前列腺癌的风险评估装置的制作方法

1.本发明涉及生物医学领域，尤其涉及一种前列腺癌的风险评估装置。


背景技术：

2.在全球范围内，前列腺癌在男性中是发病率仅次于肺癌的恶性肿瘤。近些年伴随着人口老龄化、饮食及生活方式的改变、诊疗技术的提升及健康观念的增强，前列腺癌的发病率及诊出率出现了较为显著的上升。早期诊断对于前列腺癌是极其重要的一环，但一直以来都缺乏相关的诊断工具来区分高级别和低级别的前列腺癌。前列腺特异抗原(psa)筛查是目前确定男性是否应进行前列腺活检的最常用测试，但其无论是假阳性率还是假阴性率都很高，因而并无法准确预测侵袭性疾病的存在。然而大多数psa水平升高的男性会立即进行组织活检，即使其实很多人患有的只是低级别前列腺癌或者根本没有患前列腺癌。过度治疗常带来例如感染，败血症甚至死亡等并发症，而不必要的侵入式治疗也会有副作用，如阳痿和尿失禁等，同时患者的心理负担也会大大增加。而前列腺穿刺阴性结果亦不能完全排除前列腺癌的可能，而进行前列腺活检的男性中也只有25％患有高级别前列腺癌。
3.因此，需要一种基于非侵入性手段的液体活检测试，能够准确地预测前列腺癌的侵袭性，避免对低风险或良性患者进行不必要的活检。


技术实现要素：

4.为了解决上述技术问题，本发明提出一种前列腺癌的风险评估装置。
5.本发明提供的一种前列腺癌的风险评估装置，包括收集装置、核酸获取装置、扩增装置以及数据获取及分析装置。
6.收集装置用于收集测试者的外泌体溶液。
7.核酸获取装置用于提取所述外泌体溶液的rna，得到样品rna溶液。
8.扩增装置用于定量检测所述样品rna溶液中所述目标区域，所述目标区域包括pca3基因、erg基因以及spdef基因。
9.数据获取及分析装置用于获取pca3基因、erg基因以及spdef基因的表达量，并计算出pca3基因和erg基因相对spdef基因的表达量。
10.其中，所述数据获取及分析装置通过记录pca3基因、erg基因及spdef基因的ct值，将pca3基因和erg基因的表达水平归一化至spdef基因，分别计算得到pca3基因和erg基因的δct值，利用相对表达量的计算公式δδct＝2^δct(pca3) 2^δct(erg)，计算出pca3基因和erg基因的相对表达量之和，再利用公式：(16.92
‑
δδct)*1.83，计算出一分数，该分数能反映发生前列腺癌的风险级别。
11.本技术实施方式中，所述扩增装置包括qrt
‑
pcr扩增体系。
12.本技术实施方式中，所述核酸提取装置提取所述外泌体溶液中的所述样品rna溶液的方法包括：
13.向所述外泌体溶液中加入600～800μl trizol溶液，18
‑
25℃下孵育匀浆3～5min
后，加入100～220μl氯仿，晃动混匀10～20s，在2～6℃、10000～12000rpm离心10～15min，取上层澄清溶液，将上层澄清溶液进行rna纯化，得到样品rna溶液。
14.本技术实施方式中，所述扩增装置对所述样品rna溶液的扩增方法包括：
15.将样品rna溶液加入qrt
‑
pcr扩增体系中，先在30℃～50℃条件下，扩增10min～30min，再在90℃～95℃条件下，扩增2min～10min。
16.进一步在90℃～95℃条件下，扩增10s～30s，最后在55℃～65℃条件下，扩增30s～60s，此步骤循环30次～50次，得到pcr产物。
17.其中，在55℃～65℃扩增的步骤采集荧光信号。
18.本技术实施方式中，所述qrt
‑
pcr扩增体系包括引物混合液、pcr缓冲液、pcr反应液和酶混液。
19.本技术实施方式中，按浓度计算，所述引物混合液包括：100nm～500nm的erg f、100nm～500nm erg r、100nm～500nm的erg pb、100nm～500nm的spdef f、100nm～500nm的spdef r、100nm～500nm的spdef r、100nm～500nm的spdef pb、100nm～500nm的pca3 f、100nm～500nm的pca3 r、100nm～500nm的pca3 pb、0.1～10rox和余量的水。
