一株温驯驹形杆菌SW-1及其发酵应用的制作方法

一株温驯驹形杆菌sw
‑
1及其发酵应用
技术领域
1.本发明属于微生物应用和食品酿造领域，涉及一株醋酸菌及其应用，具体涉及一株发酵特性好，产风味物质多，适用于红茶菌饮料酿造及食醋酿造的温驯驹形杆菌。


背景技术：

2.驹形杆菌主要存在于发酵食品中，如醋、红茶菌饮料、葡萄酒等，分类学上属于醋酸杆菌科的驹形杆菌属，大部分驹形杆菌都可产生纤维素，如欧洲驹形杆菌、居间驹形杆菌、柿醋驹形杆菌、温驯驹形杆菌等。而且有研究表明，驹形杆菌能促进包括酸、醇和酯类在内的芳香物质的形成，通过小比例添加可用于生产传统的酒精发酵食品，可较大程度增强其风味。
3.红茶菌作为具有悠久历史的传统发酵饮料，又称“海宝”、“胃宝”，因其滋味酸甜而又带有茶香，且对人体有较好的益生作用而广受欢迎。研究发现红茶菌中对发酵起主要作用的优势菌种为醋酸菌、酵母菌和乳酸菌。但天然红茶菌中除了以上三种菌外，还含有大量的杂菌，这些菌并不都对红茶菌饮料的风味起贡献作用，其中有些甚至会产生对人体有害的物质。而且民间传统培养的红茶菌菌种发酵特性和益生特性有很大差别，天然发酵的红茶菌饮品对茶水中的营养成分不能充分利用。在发酵红茶菌饮料时，成品的质量难以控制，导致容易污染杂菌，卫生不达标，同时风味和口感比较差。
4.通过人工复配一定比例的醋酸菌、酵母菌和乳酸菌，形成纯化培养的红茶菌，加入到茶糖水中进行发酵，可以得到发酵过程可控、发酵周期短、产品质量高和风味好、具有较高的经济价值的纯化红茶菌饮料。经研究发现在红茶菌饮料中，对风味贡献最大的是醋酸菌，所以筛选发酵特性好，适合人工复配的醋酸菌具有重要意义。


技术实现要素：

5.针对现在适合组成人工纯化红茶菌的醋酸菌较少的不足，本文从醋醅中分离筛选得到一株适合配制人工纯化红茶菌的驹形杆菌，以该菌为主，辅助添加酿酒酵母与嗜酸乳杆菌发酵熟成的纯化红茶菌饮料风味醇厚，口感酸甜适中，且具有较高的抗氧化性与较高的总黄酮和总多酚含量。
6.本发明的目的一是提供一株温驯驹形杆菌sw
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1，所述温驯驹形杆菌sw
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1为驹形杆菌，分类命名为温驯驹形杆菌(komagataeibacter oboediens)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京市，保藏编号为cgmcc no.22548，保藏日期为2021年05月17日。
7.本发明的目的二是提供一种微生物菌剂，包含所述的温驯驹形杆菌sw
‑
1。
8.本发明的目的三是提供一种利用所述的温驯驹形杆菌sw
‑
1发酵生产红茶菌饮料的方法，包括以下步骤：(1)、将水煮沸后，按10
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20g/l的比例向水中加入茶叶，再加入80
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100g/l蔗糖，溶解，降至室温，制备茶糖水；
(2)、向步骤(1)所得茶糖水中接种温驯驹形杆菌sw
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1、酿酒酵母和嗜酸乳杆菌，25
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30℃发酵2
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4d，得发酵液；(3)、将步骤(2)所得发酵液分离、杀菌，静置后熟5
‑
10d，即得红茶菌饮料。
9.其中，步骤(1)中，所述茶叶为红茶、绿茶和普洱茶中的至少一种。
10.其中，步骤(2)中，所述温驯驹形杆菌sw
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1在接种前经活化和扩大培养，具体步骤如下：步骤一、斜面固体培养：将菌种接种在固体斜面培养基上，于25～32℃培养2～3天，得到斜面固体培养的活化菌种，备用；步骤二、摇瓶菌种扩大培养：取步骤一得到的活化菌种，加入无菌水制成菌悬液，无菌水的加入量按照一支试管加入3～5ml；将菌悬液接种于液体种子扩大培养基中，接种量为液体种子扩大培养基体积的5～10％，培养温度28～32℃，摇床速度70
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150r/min，培养时间1～2天，得到种子液，作为发酵红茶菌的种子；所述的液体种子扩大培养基的配方为：每1000ml培养基中包含葡萄糖40～70g，酵母粉15～20g，海藻糖8～12g，na2hpo
4 2～5g，乳酸1～3g，mgso
4 0.2～0.5g，无水乙醇15～30ml，余量为水。
11.其中，所述温驯驹形杆菌sw
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1的接种量为3％
