一种肿瘤细胞特异靶向的新型多肽及其用途的制作方法

1.本发明属于生物医学领域，具体涉及能与人肝癌细胞特异性结合的多肽；包含该多肽的衍生物；编码上述多肽及其衍生物的核酸；及该多肽或衍生物的应用，尤其是用于肿瘤的预防、诊断和治疗。


背景技术：

2.目前更加紧迫的局面是在医药科技如此发达的现代，恶性肿瘤依然是世界范围内难以攻克的高峰。手术、化疗、放疗这三大传统治疗手段虽然可以治疗或者延缓恶性肿瘤的发展，但仍因创伤大、毒副作用强等严重缺陷，给患者造成极大的痛苦。所以针对恶性肿瘤的高效、低毒的治疗手段就成了现代医药研究者们孜孜不倦的追求。在化疗药的研究领域中，抗恶性肿瘤药物对非肿瘤组织的杀伤作用一直以来都是此类药物最明显且难以克服的问题。因此，目前需要寻找出能够与肿瘤细胞组织结合的高特异性靶向分子并且以该靶向分子为突破口研发出更具灵敏性的肝癌早期诊断试剂和靶向药物体系具有重要的意义。
3.现阶段，噬菌体展示技术（pdt）已广泛应用于肿瘤靶向分子筛选，其基本原理是将有一定规律的外源基因库插入到噬菌体基因组中，外源基因编码的多肽或蛋白质分子融合于噬菌体包膜蛋白上，由此建立的噬菌体表达文库可用于亲和筛选能与目标分子特异结合的多肽或蛋白，可高通量分析细胞蛋白质成分及其功能。该技术也应用于已知(或未知)受/抗体的亲和筛选、新受体或自然配体的鉴定、受/抗体表位的作图和模拟、疫苗及新药的研发等多个领域。
4.噬菌体展示肽库是噬菌体展示技术的重要分支，该重组噬菌体库被广泛地用于鉴定和开发肿瘤归巢肽(thp
s
)。肿瘤归巢肽能与肿瘤细胞或肿瘤微环境成分特异性结合，而与正常细胞无亲和力或亲和力较低，通过特异识别肿瘤细胞或肿瘤血管表达的受体而发挥导向作用；此外，部分肿瘤归巢肽还具有穿膜特性，使药物能够更加有效地进入肿瘤细胞内，从而提高治疗药物在癌症治疗中的疗效并降低不良反应。肿瘤归巢肽介导的靶向载药系统有望为分子成像诊断及靶向药物研发的一种新策略和新手段。
5.发明人应用噬菌体展示12肽库筛选得到与肿瘤细胞靶向结合的阳性噬菌体克隆，通过dna结构分析和三联密码翻译，得到与人肿瘤细胞相互作用的多肽的序列和结构。本发明的优势在于，(1)多肽能够与人肿瘤细胞靶向结合，即具有肿瘤靶向性，可用作诊断和治疗的工具。（2）该多肽片段具有较高的水溶性且性质相对稳定、不易失活，极大地拓宽了靶向肽的应用范围。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种具有高亲和性、特异性结合肿瘤细胞的新型多肽及其用途，通过特异性靶向结合肿瘤细胞，而对人正常细胞没有影响，优选地将这种新型靶向多肽或其衍生产品用于制备靶向肿瘤的抗肿瘤药物或显像制剂。
7.本发明的原理在于：以人肝正常上皮细胞hl7702为对照，采用人肝癌细胞hepg2对
噬菌体展示肽库进行减数筛选，用蓝白筛选试验挑选出能够与人肝癌细胞发生特异性结合的阳性噬菌体克隆，并用elisa实验验证噬菌体与人肝癌细胞结合的特异性。然后以大肠杆菌为载体，扩增纯化噬菌体后提取其dna进行测序，即得到能够与人肝癌细胞发生特异性结合的多肽编码序列，并人工合成荧光标记的阳性多肽，进行荧光标记-多肽与人肝癌细胞的结合作用的验证，进而为肝癌的早期诊断和靶向治疗提供实验基础。