20.本技术实施方式中，所述pcr缓冲液包括浓度为50mm～800mm ph值为7.5～9.0的tris
‑
hcl溶液、浓度为50mm～800mm的kcl、浓度为50mm～500mm的硫酸铵和余量水。
21.本技术实施方式中，所述pcr反应液包括1～10pcr缓冲液、1mm～6mm的mgcl2、重量百分比为0.5％～5％的甘油、0.1～1pc300和余量的水。
22.本技术实施方式中，所述酶混液包括浓度为1u～10u的taq
‑
hs、浓度为1u～50u的rtase、taq buffer、0.1mm～1mm dntps、0.1～10pc300和余量的水。
23.本技术实施方式中，所述收集装置还用于对所述外泌体溶液进行前处理，所述前处理包括提纯所述外泌体溶液。
24.相较于现有技术，本发明的有益效果在于：通过直接从人体尿液中提取外泌体，尿液不需要dre预收集或特殊处理；通过测定外泌体中三种优选靶标pca3基因、erg基因以及spdef基因的含量，计算出pca3基因和erg基因的相对表达量，无需侵入性手段，避免对患有阴性和/或惰性前列腺癌的男性进行初步活检，无创液态活检，只需收集尿液样本，有很高依从性；使用普通的荧光定量pcr仪器，就可完成检测，不需另外购置设备；多重一步法检测，简单快速，且闭管式操作很好的避免污染。
具体实施方式
25.下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施方式仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
26.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的技术手段的名称只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
27.在不冲突的情况下，下述的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
28.本发明提供一种前列腺癌的风险评估装置，包括收集装置、核酸获取装置、扩增装
置和数据获取及分析装置。
29.所述收集装置用于收集测试者的外泌体溶液。
30.本实施方式中，收集5～50ml以上测试者的尿液，利用超滤法提取出其中的外泌体溶液，滤膜的孔径为20nm。除了超滤法之外，还可以采用超速离心，膜亲和，聚合物沉降，排阻色谱，免疫捕获等方式来提纯和浓缩外泌体溶液。最后获得100～500μl纯化的外泌体溶液。
31.所述核酸获取装置用于提取所述外泌体溶液的rna，得到样品rna溶液。
32.本实施方式中，使用mirneasy小型试剂盒(qiagen)从纯化的外泌体中提取去除核糖体rna的所有外泌体rna。
33.具体步骤包括：通过向样品外泌体溶液中添加200～1000μl的trizol来裂解外泌体溶液，室温(18
‑
25℃)下孵育匀浆2～15min，上下颠倒晃动混匀15～30s，在2～8℃、8000～14000rpm条件下离心5～20min，取上层澄清溶液，将上层澄清溶液置于rneasy微型柱上进行rna纯化，得到样品rna溶液。
34.所述扩增装置用于定量检测所述样品rna溶液中所述目标区域，所述目标区域包括pca3基因、erg基因以及spdef基因。
35.本实施方式中，通过实时pcr技术定量检测样品rna溶液中的pca3基因、erg基因、spdef基因、klk3基因、amacr基因、birc5基因、hoxc6基因以及sparcl1基因的表达量，本发明优选pca3基因、erg基因和spdef基因作为靶标，计算出pca3基因和erg基因相对spdef基因的表达量。在前列腺癌中e
‑
钙粘蛋白表达的降低或丧失是肿瘤细胞转变为侵袭性细胞的普遍现象。sam指向域ets转录因子(spdef)作为e
‑
