胶质瘤患者原代肿瘤细胞及神经干细胞分离试剂盒的制作方法

1.本实用新型涉及试剂盒技术领域，具体涉及一种胶质瘤患者原代肿瘤细胞及神经干细胞分离试剂盒。


背景技术：

2.胶质瘤是最常见的中枢神经系统原发性癌症，约50％的患者患有最具侵袭性的胶质母细胞瘤。常规疗法包括外科手术，放射疗法和药物疗法，并没有显著改善胶质母细胞瘤患者治疗效果。由于免疫疗法不存在传统疗法的细胞毒性机制，因此在治疗上有较好的前景,结合中枢神经系统特有的肿瘤微环境，越来越多的研究开始靶向肿瘤干细胞及原代肿瘤细胞。
3.神经干细胞是一类具有分裂潜能和自我更新能力的母细胞，可以通过不对等的分裂方式产生神经组织的各类细胞，部分基因突变会导致中枢神经系统中多数分化细胞发生去分化，转为神经干细胞或祖细胞状态，对肿瘤的进展启动和维持发挥重要作用。因此靶向肿瘤干细胞用来治疗胶质瘤有较好的前景。
4.临床前研究常用的细胞系在体外持续传代，逐渐丧失了肿瘤的异质性，相关的信号通路等也发生改变，而原代肿瘤细胞能准确的反映肿瘤组织生物学特征，更能准确的反映机体肿瘤组织对药物实验性评估、药物毒性测试、药理学分析、药物治疗性判断等结果。
5.为了更好的进行胶质瘤的体外研究，为临床治疗提供依据，患者原代肿瘤细胞及神经干细胞的分离是必不可少的。现阶段，同时将原代肿瘤细胞及神经干细胞分离的方法较繁琐，需使用多种药剂及试剂容器分装，携带和储存都不方便。


技术实现要素：

6.为此，本实用新型提供一种胶质瘤患者原代肿瘤细胞及神经干细胞分离试剂盒，以解决上述的问题。
7.为了实现上述目的，本实用新型实施例提供如下技术方案：
8.一种胶质瘤患者原代肿瘤细胞及神经干细胞分离试剂盒，其包括分体的大试剂盒和小试剂盒，所述大试剂盒和小试剂盒均包括盒体以及与所述盒体卡扣连接的盒盖，所述盒体的底部设有缓冲层a，在所述缓冲层a的上部设有固定层a，在所述盒盖的顶部设有缓冲层b，在所述缓冲层b的下部设有固定层b，固定层a和固定层b均设有多个限位孔，大试剂盒的固定层b的限位孔与大试剂盒的固定层a的限位孔数量及位置相同，小试剂盒的固定层b的限位孔与小试剂盒的固定层a的限位孔数量及位置相同；
9.其中，大试剂盒的固定层a设有14个限位孔，限位孔内分别对应放置有一个装有细胞洗涤液的试剂瓶、一个装有原代细胞培养液的试剂瓶、一个装有细胞分离缓冲液的试剂瓶、一个装有红细胞裂解液的试剂瓶、两个装有神经组织分解液的试剂瓶以及八个装有继代细胞培养液的试剂瓶；小试剂盒的固定层a设有8个限位孔，限位孔内分别对应放置有三个装有神经组织分解液的试剂瓶以及五个装有继代细胞培养液的试剂瓶。
10.进一步地，所述缓冲层a与所述盒体胶黏固定，所述缓冲层b与所述盒盖胶黏固定，所述缓冲层a和缓冲层b由泡沫材料制成。
11.进一步地，所述固定层a与所述盒体、所述缓冲层a胶黏固定，所述固定层b与所述盒盖、所述缓冲层b胶黏固定，所述固定层a和固定层b由泡沫材料制成。
12.进一步地，所述试剂瓶包括瓶身以及与所述瓶身旋合固定的瓶盖，所述瓶身贴有标签，所述瓶盖内设有密封垫片。
13.进一步地，所述固定层a的限位孔与所述瓶身相适配，所述固定层b的限位孔与所述瓶盖相适配。
14.进一步地，细胞洗涤液为d
‑
pbs，体积为900ml；原代细胞培养液为祌经干细胞的无血清生长培养基，体积为300ml；细胞分离缓冲液为1.8m蔗糖溶液，体积为250ml；红细胞裂解液体积为50ml；
15.大试剂盒中的神经组织分解液分别为d
‑
pbs和1m hepes buffer，体积分别为100ml和1ml；大试剂盒中的继代细胞培养液分别为neurobasal
tm
‑
a medium、dmem/f
‑
12、100
×
antibiotic
‑
antimycotic、100
×
glutamax
‑
a、sodium pyruvate solution、100
×
mem non
‑
essential amino acids solution、1m hepes buffer和2mg/ml heparin solution，体积分别为50ml、50ml、1ml、1ml、1ml、1ml、1ml和100μl；
16.小试剂盒中的神经组织分解液分别为5mg/ml dnase i、2.5mg/ml collagense ii、dispase ii，体积分别为1ml、1ml、500μl；小试剂盒中的继代细胞培养液分别为50