8.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：本发明的首要目的在于提供能与人肿瘤细胞特异靶向结合的多肽，其氨基酸序列分别为：seq id no.1：qtnytsvhmgss；seq id no.2：nsqhpslyvwas；seq id no.3：dpqhsslyvssa；seq id no.4：qtnytsvhmass；seq id no.5：htasyysavgsa；seq id no.6：ypsahhslmrpa；seq id no.7：mpsmghaaiapn；seq id no.8：vsavwysalstg；seq id no.9：dpnhaavhmgaa。
9.上述多肽对肿瘤细胞有靶向作用，能与肿瘤细胞特异性结合。
10.所述的肿瘤细胞为人肝癌细胞。
11.上述多肽链中单字母符号代表的氨基酸残基，见氨基酸缩略表：表1 氨基酸缩略表单字母三字母英文名称中文名称aalaalanine丙氨酸ccyscysteine半胱氨酸daspasparticacid天冬氨酸egluglutamicacid谷氨酸fphephenylalanine苯丙氨酸gglyglycine甘氨酸hhishistidine组氨酸iileisoleucine异亮氨酸klyslysine赖氨酸lleuleucine亮氨酸mmetmethionine甲硫氨酸nasnasparagine天冬酰胺pproproline脯氨酸qglnglutamine谷氨酰胺rargarginine精氨酸sserserine丝氨酸tthrthreonine苏氨酸vvalvaline缬氨酸wtrptyrptophan色氨酸ytyrtyrosine酪氨酸本发明目的之一在于提供一种生物活性片段或衍生物，其特征在于包含权利要求1所述的任一多肽序列为核心序列，包括共价连接的化合物以及由核心序列组成的多聚体混合。
12.优选地，该生物活性片段或衍生物与权利要求1中所述多肽具有相同的生物学功能，即同样具有特异性靶向人肝癌的作用。
13.本发明目的之一在于提供一种多聚核苷酸序列，其可以编码包含权利要求1所述的seq id no.1-seq id no.9的任一项多肽序列以及权利要求2所述的多肽活性片段及其衍生物。
14.本发明还进一步提供了一种用于肿瘤诊断的多肽分子探针，包含氨基酸序列为seq id no.1-seq id no.9所述多肽。
15.本发明还进一步提供了一种显像剂，包含本发明所述多肽和显影剂或放射性核素，用于临床肿瘤的成像和诊断。
16.本发明还提供一种药物组合物，包括本发明提供的氨基酸序列为seq id no.1-seq id no.9所述的多肽作为靶向肽，作为用于肿瘤治疗的药物，也可作为靶头增加药物或载有药物的载体如纳米材料、脂质体等。
17.本发明提供的药物组合物还包括与所述的多肽相缀合或混合可制备靶向药物的载体。
18.进一步地，所述载体为目前药剂学广泛应用的、天然的高分子材料以及人工合成的分子聚合物及他们的混合物。
19.优选地，所述的制剂为烷化剂、抗代谢药物、抗肿瘤天然药物、激素、抗肿瘤抗生素、金属络合物或肿瘤放射靶向标瘤放射靶向标记物中的任意一种。
20.更优选地，所述的制剂为能杀伤肿瘤细胞的化学药物、生物药物、纳米药物、放射性药物、光动力治疗或光热治疗药物或包裹这些药物的载体中的任意一种。
21.本发明还提供上述药物组合物在任何药物治疗学上可接受的剂量和剂型。
22.本发明还提供了氨基酸序列为seq id no.1-seq id no.9所述的多肽及其生物活性片段或衍生物在制备用于预防、治疗或诊断肿瘤的药物或显像制剂中的用途。
23.适用的肿瘤范围为肝癌、肺癌、大肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌中的任意一种，其中肝癌为首选。
