一种GCA-NAb单克隆抗体、杂交瘤细胞株、应用的制作方法

一种gca
‑
nab单克隆抗体、杂交瘤细胞株、应用
技术领域
1.本发明属于医学和生物化学技术领域，具体地，涉及一种颗粒钙蛋白 (grancalcin,gca)中和抗体(gca neutralizing antibody,gca
‑
nab)及产 生该抗体的杂交瘤细胞株，以及该抗体在制备治疗骨质疏松症药物中的应用。


背景技术：

2.骨质疏松症(osteoporosis,op)是一种以骨量减少、骨微结构破坏导致 骨骼脆性增加、骨折风险增高为特征的代谢性骨病。2018年发布的全国首个 骨质疏松症流行病学调查数据显示，65岁以上人群骨质疏松症患病率高达 32.0％，显著增加老年人致残及全因死亡的风险，为社会带来沉重的经济及 医疗负担。
3.目前，临床上治疗骨质疏松的药物仍以骨吸收抑制剂为主(如双磷酸盐 类)，然而长期治疗存在价格高、患者依从性差、口服制剂消化道黏膜副作 用大、静脉制剂会引起下颌骨坏死及非典型骨折等问题。
4.颗粒钙蛋白(grancalcin,gca)是一组具有5个ef手形模体的钙结合 蛋白penta
‑
ef
‑
hand(pef)蛋白质家族的一员，gca
‑
nab，即gca neutralizingantibody，是gca的中和抗体，可阻断gca的生物活性。但迄今为止尚未 见到有关gca中和抗体gca
‑
nab用于制备治疗骨质疏松症药物的报道。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术中治疗骨质疏松症的药 物存在价格高、患者依从性差、口服制剂消化道黏膜副作用大、静脉制剂会 引起下颌骨坏死及非典型骨折等缺陷，而提供了一种gca
‑
nab单克隆抗体、 杂交瘤细胞株、应用。本发明中的gca中和抗体gca
‑
nab可为开发治疗骨 质疏松症的药物提供研究基础及理论依据。
6.其具体技术方案如下。
7.本发明提供了一种可分泌gca
‑
nab单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述 杂交瘤细胞株的保藏编号为cctcc no：c2021182。
8.本发明还提供了一种所述的杂交瘤细胞株分泌的gca
‑
nab单克隆抗体。
9.本发明还提供了一种上述的杂交瘤细胞株在制备预防或治疗骨质疏松 症药物中的应用。
10.本发明还提供了一种上述的gca
‑
nab单克隆抗体在制备预防或治疗骨 质疏松症药物中的应用。
11.本发明还提供了一种上述的gca
‑
nab单克隆抗体作为基因runx2、sp7、 alp表达促进剂的应用。
12.本发明还提供了一种免疫原性肽段，所述免疫原性肽段的氨基酸序列如 seq id no.1所示。
13.本发明中，所述免疫原性肽段的编码基因序列可如seq id no.2所示。
14.本发明还提供了一种所述的免疫原性肽段作为基因runx2、sp7、alp 表达抑制剂的应用。
15.本发明还提供了一种用于免疫学检测的试剂盒，其包括如前所述的杂交 瘤细胞株，或者如前所述的免疫原性肽段，或者如前所述的单克隆抗体；
16.优选地，所述试剂盒还包括检测板、酶标抗体、显色液和终止液。
17.其中，所述的试剂盒可为本领域常规的试剂盒，例如血液及细胞上清 gca检测试剂盒或尿微量gca检测试剂盒；或者，极微量或残留量 gca
‑
nab检测试剂盒或尿微量gca
‑
nab检测试剂盒。
18.在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发 明各较佳实例。
19.本发明所用试剂和原料均市售可得。
20.本发明的积极进步效果在于：
21.本发明中的gca
‑
nab可有效阻断gca对骨代谢的抑制作用，从而明显 改善骨量，延缓骨质疏松症的发展。具体地：
22.(1)gca
‑
nab可逆转gca对bmsc成骨分化的抑制作用，加入 gca
‑
nab干预的bmsc细胞runx2、sp7、alp的mrna水平明显较gca 处理组明显增加；
23.(2)gca
‑
nab能改善骨量，增加骨体积分数(bv/tv)、骨小梁数量 (tb.n)、骨小梁厚度(tb.th)及骨形成率，而减少骨小梁分离度(tb.sp)；
24.(3)gca
‑
nab能增加ocn

