转基因阮蛋白羊品系特异性数字PCR检测试剂盒及检测方法与流程

转基因阮蛋白羊品系特异性数字pcr检测试剂盒及检测方法
技术领域
1.本发明属于生物学领域，涉及转基因生物检测领域，具体涉及数字pcr检测转基因阮蛋白羊品系特异性的引物，探针和方法，尤其涉及一种转基因阮蛋白羊品系特异性微滴式数字pcr检测试剂盒及其检测方法。


背景技术：

2.瘙痒症是山羊和绵羊的一种传染性海绵状脑病，是一种缓慢发展的致死性中枢神经系统疾病，以运动失调，麻痹，衰弱和严重的皮肤瘙痒为主要临床症状，病畜死亡率达100％.只能预防，具有传染性与不可治愈性。同时，阮病毒还能导致人畜共患病，寄存在人的脑组织，损害人的中枢神经系统。瘙痒症的病原是一种哺乳动物宿主细胞朊蛋白prpc(cellularform of prion protein)发生构象改变后的异构体，暨朊毒体prpsc(scrapie
‑
isoformprion protein).通过敲除动物内源性的朊蛋白可抵抗朊病毒的感染，使动物具有抗病性，对公共卫生和农业产业经济都有重要的意义。因此，一些阮蛋白基因敲除的羊被研发出来。转基因动物日益增多的同时，相应安全性问题引发国际社会及相关监管部门的重视。
3.我国政府高度重视转基因生物安全的管理，已经颁布了《农业转基因生物安全管理条例》等系列法规，约束和限制转基因产品的检测和标识。为了有效实现对这些转基因阮蛋白羊品系的监管，本发明针对转基因阮蛋白基因敲除羊的品系特异性序列并对引物、探针及扩增体系进行优化，建立了基于转基因阮蛋白羊品系特异性的微滴数字pcr(droplet digital pcr)检测试剂盒及其检测方法。
4.微滴数字pcr技术的原理是将样本dna无限稀释到上千或者上万份，被分配到不同的单元里，每个单元最多含有1个dna分子，形成油包水液滴。每个反应单元经过独立pcr扩增，反应结束后统计每个单元的荧光信号，根据泊松分布和阳性微滴比例来实现核酸分子的绝对定量，计算原始样本中靶基因的拷贝数。数字pcr技术相比较于传统的荧光定量pcr技术和常规pcr方法相比，存在明显的优势：绝对定量，不依赖标准曲线和ct值的；有效避免了人为错误，结果稳定；样本需求量低，可检测低浓度样本；灵敏度高，可检测出低拷贝痕量样本以及精确分析极小目的片段差异；高度耐受抑制剂；和抗干扰能力；能够降低反应体系中的噪音和抑制物对反应的干扰，避免样本复杂性导致的pcr假阴性，尤其适用于检测复杂的粪便样本和其他检测基质复杂的环境样本等。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种基于微滴数字pcr技术的能够快速准确检测转基因阮蛋白羊品系特异性(微滴式)数字pcr检测试剂盒及其检测方法。
6.本发明的另一目的是提供了一种有效的针对转基因阮蛋白羊品系特异性检测中科学研究或国家监管方法的应用。
7.本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
8.第一方面，本发明涉及一种用于转基因阮蛋白羊品系特异性检测的引物对和探针组合，所述引物对的序列如下：
9.上游引物q
‑
gm
‑
prion
‑5‑
f：tgctgacaccctctttattttgc(seq id n0.：1)；
10.下游引物q
‑
gm
‑
prion
‑5‑
r：gattgtctgttgtgcccagtc(seq id n0.：2)；
11.所述探针的序列如下：
12.探针q
‑
gm
‑
prion
‑5‑
p：tagccgaatagcctctccacccaagcg(seq id no.：3)。
