一种针刺血清外泌体及其制备方法和用途与流程

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种针刺血清外泌体及其制备方法和用途。


背景技术：

2.类风湿性关节炎是一种病因未明、以全身多关节的慢性滑膜炎症为特征，甚至可以导致关节的破坏和畸形的自身免疫性疾病。类风湿性关节炎发病率高、复发率高、致残率高，目前主要治疗药物包括非甾体抗炎药、皮质类固醇、改善病情抗风湿病药和生物制剂等，但是长期服用这些药物会导致多种副作用和不良反应，如心肌梗塞、消化性溃疡、伤口愈合不良、肝肾功能不全等。
3.中医对类风湿性关节炎的认识年代久远，风湿性疾病属于中医“痹证”、“历节”等范畴，病位主要在筋骨、关节、肌肉，主要表现为关节红、肿、热、痛、活动不利，轻者四肢肌肉关节受累，重者内舍于脏，引起脏腑的病变。本病属本虚标实，本虚为阴阳、气血、脏腑亏损，标实有外邪、痰浊、淤血之不同。
4.研究发现针灸可以改善类风湿性关节炎相关症状，在临床治疗中已显示出安全、有效、不良反应小等优势。针灸作为一种物理刺激，在穴位局部被感知并转化传递到病变部位发挥效应的过程是复杂的，直至目前针灸的起效机制尚未完全阐明。
5.外泌体(exosome)是很多细胞均可分泌的直径为40
‑
200nm的小囊泡，它天然存在于体液中，并在细胞之间的信号交流中扮演了重要角色。
6.综上，可将外泌体在细胞之间的信号交流与针灸针刺的物理刺激治疗相结合，以在本技术中提供一种能有效治疗类风湿性关节炎的针刺血清外泌体。


技术实现要素：

7.鉴于此，为实现类风湿性关节炎的有效治疗，本发明的目的在于提供一种针刺血清外泌体及其制备方法和用途。
8.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：。
9.一种针刺血清外泌体的制备方法，包括如下步骤：
10.s1.类风湿性关节炎模型的建立
11.于大鼠右后足足底注射完全弗式佐剂致炎，24小时后，对大鼠进行介入电针治疗，并利用全自动热辐射刺激仪测量大鼠足底痛阈，根据痛阈测量结果判断类风湿性关节炎模型是否造模成功；
12.s2.提取血清
13.对造模成功的大鼠进行腹主动脉血液样本采集；
14.血液样本静置2h后，于4℃、2000rpm的离心机中离心10min；
15.离心后，取上清液为血清，分装于ep管中，且每个ep管中分装500μl血清，并全部放入
‑
80℃的冰箱中冻存备用；
16.s3.提取外泌体
17.取步骤s2中冻存的血清，在4℃的冰箱中充分解冻；
18.血清解冻后，于4℃、3000gpm的离心机中离心15min；离心后，取上清液过滤，并收集滤液；
19.按4：1的混合比向所述滤液中加入沉淀剂，均匀混合；
20.将混合后的混合物置于4℃的冰箱中孵育30分钟；
21.孵育后，于4℃、1500gpm的离心机中离心5min；离心后，去除上清液，获得米白色外泌体沉淀颗粒。
22.优选的，在所述步骤s1的类风湿性关节炎模型的建立中，以痛阈降低75％为造模成功标准。
23.优选的，在所述步骤s1的类风湿性关节炎模型的建立中，利用1寸针灸针和sdz
‑
v型电子针疗仪对大鼠双侧足三里穴和环跳穴进行介入电针治疗，且三里穴处的针灸针与电子针疗仪正极连接，环跳穴处的针灸针与电子针疗仪负极连接。
24.优选的，在所述步骤s1的类风湿性关节炎模型的建立中，测量大鼠足底痛阈的同时还包括：利用游标卡尺测量大鼠足肿胀程度、以及利用psi激光多普勒血流仪测量大鼠局部充血状态。
25.优选的，所述足底痛阈通过热辐射刺激下大鼠患侧缩足时间表示；所述足肿胀程度通过大鼠患侧脚掌厚度表示；所述局部充血状态通过大鼠患侧足踝部皮肤的血流灌注量表示。
26.优选的，在测量局部充血状态之前，还包括将大鼠放入动物气体麻醉机中通气麻醉，且所述麻醉机中麻醉剂的通气浓度为异氟烷：氧气＝4：1ml/min。
27.优选的，所述步骤s2的提取血清在大鼠麻醉后进行。
