草欧菌素的生物合成基因簇及其应用的制作方法

1.本发明涉及微生物基因工程技术领域，尤其涉及草欧菌素的生物合成基因簇及其应用。


背景技术：

2.草欧菌素对植物病原真菌有很好的防治效果，其包括两种类型，分别为a型和b型，结构式如下所示：
[0003][0004]
a型草欧菌素带有糖基，而b型草欧菌素不具有糖基。虽然，这类抗真菌是一类已知的化合物，并且这类脂肽类化合物具有良好的活性效果。但是这类化合物的基因簇却是一直处于未知状态。探索这类化合物对应的基因簇，对这位这类化合物的改造起到了关键的数据支持。
[0005]
非核糖体肽合成酶nrps由多个模块(module)按特定的空间顺序排列而成，每个模块负责将一个氨基酸整合到产物的骨架中，肽链延伸的一个反应循环过程：1.a结构域从底物池中选择结合特定的氨基酸，在atp的作用下合成相应的氨酰
‑
amp而使氨基酸底物得到活化；2.氨酰
‑
amp与t结构域上的辅因子磷酸泛酰巯基乙胺的巯基相结合，形成复合体之后，在缩合结构域也就是c结构域下形成新的肽键，产生延伸了一个氨基酸的新的肽酰
‑
s
‑
载体复合体和游离的载体，在沿着顺序添加氨基酸之后，在最后一个模块上存在te结构域，在这个结构域的作用下，产物被释放出来，形成线性肽链或者环状肽链。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的在于提供了一种草欧菌素的生物合成基因簇以及该生物合成基因簇在制备草欧菌素中的应用。
[0007]
具体技术方案如下：
[0008]
本发明提供了草欧菌素的生物合成基因簇，所述草欧菌素的生物合成基因簇至少至少包括7个基因，分别为：
[0009]
非核糖体肽合成酶基因，即：acba基因，acbb基因，acbc基因，acbd基因和acbh基因；
[0010]
所述acba基因编码1890个氨基酸，氨基酸序列如seq id no.2所示；
[0011]
所述acbb基因编码291个氨基酸，氨基酸序列如seq id no.3所示；
[0012]
所述acbc基因编码2499个氨基酸，氨基酸序列如seq id no.4所示；
[0013]
所述acbd基因编码3861个氨基酸，氨基酸序列如seq id no.5所示；
[0014]
所述acbh基因编码2799个氨基酸，氨基酸序列如seq id no.9所示；
[0015]
与糖基转移相关基因，即：acbi基因，其编码246个氨基酸，氨基酸序列如seq id no.10所示；
[0016]
与氧化还原相关基因，即：acbe基因，其编码254个氨基酸，氨基酸序列如seq id no.6所示。
[0017]
草欧菌素分为a型和b型，其差别是a型草欧菌素带有糖基，而b型草欧菌素不具有糖基，本发明提供的生物合成基因簇中缺失了acbi之后，就可以全部合成b型草欧菌素。
[0018]
acba基因，acbb基因，acbc基因，acbd基因和acbh基因编码的5个非核糖体肽合成酶包含若干模块或结构域，即腺苷腺化结构域(a结构域)、肽酰基载体蛋白结构域(pcp/t结构域)、缩合结构域(c结构域)，差向异构结构域(e),n
‑
甲基化结构域(m)。
[0019]
seq id no.1中有5个非核糖体肽合成酶基因(acba
‑
d，acbh)，核苷酸互补序列及其氨基酸序列，是草欧菌素a合成所必须的；其中，包含8个模块，28个结构域如图2所示。acba包含2个模块：加载模块域中，a1、t1和c1负责草欧菌素a的起始合成，催化一个苏氨酸和一个长链脂肪酸作为起始单位，模块2含有a2、c2、t2结构域，负责引入一个苏氨酸。acbb包括模块3，含有c3结构域。acbc包括模块4和5，模块4含有a4
‑
t4
‑
c4
‑
e4结构域，负责引入苏氨酸。模块5含有a5
‑
t5
‑
c5
‑
e5结构域，负责引入亮氨酸。acbd包含模块6,7，8。模块6含有a6
‑
t6
‑
c6