13.作为一个实施方案，所述探针的5’端包含有荧光报告基团，3’端包含有荧光淬灭基团。优选为：fam
‑
tagccgaatagcctctccacccaagcg
‑
bq2。
14.第二方面，本发明涉及一种转基因阮蛋白羊品系特异性微滴式数字pcr检测试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1所述的引物对和探针组合。
15.作为一个实施方案，所述试剂盒还包括dna提取试剂、数字pcr预混液、微滴生成卡、微滴发生油、微滴读取油和96孔反应板。
16.第三方面，本发明涉及一种转基因阮蛋白羊品系特异性微滴式数字pcr检测方法，所述方法包括如下步骤：
17.a.受检样本的前处理及dna的提取；
18.b.针对特异性序列设计并合成数字pcr引物对和探针；
19.c.提供待测样本dna，制备反应体系并进行数字pcr检测；所述反应体系包括步骤b中的pcr引物和探针以及待测样本dna。
20.作为一个实施方案，步骤b中，设计的数字pcr引物对的上下游引物的长度为15
‑
30个碱基，较佳地为20
‑
28个碱基。
21.作为一个实施方案，步骤b中，设计的探针的5’端包含有荧光报告基团，3’端包含有荧光淬灭基团。
22.作为一个实施方案，步骤c之前还包括优化数字pcr扩增体系的步骤。优化的数字pcr扩增产物80
‑
180bp，较佳地为90
‑
110bp。
23.作为一个实施方案，步骤b中，所述数字pcr引物对的序列如下：
24.上游引物q
‑
gm
‑
prion
‑5‑
f：tgctgacaccctctttattttgc(seq id n0.：1)；
25.下游引物q
‑
gm
‑
prion
‑5‑
r：gattgtctgttgtgcccagtc(seq id no.：2)；
26.所述探针的序列如下：
27.探针q
‑
gm
‑
prion
‑5‑
p：tagccgaatagcctctccacccaagcg(seq id no.：3)。
28.作为一个实施方案，步骤c中，所述反应体系为10ul ddpcr预混液，lul上游引物q
‑
gm
‑
prion
‑5‑
f，lul下游引物q
‑
gm
‑
prion
‑5‑
r，0.5ul探针q
‑
gm
‑
prion
‑5‑
p，5.5ul h2o，2ul dna，共20ul体系。
29.作为一个实施方案，步骤c中，将待测样品dna稀释后加入反应体系中，通过微滴生成器生成油包水微滴，将所有微滴经常规pcr进行扩增，扩增结束后通过微滴分析仪识别所有微滴的荧光信号并给出计数结果。
30.作为一个实施方案，待测样品dna稀释液的浓度为10
‑
20ng/μl；数字pcr有效微滴数＞8000。
31.作为一个实施方案，步骤c中，pcr扩增程序为：步骤1：95℃5min；步骤2：95℃30sec，58℃1min，转到步骤2，39个循环；98℃10min；4℃1min。
32.作为一个实施方案，步骤c中，待测样本可来自血液样本、细胞样本、组织样本；粪便，土壤等环境样本。
33.作为一个实施方案，步骤c中，实验所用仪器和耗材为伯乐公司微滴数字pcr配套耗材。
34.作为一个实施方案，品系特异性序列来自山羊阮蛋白基因序列和外源基因载体序列。
35.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
36.1.本发明相比传统的qpcr技术具有灵敏度显著提升，特异性强，精确度好，以及不依赖标准曲线，可以对样本进行绝对定量，缩小假阴性的优势，特别在对低拷贝数和痕量样本具有重要意义；