钙粘蛋白表达的分子开关，因而具备肿瘤侵袭性。在大多数前列腺癌样本中，spdef表达水平高于正常前列腺上皮组织，这表明spdef在癌症中被上调。对比良性前列腺组织，spdef表达在前列腺癌中增加，且随着前列腺癌级别而增加，相比之下，spdef的丧失与前列腺癌的侵袭性增加相关，并具肿瘤转移抑制基因功能特征，spdef表达与肿瘤侵袭性和患者预后呈负相关，表明spdef可作为侵袭性前列腺癌的预后标志物，所以spdef表达可作为区分惰性疾病与前列腺癌中更具致死性的侵袭性表型的诊断或预后标志物。pca3(prostate cancer gene 3)基因是一种前列腺特异的非编码mrna，在前列腺癌组织中高度表达(>95％)，许多研究显示pca3可提高初次活检时癌症的预测准确性,并与前列腺切除术中更具侵略性的癌症相关。erg目前被认为是前列腺癌的关键致癌基因，tmprss2_erg融合基因是其中最常见的融合基因，它是跨膜丝氨酸蛋白酶2(tmprss2)基因与ets转录因子erg发生融合而形成，大约在50％的前列腺癌患者中发生。tmprss2_erg融合会导致前列腺癌更具有侵略性癌症表型，与更高的肿瘤分期和前列腺癌特异性死亡有关。pca3基因、erg基因和spdef基因三者在前列腺癌的早期诊断和判断预后等方面，显示出其独到之处和良好的应用前景。但若采用单一指标去检测，可能其准确性不够，而本发明结合三者的临床意义做联合检测，检测准确性更高。
36.所述数据获取及分析装置用于获取pca3基因、erg基因以及spdef基因的表达量，并计算出pca3基因和erg基因相对spdef基因的表达量。
37.其中，所述数据获取及分析装置通过记录pca3基因、erg基因及spdef基因的ct值，将pca3基因和erg基因的mrna表达水平归一化至spdef基因，分别计算得到pca3基因和erg基因的δct值，利用相对表达量的计算公式δδct＝2^δct，计算出pca3基因和erg基因的
相对表达量，再利用公式：(16.92
‑
δδct)*1.83，计算出pca3基因和erg基因对应的分数，该分数能反映发生前列腺癌的风险级别。具体地，按上述算法计算得出小于10的分数的患者可被鉴定为具有低前列腺癌风险，而为10或更高的分数的患者可被鉴定为具有较高前列腺癌风险。
38.本实施方式中，采用本技术所述装置，尿液不需要dre预收集或特殊处理，采用比较成熟的rt
‑
pcr法，多重一步法检测，简单快速，无创液态活检，只需收集尿液样本，有很高依从性。
39.本实施方式中，实时pcr技术采用的qrt
‑
pcr扩增体系包括引物混合液、pcr缓冲液、pcr反应液和酶混液。
40.引物混合液中包含表1所示组分：
41.表1
42.组分浓度(nm)erg f100～500erg r100～500erg pb100～500spdef f100～500spdef r100～500spdef pb100～500pca3 f100～500pca3 r100～500pca3 pb100～500rox0.1～10h2o/
43.用于检验尿液外泌体pca3基因、erg基因和spdef基因这三种优选靶标的试剂盒中的引物/探针序列组如表2所示，其中包括：seq1
‑
8所示核苷酸序列的引物和seq9
‑
12所示核苷酸序列的探针。表2中各个核苷酸序列的缩略语来自life technologies，其中引物探针指定为“lt”，序列中5
’‑
fam/joe/cy5指5’报告基团，3
’‑
bhq1/bhq2指3
’‑
淬灭基团。
44.表2
45.[0046][0047]
pcr缓冲液包含表3所示组分：
[0048]
表3
[0049]
组分浓度ph
tris
‑
hcl50mm～800mm7.5～9.0kcl50mm～800mm/硫酸铵50mm～500mm/h2o//
[0050]
pcr反应液包含表4所示组分：
[0051]
表4
[0052]
组分浓度pcr缓冲液1～10mgcl21mm～6mm甘油0.5wt％～5wt％pc3000.1～1h2o/
[0053]
酶混液包含表5所示组分：
[0054]
表5
[0055]
组分 taq
‑