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5％，所述酿酒酵母的接种量为1％
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3％，所述嗜酸乳杆菌的接种量为1％
‑
3％。
12.本发明的的目的四是提供所述的温驯驹形杆菌sw
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1或微生物菌剂在发酵饮品中的应用。进一步地，所述发酵饮品为红茶菌饮料。
13.本发明的目的五是提供所述的温驯驹形杆菌sw
‑
1或微生物菌剂在食醋酿造中的应用，所述食醋为固态酿造食醋或液态酿造食醋。
14.有益效果：与传统红茶菌发酵饮料相比，本发明具有如下优点：本发明通过添加温驯驹形杆菌sw
‑
1，并辅助添加酿酒酵母与嗜酸乳杆菌配制的纯化红茶菌饮料，风味优良，具有令人愉悦的酸香，果香与蜂蜜香，并且还有淡淡的茶香。且通过发酵，其抗氧化性与总黄酮含量都比未发酵的茶水有了较大提升，对人体有较大益生性。与传统发酵方法不同，本发明发酵周期短，产品质量高且发酵过程易于控制，提高了菌种的利用率，具有一定的工业应用价值。
附图说明
15.图1是sw
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1菌落照片；
16.图2是sw
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1菌体革兰氏染色显微照片(1600倍)；
17.图3是nj法构建的sw
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1的系统发育树。
具体实施方式
18.一、一种产乙酸的微生物菌株筛选和鉴定，其具体步骤如下：
19.本发明将取自洛阳某醋业有限公司的醋醅10g加入90ml无菌水中，摇匀震荡。摇匀后取1ml样品加入到9ml无菌水中，在漩涡混合仪上混匀后，再取1ml样品加入9ml无菌水中，
以此类推。选取三个合适的浓度梯度依次涂布固体培养平板(葡萄糖10g，酵母粉10g，碳酸钙10g，蒸馏水1000ml，ph调至6.5，添加琼脂粉20g/l)，28℃培养48
‑
72h，选取平板上产生透明圈较大的菌株，备用。将初筛出的菌株接种到复筛固体培养基平板(葡萄糖10g，酵母粉3g，醋酸30ml，乙醇30ml，琼脂20g，蒸馏水940ml)，28℃培养48h后选出生长较好的菌株。将筛选出的菌株接种到复筛液体培养基(葡萄糖5g、蛋白胨4g、酵母提取物3g、醋酸30ml、乙醇60ml、蒸馏水910ml)中，28℃、60r/min摇瓶培养15h，以氢氧化钠滴定总酸(以醋酸计)含量。经两轮复筛，最终得到一株产醋酸sw
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1(见图1)，该菌革兰氏染色呈阴性(见图2)，乙酸产量为5.6g/100ml，能够耐受10％的乙醇。
20.本发明筛选得到的产乙酸的微生物sw
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1，将菌株送至华大基因公司进行测序，测序结果提交至ncbi数据库进行比对，结果显示，菌株sw
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1的16s rdna序列与komagataeibacter oboediens bpztr01的同源性高达99％。采用mega7.0软件构建出菌sw
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1的系统发育树，结合《伯杰氏细菌鉴定手册》(第八版)生理生化鉴定，该菌为红螺菌目(rhodospirillales)醋杆菌科(acetobacteraceae)驹形杆菌属(komagataeibacter)温驯驹形杆菌(komagataeibacter oboediens)。该菌为杆状，革兰氏阴性，分离时菌落小，表面光滑，异养菌，生长利用葡萄糖，好氧菌，最适温度25～32℃，生长最适ph5.5～8.0。
21.二、一种发酵红茶菌饮料的发酵工艺方法，其具体步骤如下：(1)斜面固体培养：将温驯驹形杆菌sw
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1接种在固体斜面培养基上，于25～32℃培养2～3天，得到斜面固体培养的活化菌种，备用；所述的斜面固体培养基的配方为：每1000ml培养基中包含葡萄糖10～30g，酵母粉10～20g，k2hpo
4 2～5g，琼脂15～30g，无水乙醇15～30ml，余量为水；(2)摇瓶菌种扩大培养：取(1)得到的温驯驹形杆菌sw
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1，加入无菌水制成菌悬液，无菌水的加入量按照一支试管加入3～5ml，将菌悬液接种于扩大培养基中，接种量为液体培养基体积的5～10％，培养温度28～32℃，摇床速度150～250r/min，培养时间1～2天，得到种子液，作为发酵红茶菌的种子；所述的液体种子扩大培养基的配方为：每1000ml培养基中包含葡萄糖40～70g，酵母粉15～20g，海藻糖8～12g，na2hpo
