一种罗非鱼皮肽及其制备方法和其改善卵巢早衰的应用与流程

1.本发明涉及多肽提取技术领域，特别是涉及一种罗非鱼皮肽及其制备方法和其改善卵巢早衰的应用。


背景技术：

2.卵巢早衰(premature ovarian failure，pof)，也称为卵巢功能不全或过早绝经，是女性性腺功能减退的一种常见形式，在临床上定义为女性在40岁之前停止月经至少4个月以上，并且血清卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，fsh)水平大于40iu/l，雌二醇(estradiol，e2)低于50pg/ml，近年来，pof发病率逐年升高，在30岁之前女性中约0.1％，在40岁之前女性中达到了1～3％左右。卵巢早衰会导致不孕不育及一系列骨骼、心血管健康、情绪困扰等相关的并发症。卵巢早衰的病因包括遗传、自身免疫、医源性疾病等因素。卵巢早衰目前缺乏有效的治疗方法，其传统疗法主要为激素替代疗法(hormone replacement therapy，hrt)，但是长期服用激素，会增加女性患者子宫内膜癌、乳腺癌等癌变的发病率，并且激素替代疗法只是单纯的补充雌激素，不能真正地恢复卵巢的内分泌功能，存在停药后易复发、副作用大、效果差的缺点。
3.罗非鱼(oreochromis mossambicus)又称非洲鲫鱼、南洋鲫，它是世界水产业的重点科研培养的淡水养殖鱼类，且被誉为未来动物性蛋白质的主要来源之一。罗非鱼加工主要以生产鲜鱼片和冻鱼片等粗加工方式为主，罗非鱼被经过各级的加工，产生约40～50％的废物，包括鱼鳞、鱼皮、鱼骨、内脏和其他副产品，这些副产品中蕴含着丰富的蛋白质、氨基酸以及其他活性物质，受到了研究人员的广泛关注。遗憾的是这些副产物仅有少量被食用，大量的副产物被加工成低值饲料或者以废弃物形式丢掉，造成了资源浪费，对环境造成污染。鱼皮在医药、保健、食品等方面均有很大的开发前景。由罗非鱼皮制成的多肽易于人体吸收，而且具有抗氧化、抗衰老、抗疲劳、改善记忆力等多种活性功能。迄今为止，国内外尚没有报道罗非鱼皮肽对卵巢早衰是否有防治作用。


技术实现要素：

4.针对目前罗非鱼加工过程中大量副产物得不到高值化利用，造成严重经济损失的现状，本发明的目的在于提供一种罗非鱼皮肽及其制备方法和其改善卵巢早衰的应用。
5.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
6.本发明提供一种罗非鱼皮肽的制备方法，包括以下步骤：
7.(1)将经过预处理的罗非鱼皮，进行脱脂、干燥处理；
8.(2)干燥后的罗非鱼皮使用蛋白酶进行酶解；
9.(3)酶解液灭活后，离心、超滤、浓缩、冷冻干燥后，得到罗非鱼皮肽。
10.进一步地，在步骤(1)中，所述预处理包括冲洗干净和剪片；所述脱脂为使用异丙醇进行2次脱脂，其中，第一次脱脂温度为25～45℃，时间1～3h，第二次脱脂温度为40～60℃，时间1～3h；所述罗非鱼皮与异丙醇的质量体积比为1:1～8。
11.进一步地，在步骤(1)中，所述干燥的温度为30～70℃，时间为8～24h。
12.进一步地，在步骤(2)中，所述干燥后的罗非鱼皮按照质量体积比1:1～8加入水后，进行酶解；所述蛋白酶的添加量为罗非鱼皮质量的1～5％，酶活力≥1
×
104u/g。
13.进一步地，在步骤(2)中，所述蛋白酶包括中性蛋白酶、碱性蛋白酶、复合蛋白酶、风味蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶中的一种或多种。
14.进一步地，在步骤(2)中，所述酶解分两步进行，其中，先在ph6.5～8.0下采用中性蛋白酶酶解，温度为45～65℃，时间为1～4h，所述中性蛋白酶的酶活力≥1
×
104u/g，再调节ph至8.0～10.0，采用碱性蛋白酶酶解，温度为45～65℃，时间为1～4h，所述碱性蛋白酶的酶活力≥1.5
×
105u/g。
15.进一步地，在步骤(3)中，所述离心、超滤、浓缩、冷冻干燥具体包括：20～30℃下，10000～15000rpm离心10～30min，离心上清液过10kda超滤膜，超滤液于45～65℃下旋转蒸发浓缩后，于
‑
30～
‑
60℃、0.1～0.5mbar下冷冻干燥。
