一种具有稳定荧光特性的智能生物探针微生物检测方法与流程

1.本发明涉及生物检测领域，尤其涉及一种具有稳定荧光特性的智能生物探针微生物检测方法。


背景技术：

2.传统的微生物检测方法是基于对细菌的标准生化分析以及选择性培养的基础上展开的，由于培养过程操作繁琐、耗时长，使得微生物检验周期长，不具有实时性，不能及时反馈生产工艺和产品的现状，因此需要引入微生物快速检测方法。
3.随着科技水平的不断提高，一些快速微生物检测方法已被开发，在基于微生物生长信息的快速检测技术中，生物荧光技术得到了广泛应用。荧光分析方法是一种先进的分析方法，具有灵敏度高、选择性好、稳定性高且操作简单等优点而被不断的应用在各种分析检验过程中。基于荧光分析原理的荧光探针技术在检测速度和易用性方面具有无可比拟的优点，作为一类重要的检测手段已被广泛应用于化学生物传感和生物学等领域。


技术实现要素：

4.针对上述问题，本发明的目的是提供一种具有稳定荧光特性的智能生物探针微生物检测方法，能够缩短检测周期，简化检测步骤，实现微生物的快速检测。
5.为达到上述目的，本发明所采取的技术手段为：
6.一种具有稳定荧光特性的智能生物探针微生物检测方法，包括下面的步骤：
7.s1、取样：获取待检测样品；
8.s2、制备检测液：将待检测样品稀释，混合均匀并制成1:10检测液；
9.s3、检测液的培养：将培养液加入步骤s2的检测液中，混匀并放入37℃恒温培养箱内培养；
10.s4、制备智能生物探针的工作液：取具有稳定荧光特性的智能生物探针以1:20000的比例加入到缓冲溶液中，混匀；
11.s5、探针溶液的培养：将步骤s3中培养的检测液加入步骤s4中制备的工作液中，混匀形成含有目标细胞的探针溶液并在室温下进行进行培养；
12.s6、目标细胞标记：探针溶液中具有稳定荧光特性的智能生物探针对目标细胞进行荧光标记；
13.s7、荧光检测：取步骤s6中的探针溶液移入流式细胞仪利用激光激发，进行荧光检测。
14.进一步的，步骤s1～s7均在无菌环境下进行。
15.进一步的，步骤s2中使用ph7.0无菌氯化钠
‑
蛋白胨缓冲液对待检测样品进行稀释。
16.进一步的，步骤s3中的培养液配制方法为：rpmi1640培养液80％
‑
90％、小牛血清10％
‑
20％、谷氨酰氨1％及抗菌素(青霉素、链霉素)1万单位1％。
17.进一步的，步骤s3检测液的培养时间为10
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60min。
18.进一步的，步骤s4中的缓冲溶液为hbss溶液。
19.进一步的，步骤s5中的培养时间为15
‑
60min。
20.进一步的，步骤s7中激光的激发波长为320
‑
680nm，扫描范围为350
‑
800nm。
21.本发明的有益效果为：
22.本发明将具有稳定荧光特性的智能生物探针引入到微生物的检测方法中，向荧光探针溶液中加入待检测物质进行荧光检测，实现了微生物的快速检测。该检测方法的检测时间只需要2
‑
4个小时，而传统检测方法中的检测时间需要2
‑
5天，大大缩短了检测时间。并且，该检测方法操作简单、灵敏度高、选择性好且稳定性好，减少了人力、物力的消耗，提高了检测效率，可广泛应用于实际检测工作中。
附图说明
23.图1为本发明的具有稳定荧光特性的智能生物探针的探针溶液在不同温度培养后的荧光检测得出的荧光强度图；
24.图2为本发明的具有稳定荧光特性的智能生物探针对宫颈癌hela细胞的选择性荧光光谱图；
25.图3为本发明的具有稳定荧光特性的智能生物探针检测宫颈癌hela细胞时加入其它干扰物的荧光强度图；
26.图4为本发明的具有稳定荧光特性的智能生物探针检测宫颈癌hela细胞不同时间段的荧光强度变化图；
27.图5为本发明的具有稳定荧光特性的智能生物探针检测宫颈癌hela细胞不同溶液浓度时的荧光强度变化图；
28.图6为本发明的具有稳定荧光特性的智能生物探针检测宫颈癌hela细胞不同温度下的荧光强度变化图。
具体实施方式
29.本发明提供一种具有稳定荧光特性的智能生物探针微生物检测方法，包括下面的步骤：
30.进行微生物检测前，所有的平皿和稀释剂都应该严格按照相关的灭菌程序消毒，以下操作均在无菌环境下进行，以确保其对检测结果没有影响。
31.步骤s1：用无菌工具对样品进行采样，获取待检测样品。
32.步骤s2：首先将ph7.0无菌氯化钠
‑
蛋白胨缓冲液经115℃高压蒸汽灭菌30min，然后提取待检测样品10g(ml)加入ph7.0无菌氯化钠
‑