‑
e6结构域，负责引入甘氨酸；模块7，含有a7
‑
t7
‑
c7
‑
e7结构域，负责引入谷氨酰胺。acbh包括模块9，含有a8
‑
t8
‑
c8结构域，负责引入甘氨酸单位。acbh包含模块9,10。模块9，含有a9
‑
t9
‑
c9结构域，负责引入苏氨酸。模块10，含有a10
‑
t10
‑
c10
‑
te10，负责引入精氨酸，并在硫酯酶(te)参与下完成碳链的环化及释放。最后在acbi糖基转移酶的作用下，在长链脂肪酸部分加入葡萄糖分子。
[0020]
进一步地，所述acba基因的核苷酸序列如seq id no.1中第3010
‑
9258位所示；所述acbb基因的核苷酸序列如seq id no.1中第9317
‑
10588位所示；所述acbc基因的核苷酸序列如seq id no.1中第10713
‑
18212位所示；所述acbd基因的核苷酸序列如seq id no.1中第18209
‑
29794位所示；所述acbh基因的核苷酸序列如seq id no.1中第32535
‑
40934位所示；所述acbi基因的核苷酸序列如seq id no.1中第40934
‑
41674位所示；所述acbe基因的其核苷酸序列如seq id no.1中第29791
‑
30555位所示。
[0021]
进一步地，所述草欧菌素的生物合成基因簇还包括acbf基因，其编码70个氨基酸，氨基酸序列如seq id no.7所示，其核苷酸序列如seq id no.1中第30602
‑
30814位所示；该基因具有辅助氨基酸腺苷化的作用，参与草欧菌素的生物合成能够有效提高草欧菌素的合成效率。
[0022]
进一步地，所述草欧菌素的生物合成基因簇还包括acbj基因，其编码的氨基酸序列如seq id no.11所示，其核苷酸序列如seq id no.1中第41794
‑
42483位所示；该基因具
有对错误合成具有修正的作用，参与草欧菌素的生物合成可有效提高草欧菌素的合成效率。
[0023]
进一步地，所述草欧菌素的生物合成基因簇还包括与转运相关的基因，即acbg基因，其编码的氨基酸序列如seq id no.8所示，其核苷酸序列如seq id no.1中第30842
‑
32506位所示。
[0024]
进一步地，所述草欧菌素的生物合成基因簇还包括与抗性相关的基因，即acbk基因，其编码的氨基酸序列如seq id no.12所示，其核苷酸序列如seq id no.1中42549
‑
45662位所示。
[0025]
进一步地，所述草欧菌素的生物合成基因簇的核苷酸序列如seq id no.1所示。
[0026]
具体的，所述草欧菌素的生物合成基因簇来源于成团泛菌(pantoea agglomerans)；更具体的，来源于成团泛菌(pantoea agglomerans)zju23，保藏编号为cgmcc no.16174，保藏日期为2018年7月30日。
[0027]
本发明还提供了一种包含所述草欧菌素的生物合成基因簇的表达载体或基因工程菌。
[0028]
本发明还提供了所述生物合成基因簇在合成草欧菌素的应用。
[0029]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0030]
(1)本发明通过获取非核糖体基因，预测生物合成基因簇和验证预测结果，最终获得准确的草欧菌素的生物合成基因簇，可用于制备草欧菌素。
[0031]
(2)本发明通过基因簇序列信息和结构分析，可以进一步对其生产菌进行遗传操作，获得新型的、更有效的抗生素，如通过基因操作来改变其pks合成模块式结构，进行内酯环后修饰的改变，糖基因的置换或修饰，创造新的大环内酯类抗生素。
[0032]
(3)本发明也可以通过对抗性基因或调节基因的遗传操作，提高抗生素的产量；所提供的基因及其蛋白质、抗体也可用以筛选和发展可用于医药、工业、农业的化合物或蛋白。
附图说明
[0033]