16.本发明还提供一种上述的罗非鱼皮肽的制备方法制备得到的罗非鱼皮肽，所述罗非鱼皮肽的分子量低于6kda。
17.本发明还提供一种上述的罗非鱼皮肽在制备改善卵巢早衰的药品和保健品中的用途。
18.进一步地，所述药品或保健品的剂型包括片剂、冲剂、丸剂、乳剂、颗粒剂或胶囊。
19.本发明公开了以下技术效果：
20.本发明的罗非鱼皮肽的制备方法中，将罗非鱼皮使用异丙醇进行脱脂，使用复合酶解的方式对罗非鱼皮进行酶解，提高了酶解效率，使用10kda超滤膜去除大分子物质，冷冻干燥得到的罗非鱼皮多肽经过hplc检测，经此方法制备的罗非鱼皮肽分子量大多为6kda以下的小分子量多肽，易于人体吸收，具有较好的生物活性，鱼皮利用率高，提高了鱼皮的附加值。
21.本发明的制备方法得到的罗非鱼皮肽的分子量在6kda以下，对卵巢早衰具有明显的改善作用。
附图说明
22.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
23.图1为混合标准品凝胶色谱图；
24.图2为罗非鱼皮肽凝胶色谱图；
25.图3为小鼠体重变化趋势图
26.图4为罗非鱼皮肽对小鼠卵巢指数的影响图其中，与空白组相比，*p＜0.05，与模型组相比，##p＜0.01；
27.图5为小鼠动情周期变化图其中，a.不同时期的时间统计，b.不同时间各时期的数量统计；与空白组相比，*p＜0.05，***p＜0.001，与模型组相比，##p＜0.01，###p＜0.001；
28.图6为罗非鱼皮肽对小鼠血清激素水平的影响图其中，a.雌二醇，b.卵泡刺激素，c.促黄体生成素，d.孕酮；与空白组相比，*p＜0.05，**p＜0.001，与模型组相比，#p＜0.05，##p＜0.01，###p＜0.001；
29.图7为罗非鱼皮肽对小鼠卵巢组织的影响图其中，a.卵巢组织h&e染色，标尺：整体500μm，局部放大100μm，b.卵泡数量统计；与空白组相比，*p＜0.05，与模型组相比，#p＜0.05；
30.图8为不同酶对罗非鱼皮的水解度和dpph自由基清除率的影响。
具体实施方式
31.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
32.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
33.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
34.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
35.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
36.实施例1
37.一种罗非鱼皮肽的制备方法，制备工艺流程如下：罗非鱼皮
→
预处理
→
脱脂
→
干燥
→
酶解
→
超滤
→
浓缩
→
冷冻干燥
→
罗非鱼皮肽。
38.(1)将罗非鱼皮手工去除鳞片，使用流水进行反复冲洗，去除表面污物和油脂，洗至澄清，将罗非鱼皮修剪成0.5cm
×
0.5cm方块，在40℃水浴加热下，将罗非鱼皮与异丙醇以1：4(m/v)比例混合，进行脱脂90min，期间多次搅拌。第一次脱脂完，用流水充分冲洗后进行第二次脱脂，将水浴锅水温提升至45℃，罗非鱼皮与异丙醇以1：4(m/v)比例混匀后进行二次脱脂90min，期间多次搅拌，流水冲洗后转移至提前预热好的电热恒温鼓风干燥箱中，60℃干燥24h，期间多次翻动。
39.(2)将干燥后的罗非鱼皮称重后与单蒸水按照固液比1：5(m/v)的比例混合进行复合酶解，使用1m氢氧化钠或盐酸将ph调节至7.0，于50℃水浴加热下添加罗非鱼皮质量3％的中性蛋白酶水解90min，期间多次调节ph至7.0并充分搅拌，升高水浴温度至55℃，调节ph至9.0，添加罗非鱼皮质量3％的碱性蛋白酶水解90min，期间充分搅拌并多次调节ph至9.0。
40.(3)将酶解液加热至90℃灭活10min，于25℃室温下12000rpm高速离心15min，取得上清液，依次进行超滤、浓缩及冷冻干燥，得到罗非鱼皮肽。
41.①
超滤：将酶解上清液按照1：10的体积比加入清水稀释，使用pellicon切向流超滤系统，调节进口压力30psi，回流压力10psi，4℃环境下采用10kda超滤膜进行超滤处理，得到超滤酶解液。
