一种可透气嵌入式细胞培养小室及其制备方法与流程

1.本发明涉及细胞培养相关技术领域，尤其涉及一种可透气嵌入式细胞培养小室及其制备方法。


背景技术：

2.实验中，氢气、氧气在内的气体对细胞的生长、分化、增殖具有明显的影响，通过改变细胞培养的气体环境，可直接影响细胞的生长、分化、增殖，该现象具有重大的医学价值，若能明确细胞生长环境中气体成分与各种细胞生长、分化、增殖状况的对于关系，则通过控制细胞周围的气体环境，可达到医疗保健、治疗癌症等目的，同时，植入医疗器械也会在体内产生气体，这些气体对周围组织、细胞的影响是评估该植入医疗器械安全性的一个重要环节，目前研究气体环境细胞行为的一大困难是市场上氢气细胞培养装置的缺失，气体环境细胞培养装置要求具有细胞生长腔室及气体生成腔室，且两个腔室之间须有气体交换，但不能有液体交换。
3.但是相关领域研究者目前使用时，小室进行气体环境细胞培养实验，小室有三方面缺陷，一是成本较高，给研究人员造成很大的经济负担，二是小室的多孔薄膜不具有隔水性，氢气产生速率较大时，下方气体发生室的液体会飞溅到薄膜底端，并与细胞培养液发生溶质交换，污染培养液，三是底部多不透明，影响细胞观察。


技术实现要素：

4.本发明的主要目的是提供一种可透气嵌入式细胞培养小室及其制备方法，以解决现有技术中研究者目前使用时，小室进行气体环境细胞培养实验，小室有三方面缺陷，一是成本较高，给研究人员造成很大的经济负担，二是小室的多孔薄膜不具有隔水性，氢气产生速率较大时，下方气体发生室的液体会飞溅到薄膜底端，并与细胞培养液发生溶质交换，污染培养液，三是底部多不透明，影响细胞观察等问题。
5.为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种可透气嵌入式细胞培养小室，包括嵌入式细胞培养小室，所述嵌入式细胞培养小室头部分别具有圆形凸台及透气孔或三角形支架，所述嵌入式细胞培养小室底部分别具有圆槽及透明防水透气薄膜，所述嵌入式细胞培养小室可通过所述圆形凸台或三角形支架架设于所述垫片之上，所述垫片可直接架设于细胞培养板上，所述细胞培养板中可通过化学反应发生气体，气体可透过所述透明防水透气薄膜进入所述嵌入式细胞培养小室，所述嵌入式细胞培养小室及所述垫片由安全无毒的、有可塑性和化学惰性的高分子材料制成。
6.本发明与一个或多个实施例中，所述圆形凸台直径或三角形支架外接圆直径大于所述垫片上的开孔直径，可架设于所述垫片上。
7.本发明与一个或多个实施例中，所述透气孔可通过气体，使所述细胞培养板孔内气压与外界相同。
8.本发明与一个或多个实施例中，所述嵌入式细胞培养小室的深度小于垫片厚度与
细胞培养板深度之和，所述嵌入式细胞培养小室底部在使用时与所述细胞培养板底部具有2
‑
20mm的距离。
9.本发明与一个或多个实施例中，所述透明防水透气薄膜与所述圆槽连接，所述透明防水透气薄膜厚度为0.1
‑
1mm，所述透明防水透气薄膜不会透过水溶液、有机溶液，所述透明防水透气薄膜在可透过包括氢气、氧气、氮气、水蒸气、二氧化碳在内的多种气体，所述透明防水透气薄膜具有良好的细胞相容性，细胞可在其表面生存、增殖、铺展。
10.本发明与一个或多个实施例中，所述透明防水透气薄膜为聚二甲基硅氧烷凝胶。
11.本发明与一个或多个实施例中，所述安全无毒性体现在：浸提液对细胞增殖活性无影响；化学惰性体现在：不会释放活性化学成分干扰细胞在特定气体环境中状况、行为的研究，可用于紫外辐照、乙醇浸泡的消毒方式消毒，且消毒过程其物理化学性质不会发生变化。
