一种人眼眶脂肪前体细胞系、构建方法和用途与流程

1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种人眼眶脂肪前体细胞系、构建方法和用途。


背景技术：

2.甲状腺相关眼病(thyroid associated ophthalmopathy，tao)主要由甲状腺机能亢进(甲亢，又称graves’disease,gd)引起的一种以突眼为重要体征的器官特异性自身免疫性疾病。tao的发病与眼眶脂肪组织的炎症和增生密切相关。tao的病理变化引起眼后压升高，压迫视神经导致视神经病变；凸出的眼球使角膜暴露而易受损。这些病变不但引起视功能障碍，甚至失明，同时也造成畸形的外观，影响患者社会心理健康。tao患者生活质量受到严重影响，其生活质量相当于糖尿病或某些癌症患者。tao发病率高，是最主要的眼眶疾病。全球gd患病率在0.2-1.3％之间，其中会引起轻度和中-重度tao的比例分别约20-30％和5％。中/重度tao患者需要接受药物或手术治疗以防止或纠正受损视力和畸形外观。然而由于tao发病机制仍未完全阐明，对tao的治疗不能对症下药。因此深入研究tao的发病机理对tao病理认识和开发新型治疗药物上都有着重要的意义。
3.甲状腺突眼症发病的一个重要原因是脂肪组织的增生。现有技术中，永生化脂肪细胞的相关文献中，中国专利cn100595274c公开了一种能分化为脂肪细胞的新的人前体脂肪细胞系，且其用于开发抗肥胖、糖尿病和心血管疾病的药物以及食物成分和补充剂的用途。该专利研究机体内白色脂肪组织的功能，且提供方法用于研究新药或食物成分对白色脂肪组织的作用。中国专利cn109628404a公开了一种猪皮下脂肪前体细胞永生化细胞系的建立方法及用途。人眼眶脂肪细胞由外胚层细胞发育而来，区别于其他部位来源于中胚层的脂肪细胞，对外界刺激与其他来源的脂肪前体细胞有所区别，因此不能用上述专利中所用的细胞系用于开发治疗甲状腺突眼症的药物以及食物成份和补充剂的用途。同时人眼眶脂肪前体细胞来自外胚层的神经脊细胞，还具体分化成神经细胞和角膜上皮细胞的能力，其他来源的脂肪前体细胞不具有这种功能，因此也可以作为研究视网膜神经和角膜再生的细胞模型。
4.目前的脂肪细胞模型主要有3t3-l1或皮下脂肪细胞，缺少针对甲状腺相关眼病构建的脂肪细胞模型。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种人眼眶脂肪前体细胞系、该细胞系的构建方法和用途，该细胞系作为脂肪细胞研究模型，能够用于甲状腺相关眼病的药物筛选。
6.为了达到上述目的，本发明提供了一种人眼眶脂肪前体细胞系，该细胞系通过将人眼眶脂肪前体细胞永生化后获得。
7.较佳地，该细胞系由来源于人眼眶脂肪组织的人眼眶脂肪前体细胞经永生化后得到，所述的眼眶脂肪组织来源于健康人群或甲状腺突眼症患者。
8.本发明还提供了上述的人眼眶脂肪前体细胞系的构建方法，包含以下步骤：步骤1，从人眼眶脂肪组织中分离培养人眼眶脂肪前体细胞；步骤2，将连接有htert基因的载体转染人眼眶脂肪前体细胞，使细胞过表达htert；步骤3，筛选出cd90表达阴性的人眼眶脂肪前体细胞。
9.较佳地，步骤2中的htert基因的表达载体为pbabe-htert-hygro质粒。
10.较佳地，步骤3具体包含：在人眼眶脂肪前体细胞中加入cd90抗体，然后通过抗igg微珠，经磁珠筛选后获得cd90表达阴性的人眼眶脂肪前体细胞。
