三通道双淬灭探针检测可复制性慢病毒的试剂及其检测方法与流程

1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及三通道双淬灭探针检测可复制性慢病毒（rcl）的试剂及其检测方法。


背景技术：

2.随着car
‑
t（嵌合抗原受体t细胞免疫疗法）细胞药物的迅速发展，在car
‑
t的生产过程中，常用慢病毒载体将嵌合基因高效地导入t细胞中，尽管慢病毒载体具有复制缺陷，但如果在慢病毒生产过程中发生穿梭质粒、包装质粒和t细胞之间或慢病毒载体与t细胞的内源性逆转录元件之间发生同源或非同源重组，则可能导致复制型慢病毒（rcl）的潜在风险。
3.fda建议的检测方法包括：1)检测rcl相关蛋白；2)实时定量qpcr方法检测样本中rcl特异性dna序列。而标准的检测rcl的细胞共培养方法周期较长，约需6周或者更长时间才能获得实验结果。
4.taqman探针法是高度特异的定量pcr技术，其核心是利用taq酶的3
′→5′
外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。fda现允许用taqman探针即水解探针(hydrolysisprobes)qpcr方法快速检测产品rcl情况。
5.现有技术中，公开号为cn110117675a的专利，公开了一种实时荧光定量pcr检测rcl的试剂和方法，公开了试剂组合包括特异性扩增vsv
‑
g基因的第一引物和第一探针，所述的第一引物对包括第一上游引物和第一下游引物，特异性扩增vsv
‑
g基因的第二引物对和第二探针，第二引物对包括第二上游引物和第二下游引物，特异性扩增内参基因的第三引物对和第三探针，第三引物对包括第三上游引物和第三下游引物。内参基因的内参即是内部参照，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测基因的表达水平变化时常用它来做参照物。其作用是校正上样量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。因而，这篇文件中，实质上是采用了两组特异性扩增vsv
‑
g基因的引物探针对。该对比文件还公开了rcl的检测方法，该方法为：提供一待测dna样品，利用前述的试剂组合，对待测dna样品进行实时荧光定量pcr；计算待测dna样品的cq值和vsv
‑
g基因拷贝数，从而判断样品中是否含有rcl。所述方法为taqman探针法。在同一扩增体系中，利用特异性扩增vsv
‑
g基因的第一引物对和第一探针以及特异性扩增内参基因的第三引物对和第三探针，对待测dna样品进行实时荧光定量pcr。
6.分析可知，上述的专利文献中，实时荧光定量pcr检测rcl的试剂和方法，虽然设置了三对引物和探针，但是第一对引物和探针以及第二对引物和探针都是特异性扩增vsv
‑
g基因的引物探针对，第三对引物和探针是特异性扩增内参基因，这三对引物和探针的设置，实质上是单通道检测方法，存在扩增效率低，特异性不好，准确度不高等问题。
u universal probe master mix预混液、vsv
‑
g/gag/rpp30
‑
f、vsv
‑
g/gag/rpp30
‑
r和vsv
‑
g/gag/rpp30
‑
p。
16.本发明的三通道双淬灭探针检测可复制性慢病毒的试剂及其检测方法具有以下优点：1）本发明的三通道双淬灭探针检测可复制性慢病毒的试剂，采用了三对引物探针对，能够实时荧光定量pcr检测可复制性慢病毒，扩增效率高，特异性好，且准确度高； 2）本发明的三通道双淬灭探针检测可复制性慢病毒的检测方法，采用了双淬灭探针，在除了探针 3'端的普通淬灭基团，还在探针中间额外添加中间淬灭基团，能够降低本底信号，提高荧光强度，从而提高检测的灵敏度。
附图说明
17.图1为采用fam通道检测vsv
‑
g的扩增曲线示意图。
18.图中，曲线1为采用背景技术中所述的现有的检测方法的扩增曲线，曲线2为采用本发明的检测方法的扩增曲线。
19.图2为采用vic通道检测gag 的扩增曲线示意图。
20.图中，曲线3为采用背景技术中所述的现有的检测方法的扩增曲线，曲线4为采用本发明的检测方法的扩增曲线。
21.图3为采用cy5信号通道检测rpp30的扩增曲线示意图。
22.图中，曲线5为采用背景技术中所述的现有的检测方法的扩增曲线，曲线6为采用本发明的检测方法的扩增曲线。
23.图4为采用fam通道进行低浓度vsv
‑
g检测的扩增曲线示意图。
24.图中曲线7为采用背景技术中所述的现有的检测方法的扩增曲线，曲线8为采用本发明的检测方法的扩增曲线。
25.图5为采用vic通道进行低浓度gag检测 的扩增曲线示意图。图中曲线9为采用背景技术中所述的现有的检测方法的扩增曲线，曲线10为采用本发明的检测方法的扩增曲线。
26.图6为采用cy5信号通道进行低浓度rpp30检测的扩增曲线示意图。图中曲线11为采用背景技术中所述的现有的检测方法的扩增曲线，曲线12为采用本发明的检测方法的扩增曲线。
