基于CRISPR-Cas12a干预阻断病毒逆转录转座的技术的制作方法

技术特征：
1.用于阻断逆转录生物体在真核细胞内逆转录转座的体系，其包括cas12a表达盒与crrna表达盒；其中，所述的crrna靶向于所述逆转录生物体的必需基因、长末端重复序列或它们的邻近区域。2.如权利要求1所述的体系，其特征在于，所述的必需基因包括选自下组的基因：结构基因，调控基因。3.如权利要求2所述的体系，其特征在于，所述结构基因或调控基因包括：gag，pr，rt，in，env，tat、rev，vpu，nef，vpr或vpx的编码基因。4.如权利要求1所述的体系，其特征在于，所述体系中，cas12a表达盒与crrna表达盒位于同一或不同表达构建体中；较佳地，两个表达盒位于不同表达构建体中，cas12a表达盒整合到所述真核细胞的基因组中表达，crrna表达盒在所述真核细胞中游离表达。5.如权利要求1所述的体系，其特征在于，所述的阻断逆转录生物体在真核细胞内逆转录转座包括：阻止逆转录生物体通过逆转录步骤，在真核细胞中复制和跳跃。6.如权利要求1～5任一所述的体系，其特征在于，所述的逆转录生物体包括：逆转录病毒，逆转录病毒的模拟体；较佳地，所述逆转录病毒的模拟体为逆转录转座子tf1。7.如权利要求6所述的体系，其特征在于，所述的逆转录转座子tf1包括：逆转座元件，用于检测逆转录转座情况的筛选基因。8.如权利要求7所述的体系，其特征在于，所述筛选基因中插入内含子以阻止筛选基因表达，所述筛选基因的转录方向与所述逆转录转座子相反，所述内含子与所述逆转录转座子的转录方向一致；较佳地，所述crrna靶向切割未插入内含子的筛选基因而不靶向切割插入内含子的筛选基因；当cas12a与crrna均表达时，表达所述筛选基因的细胞为发生逆转录转座的细胞，其余为逆转录转座被抑制的细胞。9.如权利要求7所述的体系，其特征在于，所述逆转座元件包括选自下组的操作性连接的基因：长末端重复序列，gag，pr，rt，in；所述长末端重复序列包括5’ltr和3’ltr。10.如权利要求7所述的体系，其特征在于，所述筛选基因为抗性筛选基因、标记基因或报告基因；较佳地，所述抗性基因为neo；更佳地，所述内含子插入到neo的基因的第346、299、203、154位的3’位置。11.如权利要求7所述的体系，其特征在于，所述的逆转录病毒的模拟体还包括与所述逆转录转座子操作性连接的启动子，其驱动所述逆转录转座子的转座；较佳地，所述启动子为可调控型启动子；更佳地，该可调控型启动子为nmt1启动子，其受硫胺素抑制。12.如权利要求1所述的体系，其特征在于，所述crrna表达盒包括操作性连接的以下元件：直接重复序列，grna；较佳地，包括操作性连接的以下元件：启动子，直接重复序列，grna和核酶；较佳地，所述启动子为rrk1启动子；较佳地，所述grna选自：seq id no:6、8、10、12或14所示序列中第4～28位的核苷酸序列，或它们的反向互补序列；较佳地，所述直接重复序列的核苷酸序列如seq id no:28。13.如权利要求1所述的体系，其特征在于，所述cas12a为来源于新凶手弗朗西斯菌(francisella novicida)的cas12a；较佳地，所述真核细胞为酵母时，所述cas12a表达盒整合于酵母ii号染色体leu1位点。14.权利要求1～13任一所述的体系的用途，用于制备阻断病毒在真核细胞内逆转录转
座的试剂或组合物；或用于进行逆转录生物体在真核细胞内转座的实验测试或制备实验测试体系。15.一种阻断逆转录生物体在真核细胞内逆转录转座的方法，包括：(1)提供权利要求1～13任一所述的体系；(2)将(1)的体系引入到真核细胞内，从而该真核细胞具有阻断逆转录生物体逆转录转座的能力。16.一种进行逆转录生物体在真核细胞内转座的实验测试的方法，包括：(a)提供权利要求7～13任一所述的体系；(b)将(a)的体系引入到真核细胞内，检测逆转录转座情况。17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述筛选基因中插入内含子以阻止筛选基因表达，所述筛选基因的转录方向与所述逆转录转座子相反，所述内含子与所述逆转录转座子的转录方向一致；较佳地，所述crrna靶向切割未插入内含子的筛选基因而不靶向切割插入内含子的筛选基因；当cas12a与crrna均表达时，表达所述筛选基因的细胞为发生逆转录转座的细胞，其余为逆转录转座被抑制的细胞。18.如权利要求14所述的用途或权利要求15～17任一所述的方法，其特征在于，所述的真核细胞为酵母细胞，植物细胞，动物细胞；较佳地，所述酵母细胞包括裂殖酵母细胞。19.一种用于阻断逆转录生物体在真核细胞内逆转录转座的试剂盒，其包括权利要求1～13任一所述的体系。

技术总结
本发明揭示了一种基于CRISPR-Cas12a干预阻断逆转录生物体的逆转录转座的技术，以及用于阻断逆转录生物体在真核细胞内逆转录转座的体系及其应用。本发明还揭示了用于有效检测逆转录生物体在细胞内转座情况的测试模型及测试方法，以Tf1这一逆转录病毒的模型体系进行了研究和论证。本发明的技术方案不仅首次利用Cas12a实现对逆转录转座的抑制，而且其阻断逆转录转座的效率非常高。逆转录转座的效率非常高。


技术研发人员：李轩 张牛冰 荆新云
受保护的技术使用者：中国科学院分子植物科学卓越创新中心
技术研发日：2020.04.22
技术公布日：2021/10/22