28.优选的，在所述步骤s3的提取外泌体中，还包括：利用pbs缓冲液将外泌体沉淀颗粒重悬分装于ep管中，且外泌体沉淀颗粒：pbs缓冲液＝5：1，分装后保存于
‑
80℃的冰箱中。
29.一种针刺血清外泌体，采用上述所公开的制备方法制备得到。
30.一种针刺血清外泌体在制备用于治疗类风湿性关节炎药物中的应用。
31.本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
32.在本发明中，提供了一种新的可用于治疗类风湿性关节炎的针刺血清外泌体，且该外泌体在治疗过程中有效发挥了“类针刺”作用，进而产生镇痛抗炎效应。
附图说明
33.图1为本发明在造模及对应电针治疗过程中大鼠足底痛阈的测量图；
34.图2为本发明在造模及对应电针治疗过程中大鼠足肿胀程度的测量图；
35.图3为本发明在造模及对应电针治疗过程中大鼠局部充血状态的测量图；
36.图4为本发明中造模cfa组所释放的外泌体粒径检测图；
37.图5为本发明中造模ea组所释放的外泌体粒径检测图；
38.图6为本发明中造模cfa组与造模ea组所释放的外泌体透射电镜形态图；
39.图7为本发明在实验1及对应电针治疗过程中大鼠足底痛阈的测量图；
40.图8为本发明在实验2及对应电针治疗过程中大鼠足底痛阈的测量图；
41.图9为本发明在实验3及对应电针治疗过程中大鼠足底痛阈的测量图；
42.图10为本发明在实验4及对应电针治疗过程中大鼠足底痛阈的测量图。
具体实施方式
43.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
44.在本发明中，具体提供了一种针刺血清外泌体的制备方法，针对该制备方法具体包括如下实施例。
45.实施例1：类风湿性关节炎模型的建立
46.(1)分组
47.选用清洁级雄性健康wastar大鼠45只，体重(220
±
10)g。
48.所有大鼠均购自中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所实验动物中心[许可证号：scxk(军)2014
‑
0001]。
[0049]
所有大鼠饲养期间给予自由饮水饮食，室温25℃，湿度55％。
[0050]
颗粒鼠饲料由天津中医药大学实验动物中心提供，饮用水为自来水，在同等标准环境内适应性饲养1周后用于实验。
[0051]
采用microsoft excel随机数字法将符合热痛标准的大鼠进行分组，包括：盐水组(ns组)、完全弗式佐剂模型组(cfa组)、完全弗式佐剂模型组 电针组(ea组)。
[0052]
(2)造模
[0053]
于cfa组、ea组大鼠右后足足底注射完全弗式佐剂0.1ml/只，致炎；于ns组大鼠右后足同部位注射等量生理盐水。
[0054]
(3)针刺治疗并判断是否造模成功
[0055]
造模24小时后，对ea组大鼠进行介入电针治疗，具体治疗方法为：将所有大鼠穿鼠衣后分组排列固定于实验操作台上，腹部朝上，暴露足三里穴和环跳穴(其中ns组和cfa组的大鼠仅固定对照，不予治疗)。采用1寸针灸针刺入ea组大鼠双侧足三里穴和环跳穴处；进针后，连接sdz
‑
v型电子针疗仪，且三里穴处的针灸针与电子针疗仪正极连接，环跳穴处的针灸针与电子针疗仪负极连接，治疗参数为：疏密波频率2/10hz，疏密波强度5/10/15，各10min，共30min。另外，ea组在造模后隔日进行一次治疗。
[0056]
在上述治疗过程中，测量相应指标以确定针刺治疗效果；具体测量指标包括：大鼠足底痛阈、大鼠足肿胀程度和大鼠局部充血状态。
[0057]
关于大鼠足底痛阈的测量，在热辐射刺激下，通过全自动热辐射刺激仪测量大鼠患侧缩足时间表示。具体测量方法为：将大鼠放置于热辐射刺激仪玻璃板上，静卧15
‑
