一种日香桂快速脱分化相关ofWOX1基因及其应用的制作方法

一种日香桂快速脱分化相关ofwox1基因及其应用
技术领域
1.本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一种日香桂(osmanthus fragrans cv.
′
rixianggui
′
)快速脱分化相关ofwox1基因及其应用。


背景技术：

2.桂花，木犀科木犀属常绿阔叶观赏树种，素以香花著称。桂花的寿命长，适应性广，广泛分布于多个城市。wox转录因子家族是植物特有的一类转录因子家族，参与了干细胞调控、胚胎发育、植物组织器官的发生和形成等过程，对植物的发育过程有十分重要的生物学意义。相关研究表明，wox转录因子可以促使植物干细胞的分裂分化。前人对桂花组织培养进行了大量的研究工作，并取得了一定的成果。但在不定芽诱导的过程中，愈伤组织会难以脱分化并逐渐褐化死亡。
3.研究发掘桂花基因组中有关细胞分化及分裂的重要相关基因，很可能会对桂花的遗传转化体系的建立有重要促进作用。


技术实现要素：

4.针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种日香桂快速脱分化相关ofwox1基因。本发明所要解决的另一技术问题在于提供所述日香桂快速脱分化相关ofwox1基因的具体应用。
5.为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
6.一种日香桂快速脱分化相关ofwox1基因，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
7.所述日香桂快速脱分化相关ofwox1基因的表达蛋白，其氨基酸序列如seq id no.2所示。
8.含有所述日香桂快速脱分化相关ofwox1基因的载体或宿主菌。
9.进一步地，所述的载体是植物重组表达载体。
10.进一步地，所述的植物重组表达载体具体为pbi121
‑
ofwox1。
11.所述日香桂快速脱分化相关ofwox1基因在植物脱分化中的应用。
12.进一步地，所述的应用包括以下步骤：
13.1)构建所述日香桂快速脱分化相关ofwox1基因的载体；
14.2)将所构建的载体转化到植物或植物细胞中；
15.3)培育获得转基因植物的植株；
16.4)利用植株的全部或部分组织进行培养，获得愈伤组织或芽。
17.进一步地，所述植物为日香桂或烟草。
18.相比于现有技术，本发明的有益效果为：
19.本发明提供的一种日香桂快速脱分化相关ofwox1基因，是一种转录因子基因，其核苷酸序列如seq id no.1所示。本发明基于前期研究和生物信息学分析软件初步预测了该基因的功能。通过克隆得到基因序列的全长，在此基础上构建了超表达载体并进行大花
烟草的遗传转化。结果发现，在筛选培养基上生长35d后，外植体可快速出芽，而且出芽率显著高于ck，表明ofwox1在脱分化方面发挥了重要的调控作用。作为愈伤组织分化不定芽过程中重要转录因子ofwox1基因，可以用于基因工程中一些难以脱分化的植物具有重要实际应用价值。
附图说明
20.图1为目的基因扩增产物琼脂糖电泳图；
21.图2为连接转化后阳性单菌落检测图；
22.图3为双酶切后的载体琼脂糖电泳图；
23.图4为转化农杆菌gv3101后的菌检琼脂糖电泳图；
24.图5为日香桂的愈伤组织图；
25.图6为筛选培养基生长35d后的外植体图；图左为(ck)，图右为(转基因)；
26.图7为筛选培养基生长35d后的出芽率图。
具体实施方式
27.下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。以下实施例中，未详细叙述的操作均为常规生物学实验操作，可参照分子生物学实验手册以及现有公开的期刊文献等进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
28.本技术所用材料为由日香桂二年生扦插苗的嫩叶诱导出的愈伤组织。2019年4月，在超净工作台内用无菌手术刀切下愈伤组织并将其装入灭菌的离心管中，立即放入液氮中速冻，然后置于
‑
80℃冰箱内保存。所用的大花烟草实生苗由南京林业大学王良桂课题组提供。
29.本实施例采用tiangen植物rna提取试剂盒(dp432)提取植物总rna。采用takara primescript
tm rt master mix(perfect real time)反转录试剂盒将所提取到的rna反转录成cdna，最后得到的cdna加水稀释10倍后于
‑
20℃冰箱保存。
30.实施例1：构建日香桂ofwox1基因的超表达载体
31.(1)获取目的基因
32.根据前期课题组已发表的桂花全基因组数据库，筛选得到1个基因序列，与模式植物拟南芥的序列进行比对，并命名为ofwox1。
33.(2)设计引物
34.利用bioxm软件对该基因的核苷酸全长序列进行酶切位点分析，选择bamh i和sma i酶作为两个限制性内切酶。利用ce design软件设计引物。按要求进行相关信息的填写，具体包括载体上的酶切位点附近的序列、目的基因全长、按顺序填写2个酶切位点(5
′
端和3
′
端)，即可得到扩增引物。设计好的序列由捷瑞生物公司合成。
35.f：5
′‑
acgggggactctagaggatccatgaaggtgcatcagcttgca
‑3′
，
36.r：5
′‑
ataagggactgaccacccgggtcttccttcaggatgcaaaggg
‑3′
。
37.(3)载体双酶切
38.提前将pbi21载体从
‑
80℃超低温冰箱中取出进行活化和摇菌，按照质粒提取试剂