4 2～5g乳酸1～3g，mgso
4 0.2～0.5g，无水乙醇15～30ml，余量为水；(3)红茶菌饮料的发酵将水煮沸后，按10～20g/l比例加入茶叶，加入80
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100g/l蔗糖，按比例接种温驯驹形杆菌sw
‑
1、酿酒酵母和嗜酸乳杆菌，25～30℃发酵2～4d，将发酵液分离出，静置后熟5～10d。
22.三、dpph自由基清除能力测试：
23.样品处理：取2.5ml样品加入50ml容量瓶中加水定容。然后取1ml于试管中再加入9ml蒸馏水稀释得到稀释200倍的样品溶液。取2ml稀释后的样品溶液和2mldpph溶液作为实验组，对照组用2ml无水乙醇代替dpph溶液，以加入2mldpph溶液和2ml无水乙醇为标准组，避光反应30min，517nm测定吸光度，计算dpph清除率。
24.四、挥发性风味物质测定：
采用顶空
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固相微萃取
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气相色谱
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质谱联用的方法进行：(1)萃取条件：先将萃取头在气相色谱的进样口于250℃老化至无杂峰，将6ml样品(加入10μl浓度为100mg/l的2
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辛醇作为内标)放入15ml固相微萃取样品瓶中，加入1g氯化钠，放入磁力搅拌子，盖上盖子。放入40℃恒温水浴中，平衡10min，将spme萃取头通过瓶盖插入到样品中的顶空部分，推出纤维头，顶空吸附40min，随后抽回纤维头，从样品瓶中拔出萃取头，再将萃取头插入gc
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ms仪的气相色谱进样口，推出纤维头，于250℃解吸5min，抽回纤维头后拔出萃取头，同时启动仪器采集数据；(2)仪器条件：色谱条件：tg
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waxms毛细管色谱柱，柱长30μm，内径0.25mm，液膜厚度0.25μm，载气：he气，流量1ml/min，分流流量：50ml/min，吹扫流量：3ml/min，进样口温度：250℃；升温程序：起始温度35℃，保持5min；以4℃/min升至180℃，保持2min；再以5℃/min升温至220℃，保持5min，共56.25min；质谱条件：传输线温度：250℃，离子源温度：280℃，电离方式：ei电离源，电子能量：70ev，质量扫描范围：33
‑
450amu；(3)数据处理与分析：检索谱库为replib和mainlab，检测出的挥发性成分匹配度大于800的化合物，其最高匹配度为1000。并采用峰面积归一化法计算所有组分的相对峰面积比。样品中各组分风味物质浓度计算如公式所示：ci＝ai/as
×
cs；式中：ci：样品中各挥发性风味化合物浓度，μg/l；cs：2
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辛醇浓度，μg/l；ai：样品中待测物质对应的色谱峰面积；as：内标的色谱峰面积。
25.五、总黄酮含量的测定：取样品1ml于10ml比色管中，加入60％的乙醇，使所有比色管中体积为5ml，加入0.3ml的5％的亚硝酸钠溶液，并且摇匀后静置放置5分钟，之后加入0.3ml的10％硝酸铝溶液，使用振荡器摇匀并放置6分钟后，加入1mol/l的氢氧化钠溶液4ml，最后用60％乙醇完成定容，放置15min，在510nm波长处测吸光度，并根据标准曲线计算总黄酮含量。
26.六、总多酚含量的测定：取样品1.00ml于25ml容量瓶中，依次加入0.80mol/l的福林试剂0.65ml，避光反应后，加入20％碳酸钠溶液4ml，用蒸馏水定容，60℃水浴60min，取反应后的样品2ml加入2ml蒸馏水稀释2倍后720nm处测吸光度，计算总多酚含量。
27.下面申请人将结合具体的实施例对本发明产品的制备过程及应用过程做详细说明，便于本领域人员清楚地理解本发明。但应该理解，下列实施例不应以任何方式被解释为对本技术权利要求书请求保护范围的限制。
28.实施例1：说明如何筛选得到温驯驹形杆菌sw
‑
1。
29.(1)平板初筛：将取自某醋厂的醋醅10g加入90ml无菌水中，摇匀震荡。摇匀后取1ml样品加入到9ml无菌水中，在漩涡混合仪上混匀后，再取1ml样品加入9ml无菌水中，以此类推。选取三个合适的浓度梯度依次涂布到固体培养平板(葡萄糖10g，酵母粉10g，碳酸钙10g，琼脂粉20g，蒸馏水1000ml，ph 6.5)，28℃培养72h，选取平板上产生透明圈较大的菌株。将初筛出的菌株接种到复筛固体培养基平板上(葡萄糖10g，酵母粉3g，醋酸30ml，乙醇