的成骨细胞、trap

的破骨细胞、血清中ctx 的浓度，减少脂肪细胞的数量及面积。
25.生物材料保藏信息
26.本发明的杂交瘤细胞系，于2021年08月03日保藏在中国典型培养物 保藏中心(cctcc)，保藏地址：中国湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学邮 编430072，保藏编号为cctcc no：c2021182，培养物名称为杂交瘤细胞 株gca
‑
nab4。
附图说明
27.图1为经过筛选获得的可与免疫原结合的gca
‑
nab中和抗体；
28.图2a为gca及gca
‑
nab分别处理bmsc并进行成骨诱导的茜素红染 色示意图；
29.图2b
‑
d为gca
‑
nab逆转gca对成骨分化抑制作用的qpcr结果示意 图；
30.图3a为15月龄的老年鼠鼠尾静脉注射gca
‑
nab后骨量增加的骨扫描 三维重建图；
31.图3b为15月龄的老年鼠鼠尾静脉注射gca
‑
nab后骨量增加的 micro
‑
ct骨参数分析示意图；
32.图4a为15月龄的老年鼠鼠尾静脉注射gca
‑
nab后进行钙黄绿素双标 实验的染色示意图；
33.图4b为15月龄的老年鼠鼠尾静脉注射gca
‑
nab后骨形成率增加的示 意图；
34.图5a为15月龄的老年鼠鼠尾静脉注射gca
‑
nab后骨钙素(ocn)染 色的示意图，箭头表示ocn阳性(ocn )的细胞；
35.图5b为15月龄的老年鼠鼠尾静脉注射gca
‑
nab后ocn 细胞数量的 统计分析图；
36.图6a为15月龄的老年鼠鼠尾静脉注射gca
‑
nab后碱性磷酸酶(trap) 染色的示意
图，箭头表示trap阳性(trap )的细胞；
37.图6b为15月龄的老年鼠鼠尾静脉注射gca
‑
nab后trap阳性(trap ) 细胞数量的统计分析图；
38.图7为15月龄的老年鼠鼠尾静脉注射gca
‑
nab后血清i型胶原交联 c
‑
末端肽(ctx)水平的示意图；
39.图8a为15月龄的老年鼠鼠尾静脉注射gca
‑
nab后苏木素
‑
伊红染色 (he)染色的示意图；
40.图8b为15月龄的老年鼠鼠尾静脉注射gca
‑
nab并进行he染色后脂 肪细胞数量及面积的统计分析图。
具体实施方式
41.下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在 所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常 规方法和条件，或按照商品说明书选择。
42.实施例1免疫原制备及动物免疫
43.(1)通过pcr扩增如seq id no.2所示目的基因序列，将目的基因插入对 应表达载体；测序得到含有正确序列的质粒；质粒放大生产传递下游表达。
44.(2)从含有重组杆粒的e coli细胞中提取杆粒dna，感染昆虫细胞后得到 p1重组杆状病毒。p1代病毒随即被转入sf9昆虫细胞继续扩增得到高滴度 p2代重组病毒。
45.(3)将高滴度p2代重组病毒按一定感染复数(moi)感染处于对数生长期 的high
‑
five昆虫细胞。感染后的细胞在27摄氏度下继续培养2
‑
3天以表达 目的蛋白。
46.(4)适用平衡缓冲液平衡层析柱，将离心过滤后的发酵液上清或细胞裂解 上清液加样后用平衡缓冲液淋洗去除部分杂蛋白，随后使用含有不同洗脱剂 (nacl或咪唑)浓度的缓冲液洗脱目标蛋白。收集洗脱组分后将蛋白脱盐至 储存缓冲液中。对于不溶蛋白，裂解细胞过程中可能加入尿素等变性剂溶解 目标蛋白后进行层析柱纯化，层析柱洗脱含目标蛋白的洗脱组分采用逐级透 析法去除变性剂并复性蛋白，最终将复性后蛋白脱盐至储存缓冲液中。
47.(5)获取的蛋白样本采取sds
‑
page和uv od
280
等方法进行纯度检测和定 量。即可产生所需的免疫原gca，其蛋白序列如seq id no.1所示。
48.(6)免疫balb/c小鼠5只(每只体重约16
‑
20g)，剂量50μg/只(以“免疫 原 佐剂”的混合液计)，将免疫原与等体积的佐剂(完全/不完全弗氏佐剂， 分别购自sigma公司(货号f5881)、bd公司(货号263910))混合，腹部 皮下多点注射，间隔2周第二次免疫，再间隔3周第三次免疫，三次免疫后 取血测定血清效价。挑选小鼠进行加强免疫，于加强免疫3天后取小鼠脾脏 进行杂交瘤融合。
49.表1 gca蛋白基本理化性质
50.长度236分子量(kda)26.4等电点5.91不稳定指数33.07
总平均亲水性(grand average of hydropathicity(gravy)
‑
0.33
51.以下为gca蛋白及基因序列
52.gca蛋白序列(seq id no.1)
53.mhhhhhhhhhhlevlfqgpmaypgygggfgnfsiqvpgmqmgqpvpe tgpailldgysgpaysdtyssagdsvytyfsavagqdgevdaeelqrclt qsgingtyspfsletcrimiamldrdhtgkmgfnafkelwaalnawken fmtvdqdgsgtvehhelrqaiglmgyrlspqtlttivkryskngriffdd yvaccvklraltdffrkrdhlqqgsanfiyddflqgtmai
54.gca基因序列(seq id no.2)
55.atgcatcatcaccatcaccaccaccatcaccatctggaagtcctgtttc agggacccatggcctacccgggatacggaggagggtttggaaatttta gcattcaggtgccaggaatgcagatgggacagccagtgccagaaaca ggcccagctatactcctcgatggatactctgggccagcatattcagaca cttattcctcagctggtgactccgtgtatacttacttcagtgctgttgct ggacaggatggtgaagtggatgctgaagaacttcagagatgtttgac acagtctggaattaatggaacttactctcccttcagtttggaaacctgc agaattatgattgccatgttggatagagatcacacaggaaaaatgggat ttaatgcattcaaagagctatgggcagctcttaatgcctggaaggaaa acttcatgactgttgatcaagatggaagtggcacagtagaacatcatg agttgcgtcaagccattggtcttatgggttataggttgagtcctcaaac attaactactattgttaaacgttatagcaagaatggcagaattttctttg atgattatgttgcttgctgtgtgaagcttcgagcattgacagatttcttt aggaaaagagaccacttgcaacaagggtctgcgaatttcatatatgac gattttttgcagggcactatggcaatttaa