24.本发明利用了噬菌体展示技术筛选与人肝癌特异结合的多肽，鉴定其特异性和亲和力，为临床上肝癌诊断试剂及靶向治疗药物的研制奠定基础。
25.本发明的优势是：（1）小分子多肽类药物更易于渗透入组织，用药量更少、选择性更强、特异性更好、作用效果更好、副作用更小。
26.（2）小分子多肽类药物的化学合成技术成熟，操作流程简单便捷，更易于实现大批量生产，且生产成本低。
27.（3）本发明中的多肽具有特异性靶向肿瘤细胞作用，可以广泛应用于药物筛选、疫苗和诊断试剂的研发等领域，具有较大的潜在临床应用前景。
附图说明
28.图1为噬菌体展示技术对肝癌细胞特异性结合阳性噬菌体克隆的三轮差减筛选实验结果图：a为三轮噬菌体淘选后洗脱液的滴定数；b为三轮噬菌体淘选的洗脱液滴度蓝白斑平板图。
29.图2为elisa鉴定1-30号阳性噬菌体克隆与人肝癌细胞hepg2亲和力的od
405
结果图。
30.图3为30个阳性噬菌体克隆的dna测序结果。a为阳性噬菌体克隆dna测序统计表；b为重复率最高的阳性噬菌体克隆的dna测序图。
31.图4 为荧光标记多肽fitc-qs与肝正常上皮细胞hl-7702和肝癌细胞hepg2靶向结合的细胞免疫荧光结果图。a为fitc-qs与肝正常上皮细胞hl-7702、肝癌细胞hepg2结合的共聚焦结果图；b为相对荧光强度统计柱状图。
具体实施方式
32.以下通过具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
33.实施例1利用噬菌体展示技术对肝癌细胞特异性结合阳性噬菌体克隆的三轮差减筛选1.1宿主菌e.coli er2738的复苏、培养制备大肠杆菌平板，取lb-tet培养平板于37℃孵箱预热1小时，待e.coli er2738菌液融化后，用接种环蘸取少量菌液均匀铺在培养平板，然后倒置于37℃的恒温培养箱中过夜培养。制备宿主菌液，将从生长良好的培养板中挑取的单一菌落放入含有四环素的lb细菌培养液中，37℃、180rpm振荡过夜培养，当细菌处于对数生长期时终止摇菌。含大肠杆菌的lb-tet平板制备好后放到4℃冰箱保存备用，宿主菌液放到-80℃冰箱保存备用。
34.1.2噬菌体展示十二肽库体外减性筛选以人源性肝癌细胞hepg2作为靶细胞，人正常肝上皮细胞hl-7702为吸附细胞。利用噬菌体展示技术体外筛选方法，对纽英伦生物技术有限公司 (new england biolabs) 的 ph.d.-12
tm phage display peptide library 进行3轮体外筛选。并尽量保证每一轮噬菌体的投入总量相同，每轮递增筛选压力，最终获得高度富集的噬菌体。具体筛选步骤如下：1.2.1准备筛选所用细胞挑选出生长良好的人源性肝癌细胞hepg2、人正常肝上皮细胞hl-7702。培养皿中分别加入胰蛋白酶消化细胞，显微镜下观察待细胞变圆变亮时，吸掉胰酶，加入含血清的细胞培养基终止消化，用枪轻轻吹打细胞使贴壁细胞悬浮。将两种细胞悬液分别加到预先制备好的、经过多聚赖氨酸处理的培养皿中，将培养皿放入到细胞孵育箱中，培养至细胞贴壁，细胞生长状态良好时进行筛选。
35.1.2.2准备菌液筛选当天将过夜培养的宿主菌液加到lb培养液中。37℃、180rpm振荡约3小时。以上为筛选滴度测定及扩增使用菌液。
36.1.2.3封闭细胞用吸管吸净培养皿中的液体，并在无菌滤纸上将培养皿中液体拍甩干净。用0.5%bsa封闭，37℃放置1小时。
37.1.2.4肽库结合弃掉培养皿里的封闭液。加入用tbst稀释100倍的ph.d.