12.本发明与一个或多个实施例中，所述垫片有一角具有等腰直角三角形缺口，且所述垫片可通过包括但不限于卡槽、静摩擦等方式固定所述凸台或所述支架，所述垫片与所述细胞培养板相匹配。
13.一种上述中任意一项所述的可透气嵌入式细胞培养小室的制备方法，包括以下步骤：
14.s1、制备小室外壁：
15.根据三维图纸，通过包括但不限于3d打印、机加工、注塑等手段使小室外壁成型；小室外壁成型后将经过包括超声清洗、乙醇浸泡、紫外照射在内的的多道工序处理。
16.s2、在小室外壁底部制备透明防水透气薄膜：
17.配置防水透气薄膜的高分子预聚液，在不高于25℃的温度下，通过包括但不限于真空除泡、超声除泡的手段对高分子预聚液进行脱泡；将小室外壁底部朝下置于板状模具上，模具材质包括但不限于聚四氟乙烯、聚苯乙烯，向模具中注入0.1
‑
1ml的高分子预聚液，通过包括但不限于旋涂、自然延流在内的方法使预聚液均匀铺满小室外壁的底部；之后在加热固化一段时间，使高分子预聚液固化为防水透气薄膜。
18.所述预聚液包括二甲基硅氧烷前驱体和固化剂，二甲基硅氧烷前驱体和固化剂的体积比为10:1，所述加热固化温度为20
‑
150℃，所述固化时间为 0.5
‑
72h。
19.与现有技术相比，本发明的技术方案的优点在于：
20.1.本发明底部的透明防水透气薄膜可完全阻止液体交换，防止下方飞溅液体污染培养液，同时可以允许下方生成的气体透过，改变所培养的细胞所处的气体环境。
21.2.本发明底部的透明防水透气薄膜透明度量好，在所述小室中培养细胞后，将小室置于光学显微镜下观察时，可清晰观察到细胞的形态，无不透明结构碍视线。
22.3.本发明的在与垫片及细胞培养板组合后，下方细胞培养板中有充足的空间进行气体生成的化学反应。
23.4.本发明造价低廉，制备过程温和，便于量产。
24.5.本发明所选材料均安全无毒，表面均无粉尘及微结构，故细胞生长、增殖、分化状况不会受到受到本发明的直接影响，且本发明可接受紫外辐照、乙醇浸泡、高温高压等灭菌方式。
附图说明
25.图1为本发明小室、垫片与细胞培养板组合结构示意图；
26.图2为本发明小室头部为圆形凸台及透气孔结构示意图；
27.图3为本发明垫片结构示意图；
28.图4为本发明小室、垫片与细胞培养板组合实际照片；
29.图5为本发明小室实际照片；
30.图6为本发明小室内培养胆管癌细胞照片；
31.图7为本发明小室氢气透过情况分析图；
32.图8为本发明小室头部为三角形支架结构示意图。
33.图中：1、嵌入式细胞培养小室；2、垫片；3、细胞培养板；4、圆形凸台；42、三角形支架；5、透气孔；6、圆槽；7、透明防水透气薄膜；8、等腰直角三角形缺口；9、开孔。
具体实施方式
34.下面将结合本发明的结构示意图，对本发明的具体实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅为本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域的普通技术人员在没有付出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