具体实施方式
27.下面通过实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
28.一种三通道双淬灭探针检测可复制性慢病毒的试剂，其包括第一引物探针对、第二引物探针对和第三引物探针对，第一引物探针对为vsv
‑
g引物和探针对，vsv
‑
g正向引物的基因为seq id no：1，反向引物的基因为seq id no：2，对应的探针的基因为seq id no：3；第二引物探针对为gag引物探针对，gag正向引物的基因为seq id no：4，反向引物的基因为seq id no：5，对应的探针的基因为seq id no：6；第三引物探针对为rpp30引物探针对，
rpp30正向引物的基因为seq id no：7，反向引物的基因为seq id no：8，对应的探针的基因为seq id no：9。三种引物探针对的浓度分别为第一引物探针对200nm～400nm，第二引物探针对200nm～400nm，第三引物探针对200nm～400nm。
29.三种引物探针对的探针都为双淬灭探针，在双淬灭探针的 5'核酸酶水解探针的基础上，除了在探针 3'端的设置普通淬灭基团，还在探针的中间额外添加中间淬灭基团，中间淬灭基团为zen淬灭基团、 tao 淬灭基团、duq淬灭基团或dbq淬灭基团中的一种。作为一种实施方式，中间淬灭基团设置在距5'端荧光基团9bp左右位置。
30.一种三通道双淬灭探针检测可复制性慢病毒的检测方法，其包括以下步骤：s1细胞培养，具体为：将慢病毒感染293t细胞，并至少培养5代；s2准备待测的样品，具体为：利用dna提取试剂盒提取样品；s3标准品稀释，制备标准曲线样品；s4根据所要检测的标准曲线、空白对照及待测样品数量，确定所需的反应孔数，计算反应孔数量的方法为：反应孔数=（6个浓度梯度的标准曲线 1个无模板对照ntc 1个阴性质控ncs 待测样品数
×
2）
×
3，其中的待测样品
×
2是因为每个待测样品检测时都应同时检测样品的erc，例如待测样品为3份，那么反应孔数为（6 1 1 3
×
2）
×
3=42；s5根据所需反应孔数配制相应量的qpcr反应液与引物探针的混合液，例如反应孔数为42份，则准备对应份量的混合液，将其震荡离心后备用，各试剂置于冰上融化，轻微振荡混合均匀；s6每个反应孔中添加相应量的qpcr反应液与引物探针的混合液，再按要求在不同的反应孔中分别添加标准品、稀释液、阴性质控ncs、待测样品和样品erc；以42个反应孔为例，分为三组实验，每组实验中使用14个反应孔，其中6个反应孔中添加不同浓度梯度的标准曲线试剂；1个反应孔中添加稀释液，形成无模板对照ntc；1个反应孔中添加阴性质控ncs；三个反应孔中分别添加待测样品，另外三个反应孔中添加样品erc。
31.s7控制各个反应孔的反应过程，先进行ung酶温浴，温度为37℃，时间为2分钟；然后激活聚合酶，温度为95℃，时间为5分钟；pcr循环40个循环，然后进行dna变性处理，温度为95℃，时间为10秒；再进行退火和延伸处理，温度为60℃，时间为30秒；s8、将标准品浓度输入到分析软件中，根据标准曲线，软件自动输出每个样品的ct值及三个靶标的浓度。
32.上述的步骤s5中，qpcr反应液与引物探针的混合液中包括aceq u universal probe master mix预混液、vsv
‑
g/gag/rpp30
‑
f、vsv
‑
g/gag/rpp30
‑
r和vsv
‑
g/gag/rpp30
‑
p。。
33.上述的步骤s3中，dna提取试剂盒可以选用多种试剂盒，只要具有提取感染293t细胞的慢病毒dna作用的试剂盒都可以选用。
34.对比例1采用本发明的检测方法和现有技术的检测方法依次进行vsv
‑
g、gag和rpp30的检测，检测结果如图1
‑
3。如图1为采用fam通道检测vsv
‑
g的扩增曲线示意图，图2为采用vic通道检测gag 的扩增曲线示意图，图3为采用cy5通道检测rpp30的扩增曲线示意图，横坐标为循环次数，纵坐标为荧光强度，通过图1
‑
3可以看出采用本发明的检测方法，背景信号值更低，最终信号值更高，检测灵敏度好，更有利于低浓度的检测。
35.对比例2采用本发明的检测方法和现有技术的检测方法进行稀释检测试验，同时检测低浓度样本，检测结果如图4
‑
6。具体过程为，稀释标准品至10 copies/μl， 采用本发明的检测方法和现有技术的检测方法同时进行稀释检测实验。如图4
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5所示，采用现有技术检测低浓度样本时，vsv
‑
g 和gag的检测信号值低，重复性差，ct值延后，定量不准确，进行rpp30检测时，检测信号值低，未检测出，检出概率低，而采用本发明的检测方法检测时，检测信号值高，都能够检出，重复性强，且定量检测准确，ct值无延后。
36.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。