ꢀ-
12 tm
原始噬菌体展示十二肽库，室温下120rpm微摇作用1小时。
38.1.2.5洗涤
吸掉第一轮未结合的噬菌体液，把培养皿放到无菌滤纸上用力拍干。用0.1%tbst洗涤培养皿10次，每次约30秒左右，并冲洗培养皿底部及其边缘，倒掉洗涤液，在无菌滤纸上拍干（注意每次洗涤后更换一张新的干净滤纸，防治交叉污染）。
39.1.2.6洗脱培养皿里加入洗脱液（0.2m glycine-hcl，ph2.2），常温下、80rpm、微摇15min。洗脱作用结束后，轻轻吹打洗脱液后吸出，加入到含有中和缓冲液的ep管里，混匀。
40.1.3测定噬菌体滴度提前摇菌，加tet到lb中，37度180rpm，3小时后，达到对数生长期（od值达到0.6左右为佳）。测定滴度前先将lb/ iptg/xgal平板在37℃孵箱预热1小时以上。准备琼脂糖凝胶，微波加热至融化。取吸附后中和洗脱液（或扩增后噬菌体上清液），用lb培养基倍数稀释噬菌体。稀释范围为：吸附后中和洗脱液稀释10
2-105；扩增后噬菌体上清液稀释10
9-10
12
。每个ep管加入备好的菌液，并在每管里加入10μl不同稀释倍数的噬菌体液。在振荡仪上振荡5min混匀。把感染后噬菌体液加到室温融化的琼脂中，立即将混悬液加至已预热的lb/ iptg/xgal平板里，用冷却的涂布玻璃棒均匀涂开（每个稀释倍数一个平板，并做好标记）。将涂好的平板倒置于37℃的孵箱过夜培养。第二天检查平板上的噬菌体蓝斑生长情况并计数。
41.1.4噬菌体扩增纯化把剩余的吸附后洗脱液进行扩增纯化，以备接下来的筛选。取无菌离心管，把备好的过夜宿主菌接种到lb培养基中，形成对数前宿主菌液。把所有的吸附后洗脱液加入到对数前宿主菌液里，于37℃、200rpm快速振荡5小时进行扩增。把扩增噬菌体液于4℃、12000rpm离心10min，把上清转到另一新的离心管里再次同等条件下离心。小心取离心管上部80%的上清液到一新的离心管里，再往离心管里加入六分之一体积的peg/nacl，放4℃冰箱过夜沉淀。次日，将前日沉淀50ml管于4℃、12000rpm条件下离心15min，弃上清，再次同等条件离心2min，弃掉剩余上清液。把沉淀物用1ml的tbs重悬后转移到无菌ep管里，于4℃、14000rpm条件下离心5min。上清转移到新的ep管里，再次加入六分之一体积的peg/ nacl，冰上沉淀1小时。于4℃、14000rpm条件下离心10min，弃掉上清液，保留沉淀。用200μl的tbs重悬沉淀物，于4℃、1000rpm离心1min，保留上清于新的ep管（此为扩增后噬菌体液），-20℃冰箱储存。
42.1.5第二到三轮筛选筛选的基本步骤同第一轮。每下一轮筛选均选用前一轮扩增后的噬菌体液作为次级肽库，每轮尽量保持同第一轮基本一致的噬菌体投入量，总共进行三轮减性筛选。每轮筛选后的洗脱液均要测定噬菌体滴度，并计算噬菌体的回收率。
43.结果如图1所示，图1为利用噬菌体展示技术对肝癌细胞特异性结合阳性多肽的三轮减性筛选实验结果图；其中a为三轮筛选各轮洗脱液的噬菌体滴度；b为三轮噬菌体淘选的洗脱液滴度蓝白斑平板图，上述结果显示，各轮淘选后能够与肝癌细胞特异性结合的阳性噬菌体洗脱液的滴定数分别为：4.6*105pfu/ml、9.8*10
6 pfu/ml、1.2*10
8 pfu/ml，可见经过三轮淘选后能够与肝癌细胞特异性结合的阳性噬菌体克隆显著富集。
44.实施例2酶联免疫吸附实验检测阳性噬菌体克隆与肝癌细胞的亲和力2.1 纯化阳性噬菌体克隆2.1.1阳性噬菌体的扩增：在锥形瓶中加入20mllb/tet液体培养基，然后按1:100加入大肠杆菌菌液和待扩增的噬菌体，置于37