37.2.本发明中所述的引物设计为特异性引物，来自转基因阮蛋白基因敲除羊品系特异性序列，即旁侧序列，根据阮蛋白基因敲除基因序列特点及其引入序列旁侧位点设计。其中上游引物和探针位于山羊阮蛋白基因序列，下游引物位于外源基因载体序列上。
38.3.本发明中引物的确定是依照引物设计原则，通过分析选出5对引物，逐个验证后选取最优引物序列。
39.4.本发明在引物浓度，探针浓度，反应温度进行了优化，目前是最优的方法。
40.5.本发明首次提出了对转基因阮蛋白基因羊品系特异性的检测，能够对转基因阮蛋白敲除羊进行市场监管。
41.6.本方法对于转基因羊的常规监管和检测提供技术依据，对于科研单位和高校的转基因羊研究同样适用，有广泛的潜在应用前景。
附图说明
42.通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
43.图1为转基因阮蛋白羊品系特异性微滴数字pcr一维扩增图；
44.图2为转基因阮蛋白羊扩增结果图；
45.图3为转基因乳清蛋白羊扩增结果图；
46.图4为非转基因羊扩增结果图；
47.图5为溶菌酶羊扩增结果图；
48.图6为转基因乳铁蛋白羊扩增结果图；
49.图7为阴性对照扩增结果图；
50.图8为灵敏度分析结果图；
51.图9为转基因阮蛋白羊293扩增结果图；
52.图10为转基因阮蛋白羊323扩增结果图；
53.图11为环境土壤中转基因阮蛋白羊转化体检测扩增结果图；
54.图12为环境土壤中转基因阮蛋白羊转化体检测扩增结果图。
具体实施方式
55.下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术
人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。下列实施例中，具体实验条件按照本领域内参考文献或者试剂盒使用说明书进行，所用仪器和耗材，若无特别说明生产厂家者，可根据自身实验室条件按市售渠道获得。
56.本发明通过将转基因阮蛋白羊的特异性旁侧序列进行比对和分析，经过大量引物的筛选和实验样本的验证，得到了阮蛋白羊的品系特异性引物和探针。具体地，本发明利用了阮蛋白的外源基因序列和品系特异性序列，利用微滴数字pcr的方法，鉴定转基因阮蛋白羊的品系特异性。
57.实施例1、转基因阮蛋白羊品系特异性检测
58.实验试剂和仪器：
59.仪器：qx200 droplet digital pcr(bｉo
‑
rad)系统：qx200微滴生成仪，qx200微滴分析仪，pcr仪；96孔板热封仪，涡旋震荡仪，
60.耗材：数字pcr预混液，微滴生成卡，皮套，微滴发生油，微滴读取油，96孔反应板，封口膜均购自bio
‑
rad。1.引物设计与合成。
61.特异性引物为转基因阮蛋白敲除羊的品系特异性序列，即旁侧序列，根据阮蛋白基因和外源基因的整合位点设计。设计软件为beacon designer 8。针对转基因阮蛋白基因羊品系特异性检测要求，根据该转基因阮蛋白羊基因以及插入片段的序列侧翼序列信息查找合适的引物设计位点。综合考虑核苷酸序列gc含量和引物tm值，在阮蛋白基因序列上设计了上游引物5条(分别命名为q
‑
gm
‑
prion
‑5‑
f1
‑
q
‑
gm
‑
prion
‑5‑
f5)(表1)；在外源基因序列上设计下游引物5条，(分别命名为q
‑
gm
‑
prion
‑5‑
r1
‑
q
‑
gm
‑
prion
‑5‑
r5)(表1)，探针序列5条(分别命名为q
‑
gm
‑
prion
‑5‑
p1
‑
q
‑
gm
‑
prion
‑5‑
p5)(表1)。合成以下引物和探针，并稀释到工作浓度10ng/ul。所设计引物经定性pcr初步筛选，选择目标产物片段在80bp至135bp，目标条带单一引物。引物工作后，再合成探针，经定量pcr逐一验证引物和探针组合是否工作。经优化获得最佳的引物探针组合。