蛋白胨缓冲液100ml中，使溶液混合均匀，制成1:10的检测液。
33.步骤s3：首先进行培养液的配制，配制方法为：rpmi1640培养液85ml、小牛血清10ml、谷氨酰氨1ml及抗菌素(青霉素、链霉素)1万单位1ml。其次将培养液在121℃，压力为0.015mpa环境中进行高压蒸汽灭菌30min。最后将灭菌后的培养液加入步骤s2的检测液中，混匀并放入37℃恒温培养箱内进行培养，培养时间为10
‑
60min。
34.步骤s4：取智能生物探针1μl以重量比为1:20000的比例加入到20ml的pbss缓冲溶
液中形成含有智能生物探针的工作液，使工作液的最终浓度为50nm，混合均匀；
35.步骤s5：取步骤s3中培养的检测液，加入步骤s4中制备的工作液，混合均匀并形成含有微生物目标细胞的探针溶液在室温状态下再次进行培养，培养时间为15
‑
60min；
36.步骤s6：用具有稳定荧光特性的智能生物探针对培养的探针溶液中的目标细胞进行荧光标记；
37.步骤s7：取步骤s6中的含有荧光标记过的目标细胞的探针溶液1ml移入流式细胞仪进行激光激发，进行荧光成像，其中激发波长为320
‑
680nm，扫描范围为350
‑
800nm。如果存在荧光，则待检测样品中存在目标细胞；如果不存在荧光，则待检测样品中不存在目标细胞。
38.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
39.实施例1：一种具有稳定荧光特性的智能生物探针检测宫颈癌hela细胞的准确度分析
40.建立荧光快检组：取含有宫颈癌hela细胞的待检测样品10g(ml)加入ph7.0无菌氯化钠
‑
蛋白胨缓冲液100ml中，使溶液混合均匀，制成1:10的检测液；然后加入配制好的rpmi1640培养液，混匀并放入37℃恒温培养箱内培养30min；取检测宫颈癌hela细胞的智能生物探针1μl加入到20ml的pbss缓冲溶液中，混合均匀形成含有智能生物探针的工作液；在工作液中加入培养后的检测液形成探针溶液，将探针溶液平均分成8份继续培养，培养温度分别为5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，培养时间为15
‑
60min；具有稳定荧光特性的智能生物探针对宫颈癌hela细胞进行荧光标记；将含有荧光标记过的宫颈癌hela细胞的探针溶液1ml移入流式细胞仪进行激光激发，在激发波长为400nm激发下观察荧光发光情况并计数。如图1所示，可以看出，探针溶液经过不同温度的培养，在培养时间15
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60min内，分别进行荧光标记及荧光检测，得出的荧光检测结果基本一致。因此，在预设的培养时间内，探针溶液的培养选择室温状态即能满足荧光检测，无需增设恒温培养箱或加热装置等，节约了检测成本，简化了检测方法。
41.同时设置传统对照组，即按照传统的检测方法检测，按照传统时间进行培养，进行观察计数。实验结果表明，荧光快检组和传统对照组检测结果一致，均检测出了宫颈癌hela细胞的数量，但荧光快检组中细胞检测时间只需要2
‑
4个小时，而传统对照组细胞检测时间需要2
‑
5天。因此，荧光快检组的检测时间比传统检测方法更短，检测效率比传统检测方法更高。
42.实施例2：一种具有稳定荧光特性的智能生物探针对宫颈癌hela细胞的选择性分析
43.在ph7.0无菌氯化钠
‑
蛋白胨缓冲液100ml中加入含有等当量的宫颈癌hela细胞、宫颈癌c33a细胞、骨肉瘤143b细胞、卵巢癌a2780细胞的检测溶液，并搅拌混合均匀，制成检测液；然后加入配制好的rpmi1640培养液，混匀并放入37℃恒温培养箱内培养30min；取检测宫颈癌hela细胞的智能生物探针1μl加入到20ml的pbss缓冲溶液中，混合均匀形成含有智能生物探针的工作液；在工作液中加入培养后的检测液形成探针溶液，室温下继续培养，培养时间为15
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60min；取培养后的探针溶液1ml移入流式细胞仪进行激光激发，在激发波长为400nm激发下，测试其各自的荧光发射情况。由图2可知，当具有稳定荧光特性的智能生物探针与宫颈癌hela细胞作用后，荧光光谱发生了明显的变化，而其他细胞的加入则几乎不