20min，待足底部完全平放于玻璃板上且状态稳定后，将聚光光源聚集于所测部位(脚掌中部拇趾侧的跖部)；以记录开始到大鼠抬足的时间作为相应的痛阈值；每只大鼠每次测定间隔为5min，连续测定3次，最后取平均值作为该大鼠的痛阈值，上述仅测患侧(右侧)。具体测量时间为：在分组前连续测量3天，并取平均值作为痛阈基础值；在造模后，每次电针治疗后的即刻和24h分别测量1次。
[0058]
基于上述测量获得图1所示的测量结果，其中：图1上图表示为治疗过程中在电针
治疗后即刻所测量的大鼠足底痛阈，图1下图表示为治疗过程中在电针治疗后24h所测量的大鼠足底痛阈。
[0059]
关于大鼠足肿胀程度的测量，利用游标卡尺测量大鼠患侧脚掌厚度表示。具体测量方法为：将游标卡尺置于足背最高点至足底中心略凹处，连续3次取平均值，所得数值为足肿胀值。具体测量时间与上述痛阈的测量时间相同。
[0060]
基于上述测量获得图2所示的测量结果，且图2表示为电针治疗对大鼠足肿胀程度的影响。
[0061]
关于大鼠局部充血状态的测量，利用psi激光多普勒血流仪测量大鼠患侧足踝部皮肤的血流灌注量表示。具体测量时间与上述痛阈的测量时间相同。具体测量方法为：将麻醉机中麻醉剂的通气浓度调整为异氟烷：氧气＝4：1ml/min，将大鼠放入动物气体麻醉机中通气麻醉，待大鼠倒下后即刻取出置于激光多普勒血流仪下。具体，血流灌注量越多，充血状态越严重。
[0062]
基于上述测量获得图3所示的测量结果，且图3表示为电针治疗对大鼠足踝部充血状态的影响。
[0063]
另外，在完成多次电针治疗及测量后，以痛阈降低75％为造模成功标准。
[0064]
实施例2：提取血清及外泌体
[0065]
在大鼠麻醉后的状态，对造模成功(针刺14次、造模后27天)的大鼠进行腹主动脉血液样本采集；
[0066]
血液样本静置2h后，于4℃、2000rpm的离心机中离心10min；
[0067]
离心后，取上清液为血清，分装于ep管中，且每个ep管中分装500μl血清，并全部放入
‑
80℃的冰箱中冻存备用；
[0068]
s3.提取外泌体
[0069]
取步骤s2中冻存的血清，在4℃的冰箱中充分解冻；
[0070]
血清解冻后，于4℃、3000gpm的离心机中离心15min；离心后，取上清液过滤，并收集滤液；
[0071]
按4：1的混合比向所述滤液中加入沉淀剂，均匀混合；
[0072]
将混合后的混合物置于4℃的冰箱中孵育30分钟；
[0073]
孵育后，于4℃、1500gpm的离心机中离心5min；离心后，去除上清液，获得米白色外泌体沉淀颗粒。该外泌体即为本发明所制备的类针刺外泌体。
[0074]
利用pbs缓冲液将外泌体沉淀颗粒重悬分装于ep管中，且外泌体沉淀颗粒：pbs缓冲液＝5：1，分装后保存于
‑
80℃的冰箱中。
[0075]
综上，在完成外泌体的提取后，进行nta外泌体粒径检测以及外泌体形态学电镜分析，以获得图4
‑
图6所示检测结果，其中：图4上图为cfa组外泌体直径分析图，图4下图为cfa组外泌体在稀释14000倍下的散点图；图5上图为ea组外泌体直径分析图，图5下图为ea组外泌体在稀释12000倍下的散点图；图6上图为cfa组外泌体透射电镜形态图，图6下图为ea组外泌体透射电镜形态图。结合图示结果可知，ea组所释放的外泌体明显多于cfa组，由此可确认针刺对外泌体的释放具有调控效果，而基于该效果，在本发明中进一步的探索大鼠针刺后的血清外泌体是否具有治疗类风湿性关节炎的能力，由此进行如下实验。
[0076]
实验1
[0077]
选用清洁级雄性健康wistar大鼠20只，体重(210
±
10)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证号：scxk(京)2016
‑
0006]。所有大鼠饲养期间给予自由饮水饮食，室温25℃，湿度55％。颗粒鼠饲料由天津中医药大学实验动物中心提供，自然光照，自由饮食，在同等标准环境内适应性饲养1周后进行实验。
[0078]
随机分组，每组5只，包括：模型组、模型 电针组、模型 拮抗剂组、模型 拮抗剂 电针组。
[0079]