62.表1.转基因溶菌酶羊引物和探针序列
63.[0064][0065]
2.dna提取。
[0066]
取自上海转基因研究中心，上海杰隆生物工程股份有限公司非转基因羊，转基因阮蛋白羊，转基因乳清蛋白羊，转基因阮病毒敲除羊，转基因乳铁蛋白羊转基因溶菌酶羊血液，各200ul，按“血液/细胞/组织基因组dna提取试剂盒”说明书提取dna并稀释到20ng/ul。
[0067]
3.定性pcr反应，筛选引物工作效率。
[0068]
以转基因阮蛋白敲除羊，非转基因羊的dna为模板，应用常规pcr反应体系和条件，(94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，30 cycles；72℃延伸7min；4℃1min)进行引物的验证。结果表明，gm
‑
prion
‑5‑
f1和gm
‑
prion
‑5‑
r1引物扩增产物条带单一。其他引物的扩增出现多条扩增条带，特异性不好，位置不对，或者引物二聚体过多等原因，无法使用。
[0069]
4.数字pcr反应，转化体特异性测试。
[0070]
4.1优化反应条件和反应程序。
[0071]
以非转基因羊，转基因溶菌酶羊，转基因乳清蛋白羊，转基因阮蛋白敲除羊，转基因乳铁蛋白羊血液为dna模板，选择引物退火温度和引物浓度作为两个关键参数进行正交实验，得到结果后再进行引物和探针比的优化。分别配置引物浓度为10ng/ul，50ng/ul，100ng/ul，的引物(gm
‑
prion
‑5‑
f1/r1)和探针(fam
‑
gm
‑
prion
‑5‑
p1
‑
bq1)；设置56℃、57℃、58℃和59℃4个退火温度；引物探针比分别配置为：1∶1，1∶0.2，1∶0.4，1∶0.5，1∶0.6，1∶0.8，6个梯度进行体系优化；10ul ddpcr supermix(ddpcr预混液)2ul dna，h2o补齐共20ul体系，离心30秒，将加样过程中黏贴在离心管外壁上的液滴流下，再低速涡旋震荡混匀30秒，再离心30秒。每个反应条件做3次重复，每次做4个平行样品。
[0072]
4.2.生成微滴。将配置好的体系用20ul量程的移液器缓慢加入微滴生成卡中sample位置，不可有气泡；再利用多道移液器将微滴发生油70ul/每孔加入到微滴生成卡中oil位置，其中，二者加样顺序不可颠倒。盖上胶皮带，将微滴生成卡放入微滴发生器内，生成油包水微滴。每个微滴生成卡可同时产生8x20000个油包水微滴，即同时可检测8个样本，样本剩余的孔需要用平衡液补齐。
[0073]
本次实验样本除非转基因羊，转基因溶菌酶羊，转基因乳清蛋白羊，转基因阮蛋白敲除羊，转基因乳铁蛋白羊血液的dna外，阴性对照为超纯水。
[0074]
4.3.微滴pcr扩增。用多通道移液器缓慢转移微滴至96孔反应板中，热封膜密封。放入微滴pcr仪进行2小时左右的微滴pcr。优化反应条件为：步骤1：95℃5min；步骤2：95℃30sec，56℃～591min，go to step 2，39个循环。98℃10min；4℃1min。
[0075]
4.4.微滴信号检测。取出96孔反应板，放置到微滴分析仪中，微滴将逐个分析每个样品孔内的液滴。微滴被吸入以后，管路将分解乳化后的微滴，使他们逐一通过双色光学检测系统。系统将计算阴性和阳性微滴的个数。以数字的格式对靶dna进行绝对定量的分析。
[0076]
4.5.分析检测结果。根据阳性和阴性微滴的数目直观读取每个样品的扩增结果。
[0077]
4.6.结果分析。
[0078]