图1为草欧菌素a和b的生物合成基因簇结构示意图；
[0034]
其中，nrps表示非核糖体肽合成酶；reductase表示还原酶；mbth family protein表示辅助氨基酸腺苷化蛋白；glycosyltransferase表示糖基转移酶；type ii te表示第二类硫酯酶；resistance表示抗生素抗性；transporter表示草欧菌素的转运子。
[0035]
图2为草欧菌素a的基因合成顺序示意图；
[0036]
其中，condenstaion表示缩合结构域；amp
‑
binding表示腺苷化结构域；thiolation表示硫醇化结构域；epimerization表示差向异构化结构域；thioesterase表示硫酯酶；n
‑
methyltransferase表示甲基转移酶。
[0037]
图3为草欧菌素b的基因合成顺序示意图；
[0038]
其中，condenstaion表示缩合结构域；amp
‑
binding表示腺苷化结构域；thiolation表示硫醇化结构域；epimerization表示差向异构化结构域；thioesterase表示硫酯酶；n
‑
methyltransferase表示甲基转移酶。
[0039]
图4为acba、acbb、acbc、acbd、acbe、acbf、acbg、acbh、acbi、acbj、acbk突变体对于
禾谷镰刀菌的抑制活性照片。
[0040]
图5为acba、acbb、acbc、acbd、acbe、acbf、acbg、acbh、acbi、acbj、acbk突变体中a型草欧菌素含量的检测结果。
[0041]
图6为acba、acbc、acbd、acbh、acbi突变体发酵后获得的不同中间产物的lc
‑
ms总离子流图。
[0042]
图7为acba、acbc、acbd、acbh、acbi突变体发酵后获得的不同中间产物的lc
‑
ms数据图谱；
[0043]
其中，a图为质谱数据图，b图为不同化合物的结构示意图；compound 1是a型草欧菌素，compound 2
‑
5分别对应着acba、acbc、acbd、acbh、acbi突变体中间产物，compound 6是b型草欧菌素。
[0044]
图8为不同突变体acba、acbb、acbc、acbd、acbe、acbh的pcr验证图；
[0045]
其中，id
‑
1对应的是突变体的验证条带，id
‑
2对应的是野生型条带，in
‑
1对应的是突变体内部引物验证，in
‑
2对应的是野生型内部引物验证。
具体实施方式
[0046]
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。下列实施案例中未详细涉及的实验方法均为常规技术手段。
[0047]
实施例1
[0048]
1、非核糖体基因的获取
[0049]
从小麦赤霉病菌的子囊壳结构中分离获取到成团泛菌菌株，我们将其命名为成团泛菌zju23，并保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmcc no.16174，保藏日期为2018年7月30日(本发明不涉及该菌株的保藏)；对该菌进行全基因组测序后，根据后续的转录组对测序得到的序列进行注释。
[0050]
2、草欧菌素a生物合成基因簇在非核糖体基因中的初定位
[0051]
通过转座子随机插入，我们发现了大量失去抑菌活性的突变体，对这些突变体进行全基因测序，发现了大部分突变体在某个基因簇上大量聚集。因此初步推断草欧菌素a的生物合成基因簇在该核糖体基因簇上。
[0052]
3、草欧菌素a生物合成基因簇的功能性预测
[0053]
将初筛后的草欧菌素a生物合成基因簇进行功能性注释，将因簇的注释文件上传上到antismash网址(https://antismash.secondarymetabolites.org/)，得到对应的基因的预测功能和预测的底物；
