
‑
559、myb44
‑
572、zm24、myb44
‑
s rdx
‑
9和myb44
‑
srdx
‑
55在愈伤组织培养基上培养30天的扫描电镜图片；c 依次为myb44
‑
559、myb44
‑
572、zm24、myb44
‑
srdx
‑
9和myb44
‑
srdx
‑ꢀ
55在愈伤组织培养基上培养30天后，继代到胚性愈伤组织诱导培养基上培养1 5天的解剖镜图片；d依次为myb44
‑
559、myb44
‑
572、zm24、myb44
‑
srd x
‑
9和myb44
‑
srdx
‑
55在愈伤组织培养基上培养30天后，继代到胚性愈伤组织诱导培养基上培养15天的扫描电镜图片。
28.图5：转基因材料缩短棉花转化周期。
具体实施方式
29.下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
30.下述实施例中的棉花品种陆地棉(gossypium hirsutuml.)品种中棉所24来源于中国农业科学院棉花研究所种质库，在下文中简称中棉所24。下述实施例中的设计的激素sigma公司产品；培养基及其他产品来自试剂公司；
2000lx，光照周期16h/8h条件下，15
‑
20d继代一次，直至长出幼芽；
49.将幼芽组织继代到成苗培养基上，待长出幼苗后，进一步转接到再生苗生根培养基中做生根培养，28
±
2℃，光照强度2000lx，光照周期16h/8h条件下， 15
‑
20d条件下生根两周，之后将再生苗从培养基中取出，泡在自来水中，28
±ꢀ
2℃，光照强度2000lx，光照周期16h/8h条件下，进行炼苗，一周后移栽到花盆里，得中棉所24超表达35s::ghmyb44植株。
50.实施例2
51.将转基因获得的过表达ghmyb44
‑
1棉花不同株系的种子ghmyb44
‑
559和 ghmyb44
‑
574脱绒后剥去棉籽的外壳后，棉仁用0.1％的升汞浸泡消毒5min，然后用无菌水冲洗3
‑
5次，播于无菌苗培养基上使其萌发并长成无菌苗。在无菌工作台上，用经过酒精灯火焰消毒的手术刀片将生长至7天的无菌苗的下胚轴切成0.5厘米的小段，放入棉花愈伤组织诱导培养基，28
±
2℃，人工光照强度2 000lx，光照周期16h/8h条件下，进行组织培养30天，得愈伤组织。
52.将长出愈伤组织的外植体切段继代到棉花胚性愈伤组织诱导培养基中，28
±ꢀ
2℃，人工光照强度2000lx，光照周期16h/8h条件下，培养30天，得胚性愈伤组织。
53.将胚性愈伤组织继代到胚状体诱导培养基中，28
±
2℃，人工光照强度2000 lx，光照周期16h/8h条件下，进行胚状体诱导培养30d，得胚状体。
54.将胚状体继代到成苗培养基上，28
±
2℃，人工光照强度2000lx，光照周期 16h/8h条件下，培养60天，待长出幼苗后，进一步转接到再生苗生根培养基中做生根培养，28
±
2℃，光照强度2000lx，光照周期16h/8h条件下，生根30天，之后将再生苗从培养基中取出，泡在自来水中，28
±
2℃，光照强度2000lx，光照周期16h/8h条件下，进行炼苗，一周后移栽到花盆里，得植株幼苗，统计培养时间结果如图5所示。
55.从组织培养40d开始观察愈伤组织分化情况，分别于40d，50d，60d，80d 统计分化效率，结果如图2所示；通过扫描电镜进一步观察发现，超表达外植体45d的愈伤组织，结果如图4所示。
56.通过体细胞胚胎发生过程的转录组数据分析，发现ghmyb44基因在体细胞胚发育过程显著上调表达，因此，推测ghmyb44基因可能在棉花体细胞胚发育过程中发挥着重要的作用。为了验证ghmyb44在棉花体细胞胚胎发生过程中的功能，我们构建了超表达并转化棉花。结果发现超表达ghmyb44抑制非胚性愈伤组织的起始和增殖，超表达ghmyb44促进胚性愈伤组织的产生及体细胞胚的发生。对ghmyb44的超表达材料进行了组织学观察和电镜扫描，结果发现在愈伤组织诱导培养基上诱导7d后，在35s::myb44的形成层中细胞结构发生了重组，而对照zm24中维管细胞过度增殖，形成层区域起始不明显 (图1)。为了进一步观察发现超表达外植体30d愈伤组织的细胞呈现小而圆的特征，而对照zm24外植体愈伤组织细胞大而长。通过扫描电镜进一步观察发现，超表达外植体45d愈伤组织的有细胞团出现，是胚性愈伤组织前期形态。而对照zm24外植体愈伤组织细胞松散，不成团(图2)。将转基因材料和对照中棉所24在愈伤组织诱导和分化培养基上进行培养。分别在40d，50d，60d，8 0d统计分化效率，结果发现，过表达材料的分化率远远高于对照中棉所24(图 3)。
57.对比例1
58.中棉所24重复实施例2的操作，182d后，未能得到植株幼苗，结果如图1
ꢀ‑
5所示。
59.对比例2
60.在北京金唯智生物科技公司合成kpni
‑
srdx
‑
saci序列，得到带有kpni 和saci双酶切位点的srdx与puc19
‑
t相连的重组质粒，将重组质粒构建到 pambia2300载体上，转化棉花，得到两个株系，为是嵌合抑制子表达载体材料；ghmyb44
‑
srdx
‑
9和ghmyb44
‑
srdx
‑
55重复实施例2的操作，结果如图 1
‑
5所示。
61.对比例3
62.中棉所24按照正常组织培养方法进行培养(如图5所示)，即将胚性愈伤组织诱导培养基培养时间和胚状体诱导培养基培养时间均延长30d，其余操作与实施例2相同，结果242d后可得到植株幼苗。
63.结果分析
64.通过体细胞胚胎发生过程的转录组数据分析，发现ghmyb44基因在体细胞胚发育过程显著上调表达，因此推测ghmyb44基因可能在棉花体细胞胚发育过程中发挥着重要的作用。为了验证ghmyb44在棉花体细胞胚胎发生过程中的功能，我们构建了超表达并转化棉花。结果发现超表达ghmyb44抑制非胚性愈伤组织的起始和增殖，超表达ghmyb44促进胚性愈伤组织的产生及体细胞胚的发生。对ghmyb44的超表达材料进行了组织学观察和电镜扫描，结果发现在msb培养基上诱导7d后，在35s::myb44的形成层中细胞结构发生了重组，而对照zm24中维管细胞过度增殖，形成层区域起始不明显(图3)。为了进一步观察发现超表达外植体30d愈伤组织的细胞呈现小而圆的特征，而对照zm24外植体愈伤组织细胞大而长。通过扫描电镜进一步观察发现，超表达外植体45d愈伤组织的有细胞团出现，是胚性愈伤组织前期形态。而对照z m24外植体愈伤组织细胞松散，不成团(图4)。将转基因材料和对照中棉所2 4在愈伤组织诱导和分化培养基上进行培养。分别在40d，50d，60d，80d统计分化效率，结果发现，过表达材料的分化率远远高于对照中棉所24(图2)。共培养时间对照zm24为242d，而zm24
‑
35s::myb44转基因植株为182天，转基因植株比对照缩短了24.7％(如图5所示)。
65.本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
66.对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。