º
c，恒温振荡器中剧烈震荡4.5h，得到噬菌体的扩
peg，混匀室温静置20min，4度离心14000r，10min，弃上清，4度14000rpm离心3min，弃上清，加100ul nai，混合均匀，加250ul无水乙醇，静置10min，4度10000rpm离心10min，弃上清，用预冷的70%乙醇轻微洗3次，晾干30min，10000rpm离心5min，弃上清，加60ul te。
59.3.3 dna纯化取上一步60ul te管，加40ul te补足至100ul。向离心管里加入500ul buffer b3，充分混匀。将混合液全部移入吸附柱，室温下，8000g，离心30秒，将滤出液再次加入吸附柱中再次过柱。倒掉收集管里的液体，将吸附柱放回收集管里。向吸附柱里加入500μl wash solution，9000g，离心30秒。倒掉收集管里的液体，吸附柱重新放到收集管中。重复上一步骤，将空吸附柱和收集管放入离心机，9000g，离心1min。在吸附膜中央加入40μl的elution buffer，室温静置2min。9000g离心1min，将所得到的dna溶液进行测序。
60.3.4 测定dna序列并分析将提取的单链dna进行序列测定，并根据三联密码子的原则翻译出相应的氨基酸序列。用dnastar软件将其翻译为短肽序列和结构分析，并运用ncbi blast与已知蛋白多肽序列对比同源性；genebank、swiss-prot蛋白数据库对核苷酸序列进行相似性分析。
61.结果如图3所示为阳性噬菌体克隆的测序结果，a为dna测序结果中筛选出来的9个序列和重复次数，共测了30个阳性单克隆噬菌体，其中重复次数最高的seq id no.1为7次，其他序列重复次数分别为seq id no.2为5次，seq id no.3为4次，seq id no.4为4次，seq id no.5为3次，seq id no.6为3次，seq id no.7为2次，seq id no.8为1次，seq id no.9为1次，将9个序列与已知蛋白多肽序列对比同源性和相似性分析结果为与已知蛋白多肽序列没有同源性，与核苷酸序列没有相似性。b为重复率最高的阳性噬菌体克隆的dna测序波形图。
62.实施例4 共聚焦检测fitc-阳性多肽片段fitc-qs与肝癌细胞特异靶向结合能力根据测得的氨基酸序列，采取固相合成的方法制备荧光标记多肽fitc-qs，并采用c18反相制备柱纯化，冷冻干燥后得到白色固体即为产物。将hepg2和hl-7702细胞铺于带有载玻片的24孔板中，放细胞孵箱培养细胞贴壁并铺满单层。24小时后，弃去培养基用pbs洗3次，每次5min。4%多聚甲醛固定10min。pbs洗3次，每次5min。用含0.5% tritonx-100的pbs孵育10min。pbs洗3次，每次5min。加3% bsa封闭，室温静置15min。加入5μm fitc-qs，37度静置15min。pbs洗3次，每次5min。加入dab染液，37度静置15min。将24孔板中的载玻片取出，倒扣在加有抗荧光淬灭封片剂的载玻片上，通过激光共聚焦显微镜定位fitc-qs在细胞的位置，并鉴定肝癌细胞的特异性靶向作用。
63.结果如图4所示，为fitc-qs与肝正常上皮细胞hl-7702和肝癌细胞hepg2靶向结合的细胞免疫荧光结果图。其中a为共聚焦实测图，结果发现，在肝癌细胞hepg2上观察到强荧光信号，而在肝正常上皮细胞hl-7702上则几乎检测不到荧光信号。b为相对荧光强度柱形统计图，可以发现与正常上皮细胞相比，多肽fitc-qs与肝癌细胞的结合能力显著增强，有统计学意义，***p <0.001。