[0054]
而通过antismash的预测，acba基因的底物为thr(苏氨酸)，thr(苏氨酸)；acbc基因的底物氨基酸为thr(苏氨酸)，苯丙氨酸(亮氨酸)；acbd基因的底物为gly(甘氨酸)，gln(谷氨酰胺)，gly(甘氨酸)；acbh基因的底物为thr(苏氨酸)，asn(天冬酰胺)。abaf基因的功能就是mbth类蛋白。abag基因的功能就是转运子相关蛋白。abaj基因的功能就是第二类硫酯酶。abak基因的功能是多药抗性基因。
[0055]
因为草欧菌素中不存在天冬酰胺和苯丙氨酸，因此我们对预测进行了矫正。hcba基因的底物为thr(苏氨酸)，thr(苏氨酸)；hcbc基因的底物氨基酸为thr(苏氨酸)，leu(亮
氨酸)；hcbd基因的底物为gly(甘氨酸)，gln(谷氨酰胺)，gly(甘氨酸)；hcbh基因的底物为thr(苏氨酸)，arg(精氨酸)。
[0056]
4、草欧菌素a生物合成基因簇的验证
[0057]
在预测的基础上，分别对acba,acbb,acbc,acbd,acbe,acbh,acbi，acbf,acbg,acbj,acbk 11个基因进行了单独的敲除，得到了11个突变体，分别为acba突变体，acbb突变体，acbc突变体，acbd突变体，acbe突变体，acbh突变体,acbi突变体,acbf突变体,acbg突变体,acbj突变体和acbk突变体。
[0058]
本研究使用pkd46质粒进行基因敲除，卡那霉素抗性片段作为筛选标记。在设计引物时，在卡那霉素两端直接通过pcr连上目标基因两侧50bp同源臂，作为同源重组替换片段。通过电击转化的方法，将同源重组片段导入到细菌中。
[0059]
我们将11个突变体进行平板活性检测。结果如图3所示，acba,acbb,acbc,acbd,acbe,acbh,acbf,acbj的抑制真菌活性完全散失，而acbi，acbk的抑制真菌活性没有散失，而acbg的抑菌活性严重减弱。将11个突变体和野生型(即：成团泛菌(pantoea agglomerans)zju23)在相同条件下(wa培养基)进行发酵，并得到对应的发酵产物。将种子液在lb培养基中过夜培养之后，按照1:1000的比例接种到wa培养基中，之后在25℃条件下培养3天后，检测发酵液中a型草欧菌素的含量。如图4所示，acba,acbb,acbc,acbd,acbe,acbh,acbf,acbj不能产生草欧菌素；acbk突变体中a型草欧菌素含量不受影响；acbg中a型草欧菌素含量显著下降。acbi突变体含量中检测不到a型草欧菌素。
[0060]
将图3和图4相结合，antismash的预测结果显示acbf，acbg，acbj，acbk基因对应的功能分别是mbth类蛋白，abc转运子，第二类硫酯酶，抗生素抗性基因。在文献报道中mbth类蛋白辅助nrps中氨基酸的腺苷化过程，帮助氨基酸与nrps中的a型结构域相结合，从而帮助nrps类非核糖体多肽的合成；acbg是基因簇上的abc转运子，是帮助a型草欧菌素向外转运。acbg转运子的缺失，会导致其发酵液中a型草欧菌素的含量显著下降。acbj是第二类硫酯酶，能够修复在多肽合成过程中的错误合成，从而回收底物。根据文献报道，第二类硫酯酶的缺失会导致其终产量的下降，而acbj突变体的表型与之对应。而acbk的突变体预测的功能是一类抗生素抗性基因，acbk的缺失不会影响其a型草欧菌素的含量。这与预测的结果一致。
[0061]
在酶活反应过程中，如果对应的酶作用消失，或者没有对应酶的表达，会导致生化反应的停止，从而导致了反应前体的增加和产物的消失。我们利用这一现象对各个突变体进行发酵，通过(lc
‑
ms)质谱的方法检测突变体的发酵产物是否和预测结果的一致。若一致表明对应基因合成的酶的底物与预测的一样；若不一致表明底物与猜想的存在差异。在此基础上，将计算得到不同突变体中间产物的精准分子量和不同突变体的发酵产物的高分辨液相色谱数据进行比对。
