基于蜂巢芯片的高通量检测肠道原虫的试剂盒及检测方法与流程

技术特征：
1.一种基于蜂巢芯片的高通量检测肠道原虫的试剂盒，其特征在于，其采用微流控体系集成在一个蜂巢芯片上，用于检测隐孢子虫、贾第虫、微孢子虫和溶组织阿米巴，该试剂盒包括如下8组引物中的任意一组或任意多组组合：第1组，隐孢子虫的特异性引物（cry）：cry-f3: 5
′-
cttactccttcagcacctta-3
′
，seq id no.1；cry
ꢀ-
b3: 5
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caagaaagagctatcaatctgt-3
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，seq id no.2；cry
ꢀ-
fip: 5
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cgtcaattcctttaagtttcagcctgagaaatcaaagtctttgggtt-3
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，seq id no.3；cry
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bip:5
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cctgcggcttaatttgactcacaatccttcctatgtctggac-3
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，seq id no.4；cry
ꢀ-
lf: 5
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tgcgaccatactcccccca-3’，seq id no.5；cry
ꢀ-
lb: 5
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acacgggaaaactcaccag-3’，seq id no.6；第2组，人隐孢子虫的特异性引物（ch）：ch-f3: 5
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ggcaatcaggttgagtca-3
’ꢀ
，seq id no.7;ch-b3: 5
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cggtatagaaagcactatcgt-3
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，seq id no.8;ch-fip:5
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aggcaaacaaatcgacggttg-agatcaagaagatcactcaca-3
’ꢀ
，seq id no.9;ch-bip: 5
’-
acccttaatggtggtaagagaattgcaaccaaactgtacttgtctc-3
’ꢀ
，seq id no.10;第3组，微小隐孢子虫的特异性引物 (cp)：cp-f3: 5
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tcgcac cagcaa ata agg c-3
’ꢀ
，seq id no.11;cp-b3: 5
’-
gccgca ttc ttc ttt tggag-3
’ꢀ
，seq id no.12;cp-fip: 5
’-
accctggctaccagaagcttcagaactggagacgcagaa-3
’ꢀ
，seq id no.13;cp-bip:5
’-
ggccaaactagtgctgcttcccgtttcggtagttgcgcctt-3
’ꢀ
，seq id no.14；cp-lf: 5
’-
gtaccactagaatcttgactgcc-3
’ꢀ
，seq id no.15；cp-lb: 5
’-
aacccactactccagctcaaagt-3
’ꢀ
，seq id no.16；第4组，火鸡隐孢子虫的特异性引物（cm）：cm-f3：5
’-
cctttgaaaacgaatcaagttct-3
’ꢀ
，seq id no.17;cm
-ꢀ
b3：5
’-ꢀ
caattcttttaccaccttgga-3
’ꢀ
，seq id no.18;cm-fip：5
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gtcattttctgttggggaatttgaatacaataaaaatcaaggttgacg-3
’ꢀ
，seq id no.19 ;cm-bip: 5
’-
gtctgaggaaagcttgtctagatcagcacatcaacagttccag-3
’ꢀ
，seq id no.20；第5组，安氏隐孢子虫的特异性引物（ca）：ca-f3: 5
’-
cgtgcaaagagaacactttc-3
’ꢀ
，seq id no.21；ca-b3: 5
’-
cctactaatacaacatcatgtact-3
’ꢀ
，seq id no.22；ca-fip: 5
’-
tcctcaaatcttgcacgacttatwgattcatctacwcaagcaacaat-3
’ꢀ
，seq id no.23；ca-bip: 5
’-
gttctgattatttccgtggcacactcttatccattccagaatc-3
’ꢀ
，seq id no.24；ca-lf: 5
’-
caaagtagtcaataccttcgaac-3
’ꢀ
，seq id no.25；ca-lr: 5
’-
tagctccagtagagaaggtatt-3
’ꢀ
，seq id no.26；第6组，贾第虫的特异性引物（gd）：
gd-f3: 5
’-
tcgtcgagtggatcccg-3
’ꢀ
，seq id no.27；gd-b3: 5
’-ꢀ
ccatctcgtccatcccctc
ꢀ-3’ꢀ
，seq id no.28；gd-fip3: 5
’-ꢀ
gatgaaggtcgcggccatcttgaacaacatgaaggtcagcgt
ꢀ-3’ꢀ
，seq id no.29；gd-bip3: 5
’-ꢀ
gcatccaggagctcttcaagcgtgtaccagtggaggaaggc
ꢀ-3’ꢀ
，seq id no.30；第7组，阿米巴的特异性引物(e. histolytica) ：eh-f3: 5
’-ꢀ
gca cta tac ttgaac gga ttg
ꢀ-3’ꢀ
，seq id no.31；eh-b3: 5
’-ꢀ
gtt tga caa gat gttgag tga
ꢀ-3’ꢀ
，seq id no.32；eh-fip3: 5
’-
tcg ccc tat act caa ata tga caa gac ttt ggt ggaaga ttc acg
ꢀ-3’ꢀ
，seq id no.33；eh-bip3: 5
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atc tag tag ctg gttcca cct gaacac cta atc att atc ttt acc aat c
ꢀ-3’ꢀ
，seq id no.34；第8组，毕氏肠微孢子虫的特异性引物（enw）：enw-f3: 5