35.一种可透气嵌入式细胞培养小室，包括嵌入式细胞培养小室1，所述嵌入式细胞培养小室1头部分别具有圆形凸台4及透气孔5或三角形支架42，所述嵌入式细胞培养小室1底部分别具有圆槽6及透明防水透气薄膜7，所述嵌入式细胞培养小室1可通过所述圆形凸台4或所述支架42架设于所述垫片2 之上，所述垫片2可直接架设于细胞培养板3上，所述细胞培养板3中可通过化学反应发生气体，气体可透过所述透明防水透气薄膜7进入所述嵌入式细胞培养小室1，所述嵌入式细胞培养小室1及所述垫片2由安全无毒的、有可塑性和化学惰性的高分子材料制成。
36.进一步的，所述圆形凸台4直径或所述三角形支架42外接圆直径大于所述垫片2上的开孔9直径，可架设于所述垫片2上。
37.进一步的，所述透气孔5可通过气体，使所述细胞培养板3孔内气压与外界相同。
38.进一步的，所述嵌入式细胞培养小室1的深度小于垫片2厚度与细胞培养板3深度之和，所述嵌入式细胞培养小室1底部在使用时与所述细胞培养板3底部具有2
‑
20mm的距离。
39.进一步的，所述透明防水透气薄膜7与所述圆槽6连接，所述透明防水透气薄膜7厚度为0.1
‑
1mm，所述透明防水透气薄膜7不会透过水溶液、有机溶液，所述透明防水透气薄膜7在可透过包括氢气、氧气、氮气、水蒸气、二氧化碳在内的多种气体，所述透明防水透气薄膜7具有良好的细胞相容性，细胞可在其表面生存、增殖、铺展。
40.进一步的，所述透明防水透气薄膜7为聚二甲基硅氧烷凝胶。
41.进一步的，所述安全无毒性体现在：浸提液对细胞增殖活性无影响；化学惰性体现在：不会释放活性化学成分干扰细胞在特定气体环境中状况、行为的研究，可用于紫外辐照、乙醇浸泡的消毒方式消毒，且消毒过程其物理化学性质不会发生变化。
42.进一步的，所述垫片2有一角具有等腰直角三角形缺口8，且所述垫片2 可通过包
括但不限于卡槽、静摩擦等方式固定所述凸台4或所述三角形支架 42，所述垫片与所述细胞培养板3相匹配。
43.一种上述中任意一项所述的可透气嵌入式细胞培养小室的制备方法，包括以下步骤：
44.s1、制备嵌入式细胞培养小室1外壁：
45.根据三维图纸，通过包括但不限于3d打印、机加工、注塑等手段使嵌入式细胞培养小室1外壁成型；嵌入式细胞培养小室1外壁成型后将经过包括超声清洗、乙醇浸泡、紫外照射在内的的多道工序处理。
46.s2、在嵌入式细胞培养小室1外壁底部制备透明防水透气薄膜：
47.配置防水透气薄膜的高分子预聚液，在不高于25℃的温度下，通过包括但不限于真空除泡、超声除泡的手段对高分子预聚液进行脱泡；将嵌入式细胞培养小室1外壁底部朝下置于板状模具上，模具材质包括但不限于聚四氟乙烯、聚苯乙烯，向模具中注入0.1
‑
1ml的高分子预聚液，通过包括但不限于旋涂、自然延流在内的方法使预聚液均匀铺满嵌入式细胞培养小室1外壁的底部；之后在加热固化一段时间，使高分子预聚液固化为防水透气薄膜。
48.所述预聚液包括二甲基硅氧烷前驱体和固化剂，二甲基硅氧烷前驱体和固化剂的体积比为10:1，所述加热固化温度为20
‑
150℃，所述固化时间为 0.5
‑
72h。
49.实施例1：
50.1.架设所述嵌入式细胞培养小室1时，先将细胞培养板3取出并打开盒盖，再将所述垫片2切角与细胞培养板3切角对齐，将垫片2架设于细胞培养板3上，在将灭菌的所述嵌入式细胞培养小室1置于所述垫片2孔洞内，所述凸台将保证所述嵌入式细胞培养小室1不会滑落，架设极为方便。
51.2.所述嵌入式细胞培养小室1架设在垫片2及细胞培养板3上之后，所述细胞培养板3内有深为1cm的空间进行气体发生反应。
52.3.所述嵌入式细胞培养小室1架设在垫片2及细胞培养板3上之后，所述透气孔5可有效防止下方气压过大将嵌入式细胞培养小室1弹出。
