一种高表达司美鲁肽前体重组工程菌及其构建方法与流程

1.本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种高表达司美鲁肽前体的重组工程菌及其构建方法。


背景技术：

2.随着社会经济的发展，人民生活水平逐步提高，人们的饮食结构发生了巨大变化，也导致肥胖发生率增加，并进一步导致糖尿病患者人数的急剧增加。据统计数据显示，我国糖尿病患者人数超过1亿，同时还有超过1.5亿的隐形糖尿病前期患者。糖尿病已经成为第三大慢性疾病。
3.糖尿病是由遗传和环境因素长期相互作用导致的复杂的慢性代谢性疾病，是由于胰岛素分泌缺乏导致，以高血糖为特征的疾病，分为i型糖尿病和ii型糖尿病，其中ii型糖尿病（t2dm）在我国糖尿病患者中占到了95%以上的比例。
4.近年来，胰高血糖素样肽
‑
1(glucagon
‑
likepeptide
‑
1，glp
‑
1)受体激动剂(glp
‑
1ras)逐渐成为治疗t2dm的研究热点。glp
‑
1通过葡萄糖依赖的方式促进胰岛素的合成和分泌，发挥降糖作用。其不仅具有优异的降糖效果，还有控制体重、调节血脂、改善胰岛β细胞功能等特点，其低血糖等的不良反应率也明显小于其他治疗糖尿病的药物。目前，市场上用于治疗糖尿病的glp
‑
1药物主要有艾塞那肽、阿必鲁肽、度拉糖肽、利拉鲁肽和司美鲁肽（又名索玛鲁肽，semaglutide）。
5.司美鲁肽(semaglutide)是由丹麦诺和诺德公司研制的一种新一代glp
‑
1类似物，是一种长效glp
‑
1制剂（周制剂）。司美鲁肽与人glp
‑
1同源性较高，其以天然人glp
‑
1（7
‑
37）分子为基础，通过替换第8位氨基酸（丙氨酸替换为α
‑
氨基丁酸）和第34位氨基酸（赖氨酸替换为精氨酸），同时在第26位赖氨酸通过间隔基连接c18脂肪二酸侧链得到。司美鲁肽通过上述结构调整，实现了可抵抗二肽基肽酶4降解，并与白蛋白结合而延长体内半衰期，实现一周给药一次的长效效果。目前，诺和诺德也已经推出了司美鲁肽的注射剂和口服制剂，并且，除了治疗糖尿病外，fda已批准司美鲁肽用于减肥适应症。
6.由于司美鲁肽主链末端有二肽his
‑
aib（aib为非天然氨基酸），因此，通常采用将司美鲁肽重组发酵表达其余29个氨基酸（简称司美鲁肽前体），再通过化学合成连接上述二肽his
‑
aib，并连接侧链进行制备。
7.目前，对司美鲁肽的研究主要集中在其结构与制剂中，对于具备高表达潜力的表达载体及其重组工程菌研究较少。专利cn201811634936.4公开了一种司美鲁肽前体的重组工程菌及其构建方法，但其包涵体表达量约为145g/l。
8.而制备得到具备高表达能力的重组工程菌及研发其高表达发酵方法，能够提高单位体积的司美鲁肽前体量，显著降低司美鲁肽原料成本，极大降低药物价格，对企业、对患者均有重大意义。本发明正是提供一种制备具有高表达司美鲁肽前体能力的重组工程菌及其构建方法，并探索其高密度发酵方法。