[0062]
如图5显示，对比与野生型发酵液中，在acba突变体发酵液中检测到累积的compound 2；在acbc突变体发酵液中检测到累积的compound 3；在acbd突变体发酵液中检测到累积的compound 4；在acbh突变体发酵液中检测到累积的compound 5；在acbi突变体发酵液中检测到累积的compound 6。
[0063]
如图6显示，在acba突变体发酵液中检测到累积的compound 2，预测是[m h]为328.2488，检测[m h]为328.2664；在acbc突变体发酵液中检测到累积的compound 3，预测
是[m h]为429.2965，检测到为429.2971；在acbd突变体发酵液中检测到累积的compound 4，预测是[m h]为643.4282，检测到为643.4393；在acbh突变体发酵液中检测到累积的compound 5，预测是[m h]为885.5297，检测到为885.5340；在acbi突变体发酵液中检测到累积的compound 6，预测是1138.6836[m h]为检测到为1138.6839，与b型草欧菌素的分子量对应。这里也进一步说明acbi突变体为什么依然具有抑制真菌活性，因为acbi突变体中具有b型草欧菌素，b型草欧菌素依然具有抑制真菌活性；并且在acbh中能找到acbd的中间产物，在acbd中能找acbc的中间产物，在acbc中能找到acbc的中间产物，以此类推，我们认为这个基因簇的顺序是从acba
‑
acbc
‑
acbd
‑
acbh
‑
acbi，如图1所示。
[0064]
结果如图7显示，我们分别对acba,acbb,acbc,acbd,acbe,acbh,acbi的突变体进行敲除，并进行了pcr验证。id
‑
1对应的是突变体的验证条带，id
‑
2对应的是野生型条带，in
‑
1对应的是突变体内部引物验证，in
‑
2对应的是野生型内部引物验证。图7表明了获得的转化子都为正确的突变体。
[0065]
表1.1非核糖体肽合成酶acba基因各结构域及其氨基酸的位置
[0066][0067]
表1.2非核糖体肽合成酶acbb基因各结构域及其氨基酸的位置
[0068]
模块结构域氨基酸的位置模块3c2
‑
292
[0069]
表1.3非核糖体肽合成酶acbc基因各结构域及其氨基酸的位置
[0070][0071]
表1.4非核糖体肽合成酶acbd基因各结构域及其氨基酸的位置
[0072]
[0073][0074]
表1.4非核糖体肽合成酶acbh基因各结构域及其氨基酸的位置
[0075][0076]
seq id no.1中有5个非核糖体肽合成酶基因(acba
‑
d，acbh)，核苷酸互补序列及其氨基酸序列，是草欧菌素a合成所必须的；其中，包含8个模块，28个结构域如图2所示。acba包含2个模块：加载模块域中，a1、t1和c1负责草欧菌素a的起始合成，催化一个苏氨酸和一个长链脂肪酸作为起始单位，模块2含有a2、c2、t2结构域，负责引入一个苏氨酸。acbb包括模块3，含有c3结构域。acbc包括模块4和5，模块4含有a4
‑
t4
‑
c4
‑
e4结构域，负责引入苏氨酸。模块5含有a5
‑
t5
‑
c5
‑
e5结构域，负责引入亮氨酸。acbd包含模块6,7，8。模块6含有a6
‑
t6
‑
c6
‑
e6结构域，负责引入甘氨酸；模块7，含有a7
‑
t7
‑
c7
‑
e7结构域，负责引入谷氨酰胺。acbh包括模块9，含有a8
‑
t8
‑
c8结构域，负责引入甘氨酸单位。acbh包含模块9,10。模块9，含有a9
‑
t9
‑
c9结构域，负责引入苏氨酸。模块10，含有a10
‑
t10
‑
c10
‑
te10，负责引入精氨酸，并在硫酯酶(te)参与下完成碳链的环化及释放。最后在acbi糖基转移酶的作用下，在长链脂肪酸部分加入葡萄糖分子。