×
b27、0.1mg/ml h
‑
egf、0.1mg/ml h
‑
fgf1、0.1mg/ml h
‑
pdgf
‑
aa和0.1mg/ml h
‑
pdgf
‑
bb，体积分别为2ml、20μl、20μl、10μl和10μl。
17.本实用新型具有如下优点：
18.在本实用新型中，将细胞洗涤液、原代细胞培养液、细胞分离缓冲液、红细胞裂解液、神经组织分解液以及继代细胞培养液分别装在试剂瓶中，并根据各试剂的储运分别装在大试剂盒和小试剂盒中，将众多的试剂瓶进行收纳在两个盒子中(大试剂盒和小试剂盒)，提高了携带的便捷性；例如将温度在4℃的试剂和试剂瓶放置在大试剂盒内，将温度在
‑
20℃的试剂瓶(内含试剂)放置在小试剂盒内，可轻松实现不同温度的储运，储运温度得以满足的同时，可提高成功率；底部的缓冲层还能起到防震的作用，固定层能避免试剂瓶在盒体内晃动，提高运输时的安全性及成功率；由于缓冲层和固定层的保温隔热功能，可在一定时间内维持试剂瓶所需的温度环境；盒体、盒盖、缓冲层、固定层的材料均为普通的常用材料，总成本低。
附图说明
19.为了更清楚地说明本实用新型的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引申获得其它的实施附图。
20.本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本实用新型可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本实用新型所能
产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本实用新型所揭示的技术内容所能涵盖的范围内。
21.图1为本实用新型实施例1提供的一种胶质瘤患者原代肿瘤细胞及神经干细胞分离试剂盒的分布示意图；
22.图2为本实用新型实施例1提供的胶质瘤患者原代肿瘤细胞及神经干细胞分离试剂盒的大试剂盒或者小试剂盒的剖视图(其未剖切限位孔，其未放置试剂瓶)。
23.图中：1
‑
盒体，2
‑
盒盖，3
‑
卡扣，4
‑
缓冲层a，5
‑
固定层a，6
‑
缓冲层b，7
‑
固定层b，8
‑
限位孔，9
‑
试剂瓶。
具体实施方式
24.以下由特定的具体实施例说明本实用新型的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本实用新型的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本实用新型一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本实用新型中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本实用新型保护的范围。
25.本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本实用新型可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本实用新型可实施的范畴。
26.实施例1
27.如图1和2所示，实施例1提供了一种胶质瘤患者原代肿瘤细胞及神经干细胞分离试剂盒，其包括分体的大试剂盒和小试剂盒，大试剂盒和小试剂盒均包括盒体1以及与盒体1通过卡扣3连接的盒盖2，盒体1的底部设有缓冲层a4，在缓冲层a4的上部设有固定层a5，在盒盖2的顶部设有缓冲层b6，在缓冲层b6的下部设有固定层b7，固定层a5和固定层b7均设有多个限位孔8，大试剂盒的固定层b7的限位孔8与大试剂盒的固定层a5的限位孔8数量及位置相同，小试剂盒的固定层b7的限位孔8与小试剂盒的固定层a5的限位孔8数量及位置相同。其中，缓冲层和固定层采用泡沫材料制成。
28.大试剂盒的固定层a5设有14个限位孔8，限位孔8内分别对应放置有一个装有细胞洗涤液的试剂瓶9、一个装有原代细胞培养液的试剂瓶9、一个装有细胞分离缓冲液的试剂瓶9、一个装有红细胞裂解液的试剂瓶9、两个装有神经组织分解液的试剂瓶9以及八个装有继代细胞培养液的试剂瓶9。细胞洗涤液为d
‑