56.实施例2采血及效价检测
57.于末次免疫后一周，经小鼠眶静脉丛取血50～60μl，4℃静置过夜后， 离心分离上层血清备检；
58.适量检测用蛋白，用包被缓冲液稀释成5μg/ml，然后用单道移液器在 96孔板每孔中加入100μl，轻拍板子使样品混匀，用保鲜膜封严，4℃下包 被过夜；用洗涤液按200μl/孔洗板1次，扣干酶标板；再用封闭液按300μl/ 孔封闭酶标板，室温下封闭1小时；用洗涤液按400μl/孔洗板2次后加样 (将经过梯度稀释的样品及样品稀释剂以100μl/孔加样)，同时加入检测抗 体，以100μl/孔加至96孔板内，室温下作用2小时；用洗涤液按400μl/孔 洗板5次，以200μl/孔加入显色液室温放置12min；以50μl/孔加入终止液 终止反应；用酶标仪进行检测：测定波长为450nm。
59.实施例3融合及筛选
60.取免疫后小鼠全部脾细胞，按1：1比例与小鼠骨髓瘤细胞混合，利用 电融合法进行融合，获得杂交瘤细胞。使用抗原蛋白进行包被，用elisa 法测定细胞上清液，选取阳性孔通过有限稀释进行克隆化，直至得到稳定分 泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，筛选后共获得4株杂交瘤细胞，其上清均与 免疫原结合，即单克隆抗体gca
‑
nab制备成功(见图1)，后续选择克隆编 号mm04h的杂交瘤细胞进行抗体制备(保藏编号为cctcc no：c2021182)。
61.实施例4杂交瘤小量培养
62.将1ml杂交瘤细胞转入100ml培养瓶中，定期加入一定量的培养基进 行细胞扩增，培养10
‑
12天。
63.实施例5纯化
64.protein a亲和层析柱用超纯水冲洗，然后用平衡缓冲液平衡；将处理好 的杂交
瘤细胞上清上样亲和层析柱，上样完毕后，用平衡缓冲液淋洗。洗脱 缓冲液洗脱，收集洗脱峰，用tris缓冲液中和，脱盐至pbs7.4，得gca
‑
nab。
65.实施例6gca
‑
nab可逆转gca对骨髓间充质干细胞成骨分化的抑制作 用
66.按照细胞密度为5
×
103/cm2，将骨髓间充质干细胞(bmsc)接种在含 有0.1mm地塞米松，10mmβ
‑
甘油磷酸盐和50mm抗坏血酸
‑2‑
磷酸盐，10％ 胎牛血清的α
‑
mem培养基中，将其分为对照组(pbs)，rgca处理组(实 施例1中制备得到的gca蛋白)及gca
‑
nab处理组(实施例5中制备得到 的gca
‑
nab)。分化培养6
‑
9天后，通过qpcr分析成骨相关基因的表达水 平；分化3周后，通过茜素红染色评估细胞的矿化能力。
67.参见图2，各数值表示为三次检测的平均值
±
sd。*，与经pbs处理的 对照组细胞相比，p<0.01；#，与rgca处理的细胞相比p<0.01。
68.表2
69.组别runx2相对表达水平sp7相对表达水平alp相对表达水平pbs1.142
±
0.1051.090
±
0.1291.027
±
0.187rgca0.186
±
0.066*0.177
±
0.060*0.341
±
0.128*gca
‑
nab0.709
±
0.089*#0.685
±
0.103*#0.636
±
0.035*#
70.从图2a可以看出，与pbs处理的对照组相比，加入gca后bmsc细 胞的矿化能力明显降低，而加入了gca
‑
nab干预的bmsc细胞的矿化能力 较gca处理组明显增加。
71.从图2b
‑
d可以看出，与pbs对照组相比，加入gca处理后bmsc细 胞的成骨相关基因runx2、sp7、alp的mrna水平明显降低，而加入 gca
‑
nab干预的bmsc细胞runx2、sp7、alp的mrna水平明显较gca 处理组明显增加。此结果说明，gca
‑
nab可逆转gca对bmsc成骨分化的 抑制作用。
72.实施例7gca
‑
nab可以通过拮抗gca对骨转换和脂肪积累的影响来改 善骨骼老化
73.骨骼老化是一个复杂的过程，其特征是骨形成减少，骨吸收及骨髓脂肪 增加以及干细胞命运分化的偏移。由于前期观察到gca
‑
nab可逆转gca对 骨髓间充质干细胞成骨分化的抑制作用，因此进一步猜想它对骨骼老化是否 有改善作用。将15月龄的老年鼠分为对照组和处理组，对照组予以鼠尾静 脉注射pbs，处理组通过鼠尾静脉注射实施例5制得的gca
‑
nab(1mg/kg)， 每周2次，持续注射2个月。2个月后分别对两组小鼠进行心尖取血，检测 血清中ctx的水平。之后处死各组小鼠，留取双侧股骨，一侧股骨经甲醛 固定后，置于样品管中进行ct扫描，然后进行micro
‑
ct分析、三维重建， 观察骨量情况；另外一侧股骨置于10％edta脱钙液中脱钙2
‑
3周，经石蜡 包埋、切片后，分别进行ocn、trap及he染色。
74.参见图3
‑
8，各数值表示为三次检测的平均值
±
sd。*，与经pbs处理 的对照组相比，p<0.01。
75.表3
76.组别bv/tv(％)tb.n(mm)tb.th(μm)tb.sp(μm)pbs9.489
±
1.9643.863
±
0.11023.242
±
6.308368.978
±
44.010gca
‑
nab12.320
±
2.230*4.458
±
0.661*30.439
±
4.728*312.078
±
30.606*
77.从图3a的骨扫描重建图可以看出，与pbs对照组相比，gca
‑
nab处 理组的骨量明显增多。从图3b的mirco
‑
ct分析参数可以看出，gca
‑
nab 组小鼠的骨体积分数(bv/tv)、骨小梁数量(tb.n)及骨小梁厚度(tb.th) 均明显增加，而骨小梁分离度(tb.sp)减少。
78.表4
79.组别bfr/bs(mm3/mm2/yr)pbs4.073
±
0.726gca
‑
nab5.982
±
0.590*
80.从图4可以看出，与pbs对照组相比，gca
‑
nab组注射钙黄绿素后的 骨形成率(bfr/bs)明显增加。以上这些结果说明，15月龄的老年鼠鼠尾 静脉注射gca
‑
nab后骨量明显增加。
81.表5
82.组别ocn