42.②
浓缩及冷冻干燥：使用上海亚荣旋转蒸发仪，设置水浴温度55℃进行旋转蒸发，使用labconco冷冻干燥机于
‑
50℃，0.2mbar下，对浓缩后的酶解液进行冷冻干燥，得到罗非鱼皮肽粉末。
43.(4)样品分子量分布测定，利用hplc对所得罗非鱼皮肽的分子量分布情况进行分析，使用tsk gel g2000swxl 300mm
×
7.8mm色谱柱，流动性为水/乙腈/三氟乙酸(80：20：0.1，v/v/v)，在室温下，流速0.5ml/min条件下，以检测波长220nm对1.0mg/ml样品进行分子量分布检测。如图1所示选用细胞色素c(12384da)、抑肽酶(6511da)、杆菌肽(1450da)、l
‑
谷胱甘肽(612da)、gly
‑
gly
‑
tyr
‑
arg(451da)、gly
‑
gly
‑
gly(189da)为标准品，得到混合标准品凝胶色谱图。如图2所示，罗非鱼皮肽分子量测定，经过计算由实施例1制备的罗非鱼皮肽分子量分布在6kda以下。
44.试验例1
45.经上述方法制备的罗非鱼皮肽应用在改善卵巢早衰中，试验如下：
46.建立动物模型：本实验采用7～8周龄雌性c57bl/6小鼠，第1天腹腔注射50mg/kg体重剂量的环磷酰胺刺激，第2天起，每天腹腔注射10mg/kg体重剂量的环磷酰胺，一共连续注射14天建立小鼠卵巢早衰模型。
47.对各组雌鼠给予干预：本实验将小鼠随机分成空白组、模型组、实验组，每组各12只。空白组腹腔注射生理盐水，灌胃单蒸水以做对照，模型组造模第1天腹腔注射50mg/kg体重剂量的环磷酰胺刺激，第二天起，每天腹腔注射10mg/kg体重剂量的环磷酰胺，一共连续注射14天建立小鼠卵巢早衰模型，每天灌胃单蒸水以做对照。实验组从造模第1天起，使用由实施例1制备的罗非鱼皮肽，每天按照500mg/kg体重剂量连续灌胃30天罗非鱼皮肽。实验第15天起每日上午8：30对空白组、模型组、实验组进行阴道涂片，观察动情周期的变化。所有组小鼠，在灌胃30天后取材，观察卵巢指数变化，检测血清雌二醇(e2)、卵泡刺激素(fsh)、促黄体生成素(luteinizing hormone，lh)和孕酮(progesterone，p)水平并对卵巢切片进行h&e染色，进行卵泡计数。
48.实验结果监测及数据收集：所有组小鼠从第一次灌胃开始，每周检测并记录各组小鼠体重，直至取材。
49.罗非鱼皮肽对小鼠体重的影响：如表1和图3所示，小鼠建模前其体重之间无差异，腹腔注射环磷酰胺建模后，模型组与实验组小鼠体重均不同幅度下降，但是实验组下降程度比模型组低，通过灌胃治疗四周后，模型组和实验组之间体重存在显著性差异(p＜0.05)。由此可证明小鼠环磷酰胺建模成功且罗非鱼皮肽具有改善环磷酰胺造成小鼠体重下降的作用。
50.表1罗非鱼皮肽灌胃对小鼠体重的影响(n＝12)
[0051][0052]
注：各组之间使用graphpadprism8.0进行单因素方差分析再使用dunnett法进行多重比较；与空白组相比，*p＜0.05，**p＜0.001，与模型组相比，#p＜0.05。
[0053]
罗非鱼皮肽对小鼠卵巢指数的影响：卵巢早衰会对卵巢的功能造成影响，卵巢外观体积明显缩小，表面粗糙、萎缩，卵巢指数可以反应出小鼠的卵巢功能。如图4所示，模型组小鼠的卵巢指数同空白组小鼠的卵巢指数具有显著性差异(p＜0.05)，表面腹腔注射的环磷酰胺对卵巢造成了一定的损伤，经过罗非鱼皮肽灌胃后的小鼠有效的增加了卵巢指数，提高了小鼠的卵巢功能(p＜0.01)。
[0054]
注：各组之间使用graphpadprism8.0进行单因素方差分析再使用dunnett法进行多重比较；与空白组相比，*p＜0.05，与模型组相比，##p＜0.01。
[0055]
罗非鱼皮肽对小鼠动情周期的影响：小鼠的一个完整的动情周期分为动情间期、动情前期、动情期、动情后期，通常为4～5天，各个期间对应的小鼠阴道脱落细胞的形态不同，动情间期：大多数以白细胞为主；动情前期：阴道涂片中多数为椭圆形的有核上皮细胞，少数为白细胞；动情期：大多数为无核的角化鳞片状细胞，细胞呈大而扁平，边缘不齐整；拥有稳定规律的动情周期是哺乳动物性成熟的标志，意味着卵巢开始正常发挥功能。如图5所示，因注射环磷酰胺导致小鼠卵巢早衰，模型组处于动情后期和间期的次数极显著高于空白组(p＜0.001)，经过罗非鱼皮肽的灌胃治疗后，实验组发情期次数显著高于模型组(p＜0.01)，动情后期和动情间期次数显著低于模型组(p＜0.01)。