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tcggaatgtrtdgtaggtga
ꢀ-3’ꢀ
，seq id no.35；enw
ꢀ-
b3: 5
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cgacggatccaagtgatc
ꢀ-3’ꢀ
，seq id no.36；enw
ꢀ-
fip3: 5
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ttggtacgtgatggttggatgggcaacctccgattttcct
ꢀ-3’ꢀ
，seq id no.37；enw
ꢀ-
bip3: 5
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ggaaccacctctaactcactgctgtaggcgtgagagtgtat
ꢀ-3’ꢀ
，seq id no.38。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括lamp反应体系如下：双蒸水5.1μl100mmmgso
4 2μl10*thermo缓冲液2.5μl2.5mmdntp 1.4μl1.25mmcalcein 0.5μl25mmmncl
2 0.5μl5mbetaine 4μl8000u/ml bst1μl20μm权利要求1所述的8组引物中的任意一组或任意多组引物 3.5μl模板dna1μl。3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述引物冻干后固化到芯片上，制成蜂巢芯片；所述试剂盒还包括显色剂。4.一种基于蜂巢芯片的高通量检测肠道原虫的pcr检测方法，其特征在于，具体步骤包括如下:（1）不同虫株的dna提取，所述虫株包括如权利要求1所述的隐孢子虫、人隐孢子虫、微小隐孢子虫、火鸡隐孢子虫、安氏隐孢子虫、贾第虫、阿米巴、毕氏肠微孢子虫；（2）引物设计与筛选：所述设计的引物序列为权利要求1所述的引物序列；（3）质粒构建：采用基因合成作为模板，并构建质粒，作为验证；每个虫株具有各自的模
板；（4）建立单管lamp方法，对所设计的引物进行lamp检测，得到有效的扩增引物；（5）按照步骤（4）的lamp反应条件进行基因芯片扩增特异性验证；（6）按照建立的巢氏pcr方法对样本进行检测和可行性验证。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（3）具体为：根据ncbi的数据库进行每个虫株的序列下载，同一个虫株的不同分离株序列比对后，选择合适的区域进行模板合成；构建质粒，经测序与靶序列一致；一共8个模板质粒：（1）cry-403bp，核苷酸序列如seq id no.39所示；（2）ch-244bp，核苷酸序列如seq id no.40所示；（3）cp-221bp，核苷酸序列如seq id no.41所示；（4）cm-408bp，核苷酸序列如seq id no.42所示；（5）ca-230bp，核苷酸序列如seq id no.43所示；（6）gd-810bp，核苷酸序列如seq id no.44所示；(7) e.his-266bp，核苷酸序列如seq id no.45所示；（8）enw-310bp，核苷酸序列如seq id no.46所示。6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（4）和步骤（5）中，所述的lamp反应条件为：双蒸水 5.1μl100mm mgso4 2μl10* thermo缓冲液 2.5 μl2.5mm dntp 1.4μl1.25mm calcein 0.5μl25mm mncl2 0.5μl5m betaine 4μl8000 u/ml bst 1μl20μm 权利要求1所述的8组引物中的任意一组或任意多组引物 3.5μldna 1μl以上混合后，放置恒温加热仪60℃50分钟，然后观察荧光，或者电泳与荧光结果印证。7.用于检测隐孢子虫、贾第虫、微孢子虫和溶组织阿米巴的引物组，其特征在于，选自以下8组引物中的任意一组或任意多组组合：第1组，隐孢子虫的特异性引物（cry）：cry-f3: 5
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，seq id no.1；cry
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，seq id no.2；cry
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第2组，人隐孢子虫的特异性引物（ch）：ch-f3: 5
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，seq id no.7;ch-b3: 5
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，seq id no.38。8.如权利要求7所述的引物组在制备基于蜂巢芯片的高通量检测肠道原虫的试剂盒中的应用。9.一种肠道原虫分子生物核酸检测方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)将权利要求7所述任一组引物冻干后固化到芯片上，制成lamp微流控芯片；(2)选择合适的lamp反应体系，添加显色剂，加入芯片中；(3)反应结果通过肉眼或仪器判读。10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤（1）具体为：采用若干根毛细管组装至定制基座中进行固定形成lamp微流控芯片；然后，选择权利要求7所述任一组引物溶于引物固定液，分别吸取针对不同靶标的引物固定液，按照预先设计好的排列顺序加入到毛细管芯片上所对应的毛细管反应孔中；留出两根毛细管，其中一根固定阳性对照引物组，作为阳性对照孔，最后一根不固定引物组，作为阴性对照孔；将毛细管进行干燥处理，使引物固定于毛细管内壁。11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤（2）具体为: 将待检测样本、lamp反应试剂及显色剂加入微阵列芯片的反应孔中，63℃反应1小时。12.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤（3）中所述反应结果检测及数据分析具体为：lamp反应结束后，通过紫外荧光检测芯片上所有反应孔的显色情况，在阳性对照孔显色，而阴性对照孔不显色的情况下，判读所检测结果为“阳性”或“阴性”。

技术总结
本发明公开了一种基于蜂巢芯片的高通量检测肠道原虫的试剂盒和检测方法，其采用微流控体系集成在一个蜂巢芯片上，用于检测隐孢子虫、贾第虫、微孢子虫和溶组织阿米巴，该试剂盒包括如下8组引物中的任意一组或任意多组组合:隐孢子虫的特异性引物;人隐孢子虫的特异性引物;微小隐孢子虫的特异性引物;火鸡隐孢子虫的特异性引物;安氏隐孢子虫的特异性引物;贾第虫的特异性引物;阿米巴的特异性引物;毕氏肠微孢子虫的特异性引物。本发明解决了进行多次PCR检测的繁琐步骤，一次反应可以达到同时检测多个基因，明确病原体的作用，大大减轻了工作量，缩短了检测时间，降低了检测成本。降低了检测成本。降低了检测成本。


技术研发人员：姜岩岩 曹建平 沈玉娟 袁忠英
受保护的技术使用者：中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所（国家热带病研究中心）
技术研发日：2020.04.09
技术公布日：2021/10/18