在结果判定的过程中，如果仅有阳性微滴没有阴性微滴，考虑样本为浓度过高，稀释样本到合适浓度重复实验即可。如果仅有阴性微滴没有阳性微滴，判定样本中不含有阮蛋白基因敲除转化体。
[0079]
本次结果显示，引物探针组合gm
‑
prion
‑5‑
f1/r1，fam
‑
gm
‑
prion
‑5‑
p
‑
bq1在不同的引物浓度和退火温度处理中均表现出非常好的扩增特异性。且引物浓度为10ng/ul，引物探针比为1：0.5时，不同的退火温度时均表现一致的扩增效率，且扩增条带清晰，单一。根据引物特异性扩增结果稳定性和检测需要，反应体系中的引物终浓度确定为10ng/ul，反应程序中的退火温度设定为58℃。
[0080]
本次实验结果图1(图1为转基因阮蛋白羊品系特异性微滴数字pcr一维扩增图)显示，用引物q
‑
gm
‑
prion
‑5‑
f1/r1和探针fam
‑
q
‑
gm
‑
prion
‑5‑
p1
‑
bq1在扩增时，仅转基因阮蛋白敲除羊有阳性微滴生成，且反应孔的阳性微滴信号和阴性微滴信号区分明显。图2为转基因阮蛋白羊样品发生了阳性扩增出现了阳性微滴。图3
‑
7显示非转基因羊，转基因乳清蛋白羊，转基因溶菌酶羊，转基因乳铁蛋白羊样本，阴性对照，均仅有阴性微滴无阳性微滴生成。说明该方法经过引物的筛选后得到一对能够用于转基因阮蛋白敲除羊检测的特异性引物。且使用该方法，采用3家单位进行协同验证，经过平行实验验证，结果一样。说明该引物特异性良好，本发明结果稳定。
[0081]
实施例2：转基因阮蛋白羊品系灵敏度检测
[0082]
1.血液dna样本提取，引物合成，仪器耗材选用均参照实施例1。
[0083]
2.将转基因阮蛋白羊的血液梯度稀释：20000，2000，200，100，50，25，10，5copy/ul
[0084]
3.体系配置，微滴生成，pcr程序设置，微滴读取，参考实施例1。
[0085]
4.结果见表2，图8，可知本方法的lod和loq均为50copy/ul。说明本方法的灵敏度为50copy/ul。使用该方法，采用3家单位进行协同验证，经过平行实验验证，结果一样。说明该发明灵敏度良好，实验结果稳定。
[0086]
表2转基因阮蛋白羊品系灵敏度分析
[0087][0088]
实施例3：转基因阮蛋白羊品系实际样品验证
[0089]
1.选取已知转基因阮蛋白羊的血液样本：293，323。提取dna方法，引物合成，仪器耗材选用均参照实施例1。
[0090]
2.将已知转基因阮蛋白羊不同代系的血液梯度稀释到20
c
opy/ul。
[0091]
3.体系配置，微滴生成，pcr程序设置，微滴读取，参考实施例1。
[0092]
4.结果见图9
‑
10，分别为293，323的转基因阮蛋白羊扩增结果图，两个实际样本均发生了阳性扩增，且阴性微滴和阳性微滴信号区分明显。验证了该引物的品系特异性。使用该方法，采用3家单位进行协同验证，经过平行实验验证，结果一样。说明该发明经过实际样品检测，效果良好，实验结果稳定。
[0093]
实施例4：转基因阮蛋白羊品系环境样本检测
[0094]
1.选取环境样本：转基因阮蛋白羊的粪便p1
‑
p5。dna提取采用qigen土壤dna提取试剂盒；引物合成，仪器耗材选用均参照实施例1。
[0095]
2.体系配置，微滴生成，pcr程序设置，微滴读取，参考实施例1。
[0096]
3.结果显示见图11
‑
12：在转基因阮蛋白羊的粪便中检测到极其微量的阮蛋白成分1.1/20ul，表明该方法非常可靠，并适用于痕量样本中转基因阮蛋白敲除羊的检测。
[0097]
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本技术的实施例和实施例中的特征可以任意相互细合。