11.本发明还提供了上述的人眼眶脂肪前体细胞系的用途，该细胞系用于能够预防或治疗甲状腺相关眼病的药物的筛选。
12.本发明还提供了上述的人眼眶脂肪前体细胞系的另一用途，该细胞系用于筛选能够预防或治疗眼眶脂肪组织炎症的药物。
13.本发明还提供了上述的人眼眶脂肪前体细胞系的另一用途，该细胞系用于筛选或鉴定能够控制人眼眶脂肪前体细胞向神经细胞或角膜上皮细胞分化的化合物，所述的化合物包含蛋白质。
14.本发明还提供了上述的人眼眶脂肪前体细胞系的另一用途，所述的人眼眶脂肪前体细胞系作为人眼眶脂肪细胞分化研究模型的用途。
15.本发明还提供了上述的人眼眶脂肪前体细胞系的另一用途，所述的人眼眶脂肪前体细胞系作为研究视网膜神经和角膜再生的细胞模型的用途。
16.有益效果：
17.(1)本发明的人眼眶脂肪前体细胞系可选择来源于临床甲状腺相关眼病患者的眼眶脂肪组织，适用于甲状腺相关眼病的药物筛选。
18.(2)本发明的人眼眶脂肪前体细胞系是永生化的细胞，可长期传代。
19.(3)本发明的人眼眶脂肪前体细胞系能够分化为成熟脂肪细胞，能够作为研究脂肪细胞分化的模型。
附图说明
20.图1为本发明提供的人眼眶脂肪前体细胞系的构建方法的流程图。
21.图2a为实施例的原代和永生化眼眶脂肪前体细胞在显微镜下的形态。
22.图2b显示实施例的2株原代和永生化眼眶脂肪前体细胞的生长细胞数的倍增的时间。
23.图3为实施例中经永生化处理的人眼眶脂肪前体细胞用cd90抗体负筛选前后的细胞的荧光显微镜图，其中用cd90抗体(绿色)检测cd90阳性细胞，细胞核用dapi染色(蓝色)显示。
24.图4a为实施例的未经cd90抗体负筛以及cd90阴性的细胞，诱导分化为脂肪细胞后，用油红染色的显微镜图。
25.图4b为实施例的细胞分化前后，以及未经cd90抗体负筛以及cd90阴性的细胞，诱导分化为脂肪细胞后，qrt-pcr检测脂肪细胞标志基因ap2表达的结果图。
26.图5为皮下脂肪前体细胞和本发明的人眼眶脂肪前体细胞系用于药物筛选的结果对比图。
具体实施方式
27.以下结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。
28.实施例
29.如图1所示，为本发明的人眼眶脂肪前体细胞系构建方法的流程图。本发明的人眼眶脂肪前体细胞系由以下方法构建得到。
30.1)人源眼眶原代脂肪细胞分离
31.眼眶脂肪组织来源于健康人群和甲状腺突眼患者，将取到的组织用生理盐水漂洗1-2遍，去除血水，用消毒的剪刀将组织充分剪碎，放入胶原蛋白酶在37度水浴锅中消化30分钟。消化后经100um的细胞筛网，600rpm离心5min后铺于培养皿中，培养得到人眼眶脂肪前体细胞。本发明中，采用来源于健康人群和甲状腺突眼患者的眼眶脂肪组织，均能够构建得到本发明的人眼眶脂肪前体细胞系，本发明并未发现来源于健康人群或甲状腺突眼患者的人眼眶脂肪前体细胞系存在区别特征。以下步骤中的人眼眶脂肪前体细胞系为来源于健康人群的人眼眶脂肪前体细胞系。
32.2)眼眶原代细胞永生化
33.在ampho细胞中转染pbabe-htert-hygro质粒，孵育48小时后收集ampho细胞培养液的上清，将该上清通过0.45μm的过滤膜，加入8μg/ml的聚凝胺(polybrene)，随后感染步骤1中的人眼眶脂肪前体细胞，孵育48小时后加入潮霉素(hygromycin)开始筛选，两周后可以去掉抗生素；获得永生化的人眼眶脂肪前体细胞。