的成骨细胞数/骨面积(n/mm2)pbs4.463
±
0.500gca
‑
nab5.805
±
0.365*
83.从图5a及图5b可以看出，与pbs对照组相比，15月龄的老年鼠鼠尾 静脉注射gca
‑
nab后，ocn 的成骨细胞明显增加。
84.表6
85.组别trap

的破骨细胞数/骨周长(n/b.pm)pbs5.210
±
1.022gca
‑
nab8.022
±
0.954*
86.注：n/b.pm是指破骨细胞数(破骨细胞数量/骨周长)。
87.从图6a及图6b可以看出，gca
‑
nab组trap 的破骨细胞较对照组增 加。
88.表7
89.组别血清中ctx的浓度(ng/ml)pbs59.045
±
5.058gca
‑
nab73.026
±
6.833*
90.图7表示gca
‑
nab后，血清中ctx的浓度较pbs组有所增加。
91.表8
92.组别脂肪细胞数量/组织面积(n//mm2)脂肪细胞面积/组织面积(％)pbs262.912
±
10.44747.714
±
8.824gca
‑
nab204.659
±
15.925*32.772
±
2.478*
93.从图8a
‑
b的结果可以看出，与pbs对照组相比，15月龄的老年鼠鼠尾 静脉注射gca
‑
nab后，脂肪细胞的数量及面积均有明显减少。
94.上述结果说明，gca
‑
nab可以通过拮抗gca对骨转换和脂肪积累的影 响来改善骨骼老化。
95.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于 此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易 见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。