30ml，琼脂粉20g，蒸馏水940ml)，28℃培养48h，选出生长较好的菌株。
30.(2)摇瓶复筛：将筛选出的菌株接种到复筛液体培养基(葡萄糖5g，蛋白胨4g，酵母提取物3g，醋酸30ml，乙醇60ml，蒸馏水910ml)中，28℃、60r/min摇瓶培养48h，以氢氧化钠滴定总酸(以醋酸计)含量。
31.(3)经两轮复筛，最终得到一株耐醋酸sw
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1(见图1)，该菌革兰氏染色呈阴性(见图2)，耐乙醇能力好，产酸能力强的菌株sw
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1。
32.实施案例2：说明如何鉴定温驯驹形杆菌sw
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1。
33.(1)分离纯化出单菌落斜面，送至武汉华大基因公司进行测序，测序结果提交至ncbi数据库进行比对，结果显示，菌株sw
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1的16s rdna序列(seq id no：01)与komagataeibacter oboediens bpztr01的同源性高达99％。采用mega7.0软件，选择nj法，自展值3000构建出sw
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1的系统发育树(见图3)。
34.(2)通过菌株sw
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1的形态特征、生理生化特征和16s rdna序列，确定sw
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1为温驯驹形杆菌(komagataeibacter oboediens)。
35.(3)将鉴定为温驯驹形杆菌的菌株sw
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1进行保藏，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmcc n0.22548,保藏日期为2021年5月17日。
36.(4)所述编号为cgmcc 22548的温驯驹形杆菌sw
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1的16s rdna的碱基序列如seq id no：01所示。
37.实施例3说明如何以红茶为原料发酵红茶菌饮料。
38.(1)种子液的制备：将于冰箱4℃保藏的sw
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1斜面接种至装液量100ml的250ml三角瓶中(1l液体培养基配方：葡萄糖70g，酵母粉15g，海藻糖10g，na2hpo
4 3g，乳酸2g，mgso
4 0.4g，无水乙醇20ml，余量为水)，28℃、80r/min培养36h；将酿酒酵母接种至ypd培养基装液量100ml的250ml三角瓶中，30℃。180r/min培养24h；将嗜酸乳杆菌斜面接种至mrs培养基装液量100ml的250ml三角瓶中，37℃、180r/min培养36h。
39.(2)制备糖茶水：将1000ml水煮开杀菌，称取茶叶(红茶)加入沸水中，茶叶用量为15g。然后加入80g白砂糖，全部溶解。准备好已灭菌的容器，将茶糖水加入容器中，降至室温。
40.(3)红茶菌发酵：将温驯驹形杆菌sw
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1：酿酒酵母：嗜酸乳杆菌按照接种量3％：1％：2％的比例接种至茶糖水中，30℃静置发酵3d。
41.(4)过滤后熟：取发酵3d的红茶菌液，经过滤后进行巴氏杀菌。杀菌后的红茶菌发酵液避光常温后熟5
‑
10d后即可。
42.对发酵完成的红茶菌液进行抗氧化性、总黄酮含量、总多酚含量的测定，均以未发酵茶水作为对照，结果见表一。
43.表一：实施例3营养指标。
44.实施例4：说明以红茶为原料进行红茶菌饮料发酵
45.(1)种子液的制备：将于冰箱4℃保藏的sw
‑
1斜面接种至装液量100ml的250ml三角
瓶中(1l液体培养基配方：葡萄糖80g、酵母粉20g、海藻糖11g、na2hpo
4 3g、乳酸3g、mgso
4 0.5g、无水乙醇20ml)，30℃、90r/min培养36h；将酿酒酵母斜面接种至ypd培养基装液量100ml的250ml三角瓶中，30℃、180r/min培养24h；将嗜酸乳杆菌斜面接种至mrs培养基装液量100ml的250ml三角瓶中，37℃、180r/min培养36h。
46.(2)制备糖茶水：将1000ml水煮开杀菌，称取茶叶(红茶)加入沸水中，茶叶用量为20g。然后加入100g白砂糖，全部溶解。准备好已灭菌的容器，将茶糖水加入容器中，降至室温。