pbs，体积为900ml。原代细胞培养液为祌经干细胞的无血清生长培养基，体积为300ml，该培养基由200ml的基础培养基和2ml 100
×
antibiotic
‑
antimycotic混合组成。细胞分离缓冲液为1.8m蔗糖溶液，体积为250ml。红细胞裂解液50ml。神经组织分解液因成分间保存条件不同，放于分解液a
‑
e的试剂瓶9储存，在大试剂盒中的是分解液a和分解液e，分解液a为d
‑
pbs，体积为100ml，分解液e为1m hepes buffer，体积为1ml。继代细胞培养液成分较多，放于培养液a
‑
m的试剂瓶9储存，在大试剂盒中的是培养液a
‑
g和m，培养液a为neurobasal
tm
‑
a medium，培养液b为dmem/f
‑
12，培养液c为100
×
antibiotic
‑
antimycotic，培养液d为100
×
glutamax
‑
a，培养液e为sodium pyruvate solution，培养液f为100
×
mem non
‑
essential amino acids solution，培养液g为1m hepes buffer，培养液m为2mg/ml heparin solution，体积分别为50ml、5 0ml、1ml、1ml、
1ml、1ml、1ml、2ml、20μl、20μl、10μl、10μl、100μl。大试剂盒内的试剂需要在4℃的环境下储运。
29.小试剂盒的固定层a5设有8个限位孔8，限位孔8内分别对应放置有三个装有神经组织分解液的试剂瓶9以及五个装有继代细胞培养液的试剂瓶9。分解液b为5mg/ml dnase i，分解液c为2.5mg/ml collagense ii，分解液d为dispase ii，体积分别为1ml、1ml、500μl。培养液h为50
×
b27，培养液i为0.1mg/ml h
‑
egf，培养液g为0.1mg/ml h
‑
fgf1，培养液k为0.1mg/ml h
‑
pdgf
‑
aa，培养液l为0.1mg/ml h
‑
pdgf
‑
bb，体积分别为2ml、20μl、20μl、10μl、10μl。小试剂盒内的试剂需要在
‑
20℃的环境下储运。
30.限位孔8的大小和试剂瓶9的大小(容量、外尺寸)均是固定值，在试剂盒进行设计时则已经确定。其中，试剂瓶9的大小(容量)根据其盛装的试剂而定，相应的限位孔8按照试剂瓶9的大小(外尺寸)而定。
31.在本实施例中，将细胞洗涤液、原代细胞培养液、细胞分离缓冲液、红细胞裂解液、神经组织分解液以及继代细胞培养液分别装在试剂瓶9中，并根据各试剂的储运分别装在大试剂盒和小试剂盒中，将众多的试剂瓶9进行收纳在两个盒子中(大试剂盒和小试剂盒)，提高了携带的便捷性；例如将温度在4℃的试剂和试剂瓶9放置在大试剂盒内，将温度在
‑
20℃的试剂瓶9(内含试剂)放置在小试剂盒内，可轻松实现不同温度的储运，储运温度得以满足的同时，可提高成功率；底部的缓冲层还能起到防震的作用，固定层能避免试剂瓶9在盒体1内晃动，提高运输时的安全性及成功率；由于缓冲层和固定层的保温隔热功能，可在一定时间内维持试剂瓶9所需的温度环境。
32.缓冲层a4与盒体1胶黏固定，缓冲层b6与盒盖2胶黏固定，保证缓冲层与盒体1或盒盖2的有效固定。具体的，缓冲层a4的底侧面、周侧面均与盒体1内壁粘合，缓冲层b6的上侧面、周侧面均与盒盖2的内壁粘合。
33.固定层a5与盒体1、缓冲层a4胶黏固定，固定层b7与盒盖2、缓冲层b6胶黏固定，以便使固定层有效地被固定。具体的，固定层a5的下侧面与缓冲层a4的上侧面粘合，固定层a5的周侧面与盒体1内壁粘合；固定层b7的上侧面与缓冲层b6的下侧面粘合，固定层b7的周侧面与盒盖2内壁粘合。其中，固定层a5的上侧面相对盒体1的上边沿缩进，固定层b7的下侧面相对盒盖2的下边沿缩进，如此，试剂瓶9既能固定，又能露出一部分，便于拿取试剂瓶9。
34.试剂瓶9包括瓶身以及与瓶身旋合固定的瓶盖，例如通过螺纹连接，保证瓶身瓶盖的有效固定。瓶身贴有标签，标语辨识瓶内试剂种类。瓶盖内设有密封垫片，保证瓶身、瓶盖的密封，避免试剂溢出或渗出。
35.固定层a5的限位孔8与瓶身相适配，固定层b7的限位孔8与瓶盖相适配，以便有效地固定试剂瓶9，避免试剂瓶9在盒内晃动。
36.其中神经组织分解液(a
‑