hs1u～10urtase1u～50utaq buffer/dntps0.1mm～1mmpc3000.1～10h2o/
[0056]
上述qrt
‑
pcr扩增反应的步骤包括：
[0057]
第一步：在pcr仪中，先30～50℃，扩增10～50min，再90～95℃，扩增2～10min；
[0058]
第二步：再90～95℃，扩增10～30s，再55～65℃，扩增30～60s，此步骤循环35～50次，得到pcr产物。
[0059]
其中，在55～65℃扩增的步骤采集荧光信号，记录pca3基因、erg基因及spdef基因的ct值，其中，ct＝
‑
1/lg(1 ex)*lgx lgn/lg(1 ex)，其中，n为扩增反应的循环次数，x为初始模板量，ex为扩增效率，n为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。用相对定量的方法分析实验结果，本发明以pca3基因和erg基因作为目的基因，以spdef基因作为内参基因。用各个样本的pca3基因及erg基因的ct值减各个样本spdef基因的ct值，得到δct，δct＝ct(目的基因)
‑
ct(内参基因)(即，δct＝ct(pca3)或ct(erg)
‑
ct(spdef))，再通过δct计算出δδct，δδct＝2^δct(pca3) 2^δct(erg)，δδct是各个样本pca3基因和erg基因的相对表达量之和，利用公式：(16.92
‑
δδct)*1.83，计算出一个分数，该分数能反映发生前列腺癌的风险级别。具体地，按上述算法计算出小于10的分数的患者可被鉴定为具有低前列腺癌风险，而为10或更高的分数的患者可被鉴定为具有较高前列腺癌风险。
[0060]
具体地，本实施方式来自rt
‑
pcr实验的基因表达结果进行多重分析，使用的归一基因为spdef。根据实验得到的各靶标的ct值，分别计算各自归一至spdef的表达量，具体为用各个样本的pca3基因及erg基因的ct值减各个样本spdef基因的ct值，得到δct，δct＝ct(目的基因)
‑
ct(内参基因)(即，δct＝ct(pca3)或ct(erg)
‑
ct(spdef))，各自的相对表
达量为pca3＝2^δct(pca3)及erg＝2^δct(erg)。再计算检验(ldt)分数(本文称为pca分数)，具体使用下列公式计算：pca分数＝(16.92
‑
δδct)*1.83，其中δδct为pca3及erg的相对表达量之和。根据pca分数为患者样品评分，取截断值为10，小于10的pca分数为低前列腺癌风险关联的分数，大于或等于10的pca分数为与较高前列腺癌风险关联的分数。
[0061]
得到样品基因的相对表达量和评估分数，再结合临床其他标准治疗因素(包括年龄，种族和家族病史)一起使用，可用以指导前列腺活检决策，在对高级别前列腺癌的风险进行分层时，该测试可能避免对患有阴性和/或惰性前列腺癌的男性进行初步活检。
[0062]
本发明还提供一种使用上述前列腺癌的风险评估装置检测目标区域相对表达量的方法，包括以下步骤：
[0063]
s1、收集测试者的尿液，并从尿液中提纯出外泌体溶液。
[0064]
本实施方式中，收集5～50ml以上测试者的尿液，利用超滤法提取出其中的外泌体溶液，滤膜的孔径为20nm。除了超滤法之外，还可以采用超速离心，膜亲和，聚合物沉降，排阻色谱，免疫捕获等方式来提纯和浓缩外泌体溶液。最后获得100～500μl纯化的外泌体溶液。
[0065]
s2、提取s1得到的外泌体溶液的rna，得到样品rna溶液。
[0066]
本实施方式中，使用mirneasy小型试剂盒(qiagen)从纯化的外泌体中提取去除核糖体rna的所有外泌体rna。
[0067]
具体步骤包括：通过向样品外泌体溶液中添加200～1000μl的trizol来裂解外泌体溶液，室温(18
‑
25℃)下孵育匀浆2～15min，上下颠倒晃动混匀10～60s，在2～8℃、8000～14000rpm条件下离心5～20min，取上层澄清溶液，将上层澄清溶液置于rneasy微型柱上进行rna纯化，得到样品rna溶液。