发生变化，说明此智能生物探针对宫颈癌hela细胞具有很好的选择性。由图3可知，宫颈癌c33a细胞、骨肉瘤143b细胞与卵巢癌a2780细胞的荧光强度几乎相同，当存在宫颈癌hela细胞时，相比其它3种非目标细胞，荧光信号强度显著增加，其原因在于具有稳定荧光特性的智能生物探针对宫颈癌hela细胞进行了荧光标记，同样说明此智能生物探针对宫颈癌hela细胞具有很好的选择性。
44.实施例3：一种具有稳定荧光特性的智能生物探针检测宫颈癌hela细胞的稳定性分析
45.取含有宫颈癌hela细胞的待检测样品10g(ml)加入ph7.0无菌氯化钠
‑
蛋白胨缓冲液100ml中，使溶液混合均匀，制成1:10的检测液；然后加入配制好的rpmi1640培养液，混匀并放入37℃恒温培养箱内培养30min；取检测宫颈癌hela细胞的智能生物探针1μl加入到20ml的pbss缓冲溶液中，混合均匀形成含有智能生物探针的工作液；在工作液中加入培养后的检测液形成探针溶液，室温下继续培养，培养时间为15
‑
60min；具有稳定荧光特性的智能生物探针对宫颈癌hela细胞进行荧光标记；将含有荧光标记过的宫颈癌hela细胞的探针溶液1ml移入流式细胞仪进行激光激发，在激发波长为400nm激发下测试其在不同时间段内荧光强度的变化。由图4可知，此智能生物探针与宫颈癌hela细胞的反应在60min内几乎保持不变，说明此智能生物探针对宫颈癌hela细胞具有良好的稳定性。
46.实施例4：一种具有稳定荧光特性的智能生物探针检测宫颈癌hela细胞不同溶液浓度的影响研究
47.取含有宫颈癌hela细胞的待检测样品加入ph7.0无菌氯化钠
‑
蛋白胨缓冲液中，使溶液混合均匀，制成10份不同浓度的检测液；然后加入配制好的rpmi1640培养液，混匀并放入37℃恒温培养箱内培养30min；取检测宫颈癌hela细胞的智能生物探针1μl加入到20ml的pbss缓冲溶液中，混合均匀形成含有智能生物探针的工作液；在工作液中加入培养后的检测液形成探针溶液，室温下继续培养，培养时间为15
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60min；具有稳定荧光特性的智能生物探针对宫颈癌hela细胞进行荧光标记；将含有荧光标记过的宫颈癌hela细胞的探针溶液1ml移入流式细胞仪进行激光激发，在激发波长为400nm激发下测试其荧光光谱的变化。由图5可知，随着宫颈癌hela细胞浓度的增加，智能生物探针的荧光强度也逐渐增加，并在配制浓度范围内呈线性关系。
48.实施例5：一种具有稳定荧光特性的智能生物探针检测宫颈癌hela细胞不同温度的影响研究
49.取含有宫颈癌hela细胞的待检测样品10g(ml)加入ph7.0无菌氯化钠
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蛋白胨缓冲液100ml中，使溶液混合均匀，制成1:10的检测液；然后加入配制好的rpmi1640培养液，混匀并放入37℃恒温培养箱内培养30min；取检测宫颈癌hela细胞的智能生物探针1μl加入到20ml的pbss缓冲溶液中，混合均匀形成含有智能生物探针的工作液；在工作液中加入培养后的检测液形成探针溶液，室温下继续培养，培养时间为15
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60min；具有稳定荧光特性的智能生物探针对宫颈癌hela细胞进行荧光标记；将含有荧光标记过的宫颈癌hela细胞的探针溶液1ml移入流式细胞仪进行激光激发，在激发波长为400nm激发下测试其在不同温度(5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃)下的荧光强度的变化。由图6可知，温度的变化对于此智能生物探针检测宫颈癌hela细胞几乎没有影响，说明此智能生物探针对温度不敏感，能够在各种不同环境温度下实现对宫颈癌hela细胞的灵敏检测。
50.本发明利用荧光探针高灵敏性、高选择性、操作简单等优点，将具有稳定荧光特性的智能生物探针引入到微生物的检测方法中，向荧光探针溶液中加入待检测物质进行荧光检测，实现了微生物的快速检测，该检测方法稳定性好、灵敏度高、抗干扰能力强且操作简单，大大减少了人力、物力的消耗，降低了检测成本，提高了检测效率，可广泛应用于实际检测工作。
51.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明；对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。