e)和继代细胞培养液(a
‑
m)需要现用现配。配制及试剂盒使用方法如下：
37.1、试剂准备
38.1)神经组织分解液(现用现配，单次使用)
[0039][0040]
2)继代细胞培养液(现用现配，单次使用)
[0041][0042]
2、机械分离
[0043]
(1)将胶质瘤患者脑组织转移至100mm
×
20mm细胞培养皿中(以长宽高均为2cm的组织块为例，组织增大时试剂用量按比例增加)，加5ml预冷的原代细胞培养液；
[0044]
(2)清除明显的血管或脑膜后，用手术刀将组织切碎(<1mm)；
[0045]
(3)将组织转移到50ml离心管中，用原代细胞培养液冲洗培养皿，也转移到该离心管；
[0046]
(4)用10ml移液管轻轻吹打4～5次，300
×
g，4℃离心1min；
[0047]
(5)收集机械分离部分
[0048]
用100μm滤网将上清过滤至新的50ml离心管中，标为“机械分离”管，置冰上；滤网翻转置于原50ml离心管上，用原代细胞培养液将滤网上残留的组织碎块吹至离心管中，置于冰上。
[0049]
3、酶解
[0050]
(1)含有组织块的离心管：300
×
g，4℃离心5min，弃上清；
[0051]
(2)加入10ml预热的神经组织分解液溶液；
[0052]
(3)用石蜡膜密封离心管盖，37℃60rpm摇床上孵育30min；
[0053]
(4)孵育完成后，轻轻吹打3次。
[0054]
先用10ml移液管轻柔地上下吹吸6～8次，避免产生过多气泡；然后将1ml枪头(切掉枪尖)置于10ml移液管末端，再上下吹吸6～8次；将悬浮液用100μm滤网将上清过滤至一个新的50ml离心管中，标记为“酶解”管，置于冰上。
[0055]
4、密度梯度离心
[0056]
(1)将“机械分离”管与“酶解”管混合，300
×
g，4℃离心5min，弃上清；
[0057]
(2)用25ml预冷的细胞洗涤液重悬细胞；
[0058]
(3)缓慢加入25ml细胞分离缓冲液溶液，颠倒混匀；
[0059]
(4)800
×
g，4℃离心10min，弃上清；
[0060]
(5)加入30ml预冷的细胞洗涤液清洗细胞，300
×
g，4℃离心5min，弃上清；
[0061]
5、红细胞裂解
[0062]
(1)加入5ml红细胞裂解液，轻轻地重悬细胞，室温涡旋2min；
[0063]
(2)加入30ml预冷的细胞洗涤液，终止裂解，若裂解不充分可重复一次；
[0064]
(3)300
×
g，4℃离心5min，弃上清；
[0065]
(4)用5ml预热的继代细胞培养液重悬细胞，细胞计数，台盼蓝染色计算活率；
[0066]
(5)于10ml继代细胞培养液(约1
‑2×
106/ml的培养浓度)，100mm
×
20mm细胞培养皿，37℃5％co2培养箱中培养；
[0067]
(6)每隔一天观察细胞形态、计数并更换新的继代细胞培养液。
[0068]
所需仪器和耗材包括：100mm
×
20mm细胞培养皿、手术刀、50ml离心管、移液器、10ml移液管、100μm滤网、石蜡膜、枪头、离心机、流式细胞仪。
[0069]
试剂盒内：细胞分离缓冲液250ml，细胞洗涤液900ml，原代细胞培养液300ml，红细胞裂解液50ml，继代细胞培养液(培养液
‑
a 50ml，培养液
‑
b50ml，培养液
‑
c 1ml，培养液
‑
d 1ml，培养液
‑
e 1ml，培养液
‑
f 1ml，培养液
‑
g 1ml，培养液
‑
h 2ml，培养液
‑
i 20μl，培养液
‑
j 20μl，培养液
‑
k 10μl，培养液
‑
l 10μl，培养液
‑
m 100μl)，神经组织分解液(分解液
‑
a 100ml，分解液
‑
b 1ml，分解液
‑
c 1ml，分解液
‑
d 500μl，分解液
‑
e 1ml)。
[0070]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本实用新型作了详尽的描述，但在本实用新型基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本实用新型精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本实用新型要求保护的范围。