[0068]
s3、取s2中得到的样品rna溶液，通过实时pcr技术定量检测样品rna溶液中的pca3基因、erg基因、spdef基因、klk3基因、amacr基因、birc5基因、hoxc6基因以及sparcl1基因的表达量，本发明优选pca3基因、erg基因和spdef基因作为靶标，计算出pca3基因和erg基因相对spdef基因的表达量。
[0069]
其中，通过记录pca3、erg及spdef的ct值，δct＝ct(目的基因)
‑
ct(内参基因)(即，δct＝ct(pca3)或ct(erg)
‑
ct(spdef))，再通过δct计算出δδct，δδct＝2^δct(pca3) 2^δct(erg)，δδct是各个样本pca3基因和erg基因的相对表达量之和，利用公式：(16.92
‑
δδct)*1.83，计算出一个分数，该分数能反映发生前列腺癌的风险级别。具体地，按上述算法计算出小于10的分数的患者可被鉴定为具有低前列腺癌风险，而为10或更高的分数的患者可被鉴定为具有较高前列腺癌风险。
[0070]
以下通过具体实施例对本技术的所述前列腺癌的风险评估装置用于检测目标区域相对表达量的方法进行具体说明。
[0071]
实施例1
[0072]
s1、收集测试者尿液，从尿液中提纯外泌体溶液。
[0073]
收集5ml～50ml测试者的尿液，利用超滤法提取出其中的外泌体溶液，滤膜的孔径为10～50nm，最后获得100～500μl纯化的外泌体溶液。
[0074]
s2、提取s1得到的外泌体溶液的rna，得到样品rna溶液。
[0075]
通过向样外泌体溶液中添加200～1000μl的trizol来裂解外泌体溶液，室温(18
‑
25℃)下孵育匀浆5～15min，上下颠倒晃动混匀15～30s，在2～8℃、8000～14000rpm条件下离心2～15min，取上层澄清溶液，将上层澄清溶液置于rneasy微型柱上进行rna纯化，得到样品rna溶液。
[0076]
s3、取s2中得到的样品rna溶液，加入到qrt
‑
pcr扩增体系中，先30～50℃，扩增5～50min，再90～95℃，扩增2～10min；
[0077]
再90～95℃，扩增10～30s，再55～65℃，扩增30～60s，此步骤循环30～50次，得到pcr产物。
[0078]
其中，在55～65℃扩增的步骤采集荧光信号，记录pca3基因、erg基因及spdef基因的ct值，再计算得到δct，δct＝ct(目的基因)
‑
ct(内参基因)(即，δct＝ct(pca3)或ct(erg)
‑
ct(spdef))，再通过δct计算出δδct，δδct＝2^δct(pca3) 2^δct(erg)，δδct表示各个样本pca3基因和erg基因的相对表达量之和，利用公式：(16.92
‑
δδct)*1.83，计算出一个分数并进行判断。
[0079]
本实施方式中，实时pcr技术采用的qrt
‑
pcr扩增体系包括引物混合液、pcr缓冲液、pcr反应液和酶混液，具体的引物混合液、pcr缓冲液、pcr反应液和酶混液的组分如上所述。
[0080]
综上所述，本发明的有益效果在于：通过直接从人体尿液中提取外泌体，尿液不需要dre预收集或特殊处理；通过测定外泌体中三种优选靶标pca3基因、erg基因以及spdef基因的含量，计算出pca3基因和erg基因的相对表达量，无需侵入性手段，避免对患有阴性和/或惰性前列腺癌的男性进行初步活检，无创液态活检，只需收集尿液样本，有很高依从性；使用普通的pcr仪器，就可完成检测，不需另外购置设备；多重一步法检测，简单快速，且闭管式操作很好的避免污染。
[0081]
以上实施例和对比例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；另外，对于本领域的普通技术人员来说，可以根据本发明的技术构思做出其它各种相应的改变与变形，而所有这些改变与变形都应属于本发明权利要求的保护范围。