34.如图2a所示，为原代和永生化眼眶脂肪前体细胞在显微镜下的形态，取两组细胞株(细胞株#1和细胞株#2)进行观察。图2b显示实施例的2株原代和永生化眼眶脂肪前体细胞的生长细胞数的倍增的时间，结果显示永生化的人源眼眶脂肪前体细胞的生长细胞数倍增时间降低。
35.3)cd90阴性人眼眶脂肪前体细胞筛选
36.取200μl步骤(2)中经永生化处理后的人源眼眶脂肪前体细胞的细胞，与cd90抗体混合，在室温下孵育20min，随后于600rpm离心5min，去上清，用pbs重悬沉淀，加入抗小鼠igg微珠，在室温下各孵育20min，于600rpm离心5min，用500μl培养液重悬细胞，吹打混匀，得到细胞重悬液。macs分离器(macs seperator)使用前用500μl培养液润湿，将500μl细胞重悬液通过macs seperator磁柱，过柱得到的细胞悬液即为cd90阴性人眼眶脂肪前体细胞，即本发明提供的人眼眶脂肪前体细胞系。
37.如图3所示，为用cd90抗体负筛选前后的细胞的荧光显微镜图，其中用cd90抗体(绿色)检测cd90阳性细胞，细胞核用dapi染色(蓝色)显示。图3的a为筛选前的细胞用cd90抗体检测后的结果图，图3的d为筛选后获得的cd90阴性人眼眶前体细胞，d图并未发现有荧光；dapi染色结果如图3的b和图3的e所示，细胞核均显示蓝色；cd90抗体和dapi染色后，细胞图片融合结果如图3的c和图3的f图所示。结果表明，成功筛选得到cd90阴性的人眼眶脂肪前体细胞。
38.4)脂肪细胞分化；
39.cd90阴性人眼眶前体细胞充分长满后，加入如下诱导剂进行脂肪分化：包括5μg/ml胰岛素，1μm的塞米松，0.5mm异苯甲酸酯(ibmx)和1μm罗格列酮。在第2，4，6，8，10，12天换新鲜培养液(10％fbs 5μg/ml胰岛素 1μm罗格列酮)。分化完成后，油红染色并用qrt-pcr实
验分析脂肪细胞标志基因ap2的表达。
40.如图4a所示，为筛选出的cd90阴性人眼眶前体细胞和未经cd90抗体筛选的细胞进行分化后，用油红染色的结果图，结果表明，经cd90抗体筛选的细胞比未经cd90抗体筛选的细胞具有更强的脂肪细胞分化能力。
41.如图4b所述，未经诱导分化的细胞其脂肪细胞标志基因ap2不表达，未经cd90抗体筛选的细胞由于混杂有无法分化为脂肪细胞的cd90阳性细胞，检测到的基因ap2的相对表达量比cd90抗体筛选后的细胞低。
42.5)对药物的反应
43.两种药物分别对皮下脂肪前体细胞和人眼眶脂肪前体细胞(采用本发明的人眼眶脂肪前体细胞系)进行作用，观察两种细胞的药物响应。
44.细胞培养液中加入的药物a(rimonabant，利莫那班)的浓度为0、100nm和250nm，加入的药物b(pargyline，优降宁)的浓度为0、3mm和6mm。
45.图5的a为皮下脂肪前体细胞在不同药物浓度下的显微镜图，图5的c为人眼眶脂肪前体细胞在不同药物浓度下的显微镜图。
46.图5的b为皮下脂肪前体细胞诱导分化为脂肪细胞后，用q-pcr实验检测的ap2基因的相对表达量。图5的d为人眼眶脂肪前体细胞诱导分化为脂肪细胞后，用q-pcr实验检测的ap2基因的相对表达量。图5的b和图5的d表明，两种细胞对药物响应不同，因此在药物筛选时，针对不同的实验目的，应采用不同的脂肪细胞模型。
47.综上所述，本发明提供了一种人眼眶脂肪前体细胞系，该细胞系可作为细胞模型，用于药物筛选。
48.尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。