[0056]
注：各组之间使用graphpadprism8.0进行双因素方差分析再使用dunnett法进行多重比较；与空白组相比，*p＜0.05，***p＜0.001，与模型组相比，##p＜0.01，###p＜0.001。
[0057]
罗非鱼皮肽对小鼠血清激素水平的影响：在给予小鼠罗非鱼皮肽灌胃治疗一个月后，检测小鼠血清激素水平，结果如图6所示，模型组e2、fsh、lh及p水平与空白组均具有显著差异(p＜0.05，p＜0.01)，实验组与模型组相比，各个激素水平均得到一定的改善(p＜0.05，p＜0.01，p＜0.001)。表明罗非鱼皮肽对卵巢早衰小鼠的紊乱的性激素具有改善作用。
[0058]
注：各组之间使用graphpadprism8.0进行单因素方差分析再使用dunnett法进行多重比较；与空白组相比，*p＜0.05，**p＜0.01，与模型组相比，#p＜0.05，##p＜0.01，###p＜0.001。
[0059]
罗非鱼皮肽对小鼠卵巢组织的影响：对卵巢组织进行h&e染色，来观察罗非鱼皮肽对改善卵巢早衰小鼠卵巢损伤的影响。如图7所示，空白组的卵巢含有丰富的原始卵泡，而在模型组小鼠卵巢中原始卵泡数量显著降低(p＜0.05)，且出现大量闭锁卵泡(p＜0.01)，
在实验组中这一现象得到改善(p＜0.05)。
[0060]
注：各组之间使用graphpadprism8.0进行双因素方差分析再使用dunnett法进行多重比较；与空白组相比，*p＜0.05，**p＜0.01，与模型组相比，#p＜0.05，##p＜0.01。
[0061]
综合以上分析，得出以下结论：
①
由小鼠体重、卵巢指数、动情周期变化、血清激素水平以及卵巢组织学变化可以看出环磷酰胺引起小鼠卵巢早衰建模成功。
②
罗非鱼皮肽500mg/kg体重剂量灌胃一个月可以明显提高卵巢早衰小鼠的体重、卵巢指数，稳定小鼠紊乱的动情周期及血清激素水平同时对于卵泡的发育具有一定的正向调节作用。因此，由实施例1所制备的罗非鱼皮肽具有改善卵巢早衰的作用。
[0062]
试验例2
[0063]
实施例1中酶解所使用蛋白酶的种类的筛选
[0064]
以水解度和dpph清除率为指标，按照表2所示工艺参数，分别利用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶对罗非鱼皮进行酶解，从中筛选出两种实验用酶进行复合酶解。
[0065]
表2酶解工艺参数
[0066][0067]
水解度的测定
[0068]
蛋白质水解时断裂一个肽键会同时释放出一个游离氨基羧基，因此可以通过测定水解前后水解液中游离的氨基酸态氮来确定蛋白质的水解度，其中游离氨基酸态氮含量按gb 5009.235
‑
2016甲醛滴定法进行测定。水解度按公式(1)计算：
[0069]
dh(％)＝(a1‑
a0)/a
×
100％
ꢀꢀ
(1)
[0070]
式中：a1为水解后氨基酸态含量，a0为水解前氨基酸态氮含量，a为样品总氮含量。
[0071]
dpph自由基清除活性的测定
[0072]
将罗非鱼皮肽冻干粉配置成5mg/ml样液，取2ml样品液置于试管中，加入2ml溶于无水乙醇的dpph溶液(0.1mmol/l)，避光处理，将混合物激烈振荡10s，然后置于室温下反应30min，反应结束后，于517nm下测量反应混合物吸光度，同时以蒸馏水代替样品液做空白对照，以样品液加无水乙醇做样品对照，dpph自由基清除活性按公式(2)计算：
[0073]
dpph自由基清除率(％)＝(b
空
‑
b
样
b
样品对照
)/b
空
ꢀꢀ
(2)
[0074]
式中：b
空
为空白对照吸光度，b
样
为样品吸光度，b
样品对照
为样品对照吸光度。
[0075]
结果如图8所示：由水解度和dpph自由基清除率作为指标观测，中性蛋白酶和碱性蛋白酶的进行复合酶解，复合酶解液的水解度和dpph自由基清除率最高，因此，本发明选取此复合酶组合进行罗非鱼皮的酶解。
[0076]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。