技术实现要素：

9.本发明的目的在于解决现有技术发酵表达量不高问题，提供一种新的稳定高表达司美鲁肽前体的重组工程菌及其构建方法，本发明的构建方法制备的工程菌尤其具备适用于高密度发酵的潜力。司美鲁肽由诺和诺德公司开发研制，通过基因重组技术制备，其结构如下所示：由于上述司美鲁肽结构中，其末端序列的二肽为his
‑
aib（aib为非天然氨基酸），其无法通过直接发酵表达得到，因此，通常采用构建表达司美鲁肽的除上述二肽外的多肽片段（司美鲁肽前体）的重组工程菌，在通过发酵获得所述司美鲁肽前体后与上述二肽合成得到完整司美鲁肽的肽序列，并通过在上述肽序列的第26位赖氨酸通过间隔基连接c18脂肪二酸侧链得到司美鲁肽原料。司美鲁肽完整肽序列结构为h
‑
aib
‑
egtftsdvssylegqaakefiawlvrgrg；而司美鲁肽前体序列即为不含二肽h
‑
aib
‑
的部分，其序列为egtftsdvssylegqaakefiawlvrgrg（seq id no.1）。
10.本发明选择以大肠杆菌为宿主菌构建重组工程菌，通过高密度发酵方法进一步得到包含司美鲁肽前体的包涵体；优选的宿主菌为大肠杆菌bl21(de3)。
11.为了实现本发明的目的，增加司美鲁肽前体在原核表达体系中包涵体的表达量，本技术发明人设计了一种前导肽
‑
肠激酶酶切位点
‑
司美鲁肽前体序列的氨基酸结构的融合多肽。其中，所述前导肽有两种，分别为前导肽a1，其氨基酸序列为fefkfefk（seq id no.2）；和前导肽a2，其氨基酸序列为fkfefkfe（seq id no.3）；所述肠激酶酶切位点氨基酸序列为ddddk（seq id no.4）。由此，本发明构建的两种融合多肽的氨基酸序列分别为fefkfefkddddkegtftsdvssylegqaakefiawlvrgrg（seq id no.5）和fkfefkfeddddkegtftsdvssylegqaakefiawlvrgrg（seq id no.6）。本发明的融合多肽可经肠激酶酶切后得到seq id no.1所示的司美鲁肽前体。
12.针对本发明设计的两种氨基酸结构，发明人为了得到适用于高密度发酵且稳定高表达目的蛋白包涵体的重组工程菌，优选设计得到了两组经过优化的上述融合多肽的编码基因片段，分别如seq id no.7和seq id no.8所示。其中，seq id no.7为上述seq id no.5所示融合多肽的优化编码基因序列，seq id no.8为上述seq id no.6所示融合多肽的优化编码基因序列。
13.因此，本发明提供了编码上述融合多肽的优化的编码基因片段，其核苷酸序列分别如seq id no.7和seq id no.8所示。
14.更进一步地，本发明提供一种包含上述优化的编码基因片段的载体，所述载体为将seq id no.7和seq id no.8所示插入载体相应酶切位点得到。优选地，所述载体为pet
‑
30a( )表达载体，通过在seq id no.7或seq id no.8的5’端添加ndei酶切位点，3’端添加终止密码子以及xhoi酶切位点后，分别通过酶切克隆到上述表达载体的ndei和xhoi酶切位点之间得到。
15.更进一步地，发明提供一种稳定高表达司美鲁肽前体的重组大肠杆菌，优选地，所述重组大肠杆菌为将上述包含优化的编码基因片段的载体转化至大肠杆菌bl21(de3)获得。
16.另一方面，本发明提供一种稳定高表达司美鲁肽前体的重组工程菌的构建方法，包括如下步骤：（1）合成如seq id no.7或seq id no.8所示的融合多肽编码基因；（2）将上述编码基连接至表达载体中，构建得到重组表达载体；（3）将构建的重组表达载体转化至大肠杆菌中，得到所述重组工程菌。
17.优选地，步骤（2）具体方法为：将上述编码基因序列的5’端添加ndei酶切位点，3’端添加终止密码子以及xhoi酶切位点，然后通过酶切克隆到表达载体pet
‑
30a( )的ndei和xhoi酶切位点之间，从而构建得到重组表达载体pet
‑
30a( )
‑
a1
‑ꢀ
glp
‑
1或pet
‑
30a( )
‑
a2
‑ꢀ
glp
‑
1。
18.进一步优选地，步骤（3）的具体方法为：将重组表达载体pet
‑
30a( )
‑
a1
‑ꢀ
glp
‑
1或pet
‑
30a( )
‑
a2
‑ꢀ
glp
‑
1通过热击法转化导入到大肠杆菌表达宿主bl21(de3)中，筛选得到所述重组工程菌。
19.此外，本发明还提供一种司美鲁肽前体的发酵方法，所述方法包括如下步骤：（1）重组工程菌复苏：取保存的本发明上述方法制备的重组工程菌，接种到培养基中过夜培养，得复苏菌液；（2）诱导表达：将步骤（1）中培养的复苏菌液接种至发酵培养基中，诱导表达;（3）菌体收集，超声破碎后菌体，并洗涤后得到包含司美鲁肽前体的包涵体。
20.优选地，上述发酵方法的步骤（1）具体为：将保存的所述重组工程菌接入到灭菌后lb培养基中，于37℃、200rpm的条件下过夜培养；进一步优选地，所述步骤（2）具体为：取步骤（1）中的复苏菌液接入到灭菌后lb培养基中，于37℃、220rpm的条件下培养至od
600
=0.6
‑
0.8时，加入iptg诱导，并于37℃、220rpm条件下进行过夜培养。