47.(3)红茶菌发酵：将温驯驹形杆菌sw
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1：酿酒酵母：嗜酸乳杆菌按照5％：3％：2％的比例接种至茶糖水中，30℃静置发酵4d。
48.(4)过滤后熟：取发酵4d的红茶菌液，经过滤后进行巴氏杀菌，杀菌后的红茶菌发酵液避光常温后熟5
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10d后即可饮用。
49.对发酵完成的红茶菌液进行抗氧化性、总黄酮含量、总多酚含量的测定，均以未发酵茶水作为对照，结果见表二。
50.表二：实施例4营养指标。
51.对本实施例的挥发性风味物质进行分析，经过数据处理后，共检出29种醇类化合物，17种醛/酮类化合物，17种有机酸，21种酯类化合物，合计84种挥发性风味物质，具体物质见表五。
52.实施例5：说明以绿茶为原料进行红茶菌饮料发酵。
53.(1)种子液的制备：将于冰箱4℃保藏的sw
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1斜面接种至装液量100ml的250ml三角瓶中(1l液体培养基配方：葡萄糖80g，酵母粉20g，海藻糖10g，na2hpo
4 3g，乳酸2g，mgso
4 0.4g，无水乙醇20ml)，28℃、90r/min培养36h；将酿酒酵母斜面接种至ypd培养基装液量100ml的250ml三角瓶中，30℃、180r/min培养24h；将嗜酸乳杆菌斜面接种至mrs培养基装液量100ml的250ml三角瓶中，37℃、180r/min培养36h。
54.(2)制备糖茶水：将1000ml水煮开杀菌，称取茶叶(绿茶)15g，待水降至40℃以下后加入水中，然后加入100g白砂糖，全部溶解。准备好已灭菌的容器，将茶糖水加入容器中。
55.(3)红茶菌发酵：将温驯驹形杆菌sw
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1：酿酒酵母：嗜酸乳杆菌按照4％:2％:3％的比例接种至降至室温的茶糖水中，30℃静置发酵4d。
56.(4)过滤后熟：取发酵4d的红茶菌液，经过滤后进行巴氏杀菌。杀菌后的红茶菌发酵液避光常温后熟5
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10d后即可饮用。
57.对发酵完成的红茶菌液进行抗氧化性、总黄酮含量、总多酚含量的测定，均以未发酵茶水作为对照，结果见表三。
58.表三：实施例5营养指标。
59.对本实施例的挥发性风味物质进行分析，经过数据处理后，共检出16种醇类化合物，8种醛/酮类化合物，15种有机酸，20种酯类化合物，共计59种挥发性风味物质，具体见表五。
60.实施例6：说明以绿茶为原料进行红茶菌饮料发酵
61.(1)种子液的制备：将于冰箱4℃保藏的sw
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1斜面接种至装液量100ml的250ml三角瓶中(1l液体培养基配方：葡萄糖70g，酵母粉15g，海藻糖10g，na2hpo
4 3g，乳酸2g，mgso
4 0.4g，无水乙醇20ml)，28℃、70r/min培养36h；将酿酒酵母斜面接种至ypd培养基装液量100ml的250ml三角瓶中，30℃、180r/min培养24h；将嗜酸乳杆菌斜面接种至mrs培养基装液量100ml的250ml三角瓶中，37℃、180r/min培养36h。
62.(2)制备糖茶水：将1000ml水煮开杀菌，称取茶叶(绿茶)，待水降至40℃以下后加入水中，茶叶用量为10g。然后加入90g白砂糖，全部溶解。准备好已灭菌的容器，将茶糖水加入容器中。
63.(3)红茶菌发酵：将温驯驹形杆菌sw
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1：酿酒酵母：嗜酸乳杆菌按照3％：2％：1％的比例接种至降至室温的茶糖水中，30℃静置发酵3d。
64.(4)过滤后熟：取发酵3d的红茶菌液，经过滤后进行巴氏杀菌。杀菌后的红茶菌发酵液避光常温后熟5
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10d后即可饮用。
65.对发酵完成的红茶菌液进行抗氧化性、总黄酮含量、总多酚含量的测定，均以未发酵茶水作为对照，结果见表四。
66.表四：实施例6营养指标。
67.通过对实施例3、4、5、6进行dpph自由基清除率，总黄酮含量与总多酚含量，共计三项营养指标的测定，发现其含量对比未发酵茶水均有较大程度的提高，说明通过纯化红茶菌进行发酵，能较好地转化利用茶叶中的天然成分，提高茶叶的附加值。
68.表五：实施例4、5中的挥发性风味物质。
69.需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实
质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。