分组后执行上述实施例1中的介入电针治疗，而关于其中模型 拮抗剂组、模型 拮抗剂 电针组，应在电针前1h进行拮抗剂(gw4869)的腹腔注射，且注射浓度为0.15mg/ml。
[0080]
本实验治疗过程中执行足底痛阈的测量，以此获得图7的测量结果；图7表示为本实验中在电针治疗后即刻所测量的大鼠足底痛阈，由图可知gw4869拮抗循环的添加显著减弱了针刺镇痛效应。
[0081]
实验2
[0082]
选用清洁级雄性健康wistar大鼠18只，体重(210
±
10)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证号：scxk(京)2016
‑
0006]。所有大鼠饲养期间给予自由饮水饮食，室温25℃，湿度55％。颗粒鼠饲料由天津中医药大学实验动物中心提供，自然光照，自由饮食，在同等标准环境内适应性饲养1周后进行实验。
[0083]
随机分组，每组6只，包括：盐水组、模型 类针刺外泌体腹腔循环组、模型 电针 类针刺外泌体腹腔循环组。
[0084]
分组后执行上述实施例1中的介入电针治疗，而关于其中模型 类针刺外泌体腹腔循环组、模型 电针 类针刺外泌体腹腔循环组，应在电针前18h进行类针刺外泌体的腹腔注射，且注射浓度为0.7mg/ml。
[0085]
本实验治疗过程中执行足底痛阈的测量，以此获得图8的测量结果；图8表示为本实验中在电针治疗后即刻所测量的大鼠足底痛阈，由此可知腹腔回输类针刺外泌体后可提升大鼠足底痛阈，从而则表明类针刺外泌体能有效在电针治疗中产生镇痛抗炎效应。
[0086]
实验3
[0087]
选用清洁级雄性健康wistar大鼠24只，体重(210
±
10)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证号：scxk(京)2016
‑
0006]。所有大鼠饲养期间给予自由饮水饮食，室温25℃，湿度55％。颗粒鼠饲料由天津中医药大学实验动物中心提供，自然光照，自由饮食，在同等标准环境内适应性饲养1周后进行实验。
[0088]
随机分组，每组6只，包括：模型组、电针组、模型 类针刺外泌体腹腔循环组、模型 类针刺外泌体足底回输组。
[0089]
分组后执行上述实施例1中的介入电针治疗，而关于其中模型 类针刺外泌体腹腔循环组、模型 类针刺外泌体足底回输组，应在电针前18h进行类针刺外泌体的腹腔和足底注射，具体腹腔注射浓度为0.5mg/ml，足底注射浓度为2.6mg/ml。
[0090]
本实验治疗过程中执行足底痛阈的测量，以此获得图9的测量结果；图9表示为本实验中在电针治疗后即刻所测量的大鼠足底痛阈，由图可知腹腔和足底类针刺外泌体后均可提升大鼠足底痛阈，从而说明类针刺外泌体能有效在电针治疗中产生镇痛抗炎效应。
[0091]
实验4
[0092]
选用清洁级雄性健康wistar大鼠18只，体重(210
±
10)g，购自北京维通利华实验
动物技术有限公司[许可证号：scxk(京)2016
‑
0006]。所有大鼠饲养期间给予自由饮水饮食，室温25℃，湿度55％。颗粒鼠饲料由天津中医药大学实验动物中心提供，自然光照，自由饮食，在同等标准环境内适应性饲养1周后进行实验。
[0093]
随机分组，每组6只，包括：模型组，模型 正常外泌体腹腔循环组、模型 正常外泌体足底回输组。
[0094]
分组后执行上述实施例1中的介入电针治疗，而关于其中模型 正常外泌体腹腔循环组、模型 正常外泌体足底回输组，应在电针前18h进行正常外泌体的腹腔和足底注射，具体腹腔注射浓度为0.5mg/ml，足底注射浓度为2.6mg/ml。
[0095]
本实验治疗过程中执行足底痛阈的测量，以此获得图10的测量结果；图10表示为本实验中在电针治疗后即刻所测量的大鼠足底痛阈，由图可知腹腔和足底回输正常外泌体后，对电针治疗均无明显的镇痛效果。
[0096]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。