53.4.所述嵌入式细胞培养小室1底部薄膜透明度良好，可便于观测其中培养的细胞。
54.实施例2：
55.用本发明所述可透气嵌入式细胞培养小室培养细胞，如图6所示，步骤如下：
56.(1)选取三个所述嵌入式细胞培养小室1，经超声清洗、乙醇浸泡、紫外照射后，转入无菌柜中待用。
57.(2)在无菌柜中架设所述可透气嵌入式细胞培养小室，包括六孔细胞培养板3、所述垫片2、所述嵌入式细胞培养小室1，在每个嵌入式细胞培养小室 1中种植人胆管癌细胞(rbe)105个，选用培养基中加入双抗及胎牛血清，每个嵌入式细胞培养小室1加入培养液2ml。
58.(3)将上述细胞培养装置盖上盒盖，置于细胞培养箱中，培养条件为co2浓度5％、温度37℃，培养时间为48h。
59.所述步骤(2)中，所有器械均经过消毒灭菌。
60.所述步骤(2)中所述培养装置的架设及细胞种植需要工作者佩戴无菌防护手套，
避免种植的细胞受到污染。
61.所述步骤(3)中盖子为对应所述六孔细胞培养板3匹配的原装盖子。
62.所述步骤(3)中细胞培养箱内每个独立空间为干净无菌环境。
63.细胞培养结果如图6所示，可见人胆管癌细胞铺展良好、有伪足产生，说明本发明细胞相容性良好，适于培养细胞，且便于观察细胞形貌。
64.实施例3：
65.测试本发明所述可透气嵌入式细胞培养小室氢气透过情况，如图7所示，步骤如下：
66.(1)用去离子水对氢电极进行极化，用标准溶液对氢电极进行校准，并测量去离子水中的氢气含量曲线作为背底。
67.(2)准备6片长12mm，宽10mm，厚0.3mm的镁片，使用砂纸对镁片进行打磨至表面光亮无氧化层为止。
68.(3)配置浓度为0.5mol/l的氯化氢水溶液20ml待用。
69.(4)取六个所述嵌入式细胞培养小室1，经超声水洗、乙醇浸泡、烘箱烘箱烘干后待用。
70.(5)用一六孔细胞培养班板架设所述可透气嵌入式细胞培养小室，在所述六孔细胞培养板3的三个孔中每孔加入4ml所述氯化氢溶液，在另三个孔中加入每孔4ml去离子水作为对照，在孔板上架设所述垫片2后，在架设所述嵌入式细胞培养小室1，并在每个嵌入式细胞培养小室1中加入1.5ml去离子水。
71.(6)选一含有氯化氢的孔洞，加入两片所述镁片启动气体发生反应，在该孔洞所对应嵌入式细胞培养小室1中插入氢电极，插入深度约3mm，开始测量，至反应基本结束后，再如法测试下一个嵌入式细胞培养小室1。
72.(7)测量三个对照组嵌入式细胞培养小室1中的氢气含量，作为对比。
73.所述步骤(1)中，极化时间为不小于72h，用电标准溶液校准后，取得校准曲线输入系统，系统将自动校准。
74.所述步骤(2)中，砂纸目数为800目，打磨顺镁片宽度方向，单一方向打磨。
75.所述步骤(3)中，氯化氢溶液由36.5wt％的浓盐酸经去离子水稀释而成，注意稀释时应将浓盐酸注入水中，防止盐酸剧烈发烟。
76.所述步骤(6)中，氢电极切不可插入过深，以防氢电极插入嵌入式细胞培养小室1底部薄膜中影响数据准确性，也防止折断氢电极。
77.最后应说明的是：以上为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行详细的说明，对于本领域的其他技术人员来说，其依然可以对照之前的各种实施例所记载的技术方案进行修改，或者对齐中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等均应包含在本发明的保护范围之内。