21.本发明利用大肠杆菌原核表达系统，设计包含司美鲁肽前体的融合蛋白结构，并将其插入表达载体中，以融合蛋白包涵体形式表达，从而实现司美鲁肽前体的稳定高表达；且本发明的重组工程菌尤其适于高密度发酵，具有较高的产业应用价值和前景。
附图说明
22.图1为a1
‑ꢀ
glp
‑
1系列重组工程菌sds
‑
page电泳图：其中，泳道1
‑
2和4
‑
9分别对应重组菌株a1
‑
glp
‑1‑
1至a1
‑
glp
‑1‑
8，泳道3为marker，泳道10为对应重组菌株a1
‑
glp
‑1‑
1菌株未诱导取样；图2为a2
‑ꢀ
glp
‑
1系列重组工程菌sds
‑
page电泳图：其中，泳道2
‑
9分别对应重组菌
株a2
‑
glp
‑1‑
1至a2
‑
glp
‑1‑
8，泳道1为marker，泳道10为对应重组菌株a2
‑
glp
‑1‑
1菌株未诱导取样；图3为hplc表达量检测结果图；图4为重组工程菌a2
‑ꢀ
glp
‑1‑
5的高密度发酵法生长曲线图。
具体实施方式
23.以下实施例结合附图，用于进一步理解本发明，但不应被视为对本发明的限制。
24.实施例1：稳定高表达司美鲁肽前体的重组大肠杆菌工程菌的构建（1）分别合成如seq id no.7和seq id no.8所示的融合多肽编码基因，并分别在其序列的5’端添加ndei酶切位点，3’端添加终止密码子以及xhoi酶切位点；（2）将步骤（1）制备得到的基因片段分别通过酶切克隆到表达载体pet
‑
30a( )的ndei和xhoi酶切位点之间，从而构建得到2种重组表达载体pet
‑
30a( )
‑
a1
‑ꢀ
glp
‑
1和pet
‑
30a( )
‑
a2
‑ꢀ
glp
‑
1；（3）将步骤（2）得到的重组表达载体分别通过热击法转化导入到大肠杆菌bl21(de3)中，经过抗性筛选单克隆，两种重组工程菌分别挑选8个克隆，分别命名为a1
‑
glp
‑1‑
1至a1
‑
glp
‑1‑
8和a2
‑
glp
‑1‑
1至a2
‑
glp
‑1‑
8，置于甘油中保存。
25.经测序，本实施例中得到的基因工程菌中的序列与所设计的序列一致。
26.实施例2：稳定高表达司美鲁肽前体的重组大肠杆菌工程菌的发酵（1）重组工程菌复苏取实施例1中保存的16株甘油菌各一支，分别按照千分之一接种量接入到16瓶装有20 ml灭菌后lb培养基的三角瓶中，于37℃、200rpm的条件下过夜培养，得复苏菌液。
27.（2）重组工程菌的诱导表达取步骤（1）中复苏菌液分别按照百分之一接种量接入到16瓶装有50 ml灭菌后lb培养基的三角瓶中，于37℃、220rpm的条件下培养至od
600
值至0.6
‑
0.8时，加入终浓度为0.5 mm的iptg，并于37℃、220rpm条件下进行过夜诱导表达。
28.（3）菌体收集及hplc表达量检测收集培养菌液并于8000rpm、4℃条件下离心30min，弃上清收获菌体；菌体经超声破碎后获得包涵体，包涵体经洗涤、溶解后通过hplc进行表达量检测（结果见图3），同时菌体留样进行sds
‑
page检测蛋白的表达情况（所有泳道均在相同实验条件下进行，结果见图1和图2）。
29.使用前导肽a1所构建得到的a1
‑ꢀ
glp
‑
1系列重组工程菌获得的8个不同的单克隆的sds
‑
page检测结果见图1，使用前导肽a2所构建得到的a2
‑ꢀ
glp
‑
1系列重组工程菌获得的8个不同的单克隆sds
‑
page检测结果见图2。由图1和图2的电泳图可知，本发明构建的重组工程菌均能高效表达目的蛋白包涵体。同时，从电泳图中可以得出，使用前导肽a2所构建得到的系列重组工程菌整体表达量上更高于使用前导肽a1。
30.hplc表达量检测结果见图3，从结果图中可以看出，本发明方法制备的重组工程菌，均具备较高包涵体表达量。同时，相比于前导肽a1，前导肽a2显著提高了包含司美鲁肽前体的融合蛋白的表达量，该结果与sds
‑
page结果相符。具体的，从图3的结果中可以看出，使用前导肽a1构建的重组工程菌，其目的蛋白包涵体的表达量平均在8mg/g左右，最高
9.76mg/g；而使用前导肽a2构建的重组工程菌，不仅所有菌株表达量均在11mg/g以上，更是一半以上超过14mg/g，最高达到20.67mg/g；相比于使用前导肽a1的重组工程菌，其表达量近乎翻倍。
31.实施例3：稳定高表达司美鲁肽前体的重组大肠杆菌工程菌的高密度发酵取实施例1中构建的16株重组工程菌分别进行二级菌种活化后，进行高密度发酵，发酵过程中，在补料开始后，每2h取样测od
600
值，并绘制生长曲线；发酵结束后，进行离心收集菌体。
32.根据发酵结果可知，a1
‑ꢀ
glp
‑
1系列重组工程菌和a2
‑ꢀ
glp
‑
1系列重组工程菌，均能发酵至高od
600
值，尤其a2
‑ꢀ
glp
‑
1系列重组工程菌，均能达到od
600
值240以上，包涵体菌体生物量达到300g/l以上。以a2
‑ꢀ
glp
‑1‑
5为例，其发酵od
600
值可以到259，包涵体菌体生物量达到320g/l，其生长曲线图参见图4。并且，可以预期，本技术的重组工程菌经过进一步发酵的调整优化，其能够取得更高表达量。