盒(北京天根生化科技有限公司)提取pbi121载体质粒，随后进行双酶切实验，体系(20μl)为：限制性内切酶11μl，限制性内切酶21μl，buffer 2μl，载体质粒xμl，ddh2o add to 20μl。
39.其中x(μl)＝1000ng/载体质粒浓度(ng/μl)。将离心管微微震荡，使其混匀，瞬时离心6s，置于37℃的水浴锅内培养1h。将获得的双酶切后的载体进行琼脂糖电泳，然后利用试剂盒进行切胶回收。
40.(4)目的基因扩增
41.以稀释10倍的cdna为模板，进行pcr扩增，体系(20μl)如下：
42.forward primer 1μl，reverse primer 1μl，cdna 1μl，prime star 10μl，，ddh2o 7μl。反应条件为：98℃变性10s；58℃退火15s；72℃延伸1min，35个循环；72℃总延伸10min；16℃终止反应。将获得的扩增产物进行琼脂糖电泳，然后利用试剂盒进行切胶回收(图1)。
43.(5)连接转化
44.连接体系(20μl)如下：目的基因回收产物200ng，质粒双酶切回收产物100ng，连接酶2μl，buffer 1μl，ddh2o add to 20μl。
45.将离心管微微震荡，使其混匀，瞬时离心6s，置于37℃的水浴锅内培养30min，冰上2min。
46.转化：超净工作台内，用移液枪取5μl的连接产物于50μl的trelief tm 5α感受态细胞，轻弹混匀，冰浴5min，42℃水浴60s，再冰浴2min，加250μl液体lb(不含kana)，37℃，200rppm的摇床内孵育30min。
47.涂板：取200μl孵育后的菌液，用灭菌的玻璃棒均匀涂布在lb固体培养基上(内含50mg/l的kana)并晾干，用封口膜后倒置在37℃恒温培养箱内培养12
‑
14h。
48.(6)阳性单菌落检测和测序
49.当培养基上长出菌后，于超净工作台内进行单菌落检测。每个基因挑取8个饱满的单菌落，依序依次在含kana抗性的lb固体培养基上进行备份，并用无菌牙签将相应的单菌落沾取至以下体系(20μl)进行菌检：35sf 1μl，gene r1μl，green mix 10μl，ddh2o 8μl。
50.pcr反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s；58℃退火30s；72℃延伸1min，35个循环；72℃总延伸10min；16℃终止反应。将获得的扩增产物进行琼脂糖电泳(图2)，挑取3个正确的阳性菌落送测，测得ofwox1基因的核苷酸序列如序列表中seq id no.1所示，其表达蛋白的氨基酸序列如序列表中seq id no.2所示。
51.(7)双酶切验
52.将测序得到的序列正确的质粒进行双酶切验证，体系(20μl)如下：限制性内切酶11μl，限制性内切酶21μl，buffer 2μl，载体质粒xμl，ddh2o 6μl。
53.其中x(μl)＝1000ng/载体质粒浓度(ng/μl)。将离心管微微震荡，使其混匀，瞬时离心6s，置于37℃的水浴锅内培养1h。将获得的双酶切后的载体进行琼脂糖电泳，检测双酶切情况，图3中目的片段的长度，687bp左右。
54.实施例2：转化农杆菌gv3101
55.(1)将保存在
‑
80℃超低温冰箱内的gv3101感受态取出放在冰上融化。每33μl感受态加入1μl质粒，吸打混匀后依次冰浴20min、液氨速冻5min、37℃水浴5min、冰浴5min；
56.(2)加500μl无抗性的lb液体培养基，28℃，200rppm摇床上培养1h；
57.(3)培养完成后，将菌液6000r，离心1min，弃去部分上清液，留100μl均匀涂布于lb固体培养基上(内含50mg/l kana)，封口膜密封，倒置于28℃培养箱中培养40
‑
48h；
58.(4)菌检和备份：菌检中的目的条带正确且亮度一致(图4)，则将备份的板子中相对应的菌落挑入lb液体培养基(内含50mg/l kana)中摇菌，再将菌液和50％甘油按3∶7的体积比保菌，液氮中速冻后保存在
‑
80℃超低温冰箱内。
59.实施例3：侵染大花烟草并进行筛选得到抗性芽
60.(1)外植体消毒：将大花烟草嫩叶采下后用洗洁精清洗叶片表面的灰层，流水冲洗30min后转移至超净工作台内进行消毒处理。首先在烧杯中倒入75％乙醇，震荡，使乙醇与嫩叶表面充分接触，时间30s，无菌水清洗3次。然后用5％naclo浸泡10min，无菌水冲洗4次，用无菌滤纸吸干叶片表面的水分。消毒处理后，用无菌的手术刀将叶片边缘和叶脉切除，再将剩余的叶片切成0.5
×
0.5cm的小块以待侵染。
61.(2)摇菌：将pbi121空载和连入目的基因的载体菌液取出放在冰上融化，用移液枪将菌液加入20ml的lb液体培养基(内含50mg/lkana)中，放在28℃、200rppm的摇床上暗培养，直至菌液od
600
＝0.4
‑
0.45之间；
62.(3)侵染：用无菌镊子将切好的烟草叶片转移至侵染液中侵染10min，每隔2min摇晃一次锥形瓶；
63.(4)共培养：将侵染完后的叶子取出平铺在无菌滤纸上，待菌液稍干后将叶片平铺在共生培养基中(ms 2.25mg/l 6
‑
ba 0.3mg/l naa)，25℃暗培养3d；
64.(5)筛选培养：共培养3d后将叶片转接到筛选培养基(ms 2.25mg/l 6
‑
ba 0.3mg/l naa 400mg/l cef 100mg/l kana)上培养，每隔15d左右更换一次，直至长出抗性愈伤组织(图5)及抗性芽。
65.(6)统计出芽率：在筛选培养基上生长35d，进行外植体拍照(图6)并统计出芽率(图7)，出芽率＝出芽的外植体数/总外植体数
×
100％。由结果可知，以含目的基因ofwox1的菌液侵染大花烟草的叶子可促使其快速出芽，而且出芽率(53.06％)显著高于ck(10.04％)，表明ofwox1发挥了重要的调控作用。