人源抗新型冠状病毒SARS-CoV-2中和性抗体SK1及其应用的制作方法

人源抗新型冠状病毒sars
‑
cov
‑
2中和性抗体sk1及其应用
技术领域
1.本发明涉及基因工程抗体技术领域，具体涉及人源抗新型冠状病毒sars
‑
cov
‑
2中和性抗体sk1及其应用。


背景技术：

2.新型冠状病毒肺炎(corona virus disease 2019，covid
‑
19)，简称“新冠肺炎”，是指2019新型冠状病毒感染导致的肺炎。
3.利用含有特异性抗体的人源或动物血清免疫球蛋白来预防和治疗传染病的方法由来已久。单克隆抗体的体外抗病毒中和活性和体内保护机体抵抗病毒攻击的活性已获得许多实验证明，如汉坦病毒、麻疹病毒、rsv病毒、狂犬病毒等中和性单克隆抗体可以在体内100％保护动物免受病毒攻击。
4.免疫球蛋白(immunoglobulin,ig)作为抗体成分主要来自捐献者(恢复期病人)的免疫血清，从获得阳性血清到通过安全性检测耗时较长，且需投入大量的人力和财力，这就使其大量制备受到限制，同时由于抗体主要来源于血清，因此容易发生血源性传播疾病的感染。而使用人源基因工程产品替代血制品则可克服这些缺陷。人源基因工程抗体研究的不断深入为该领域生物制品发展带来了新希望和广阔前景。
5.90年代初兴起的噬菌体展示技术(phage display techniques)和整个基因工程抗体技术研究领域的发展，极大促进了人源或基因工程抗体的开发研究，并已由基础研究阶段步入实质性应用研究和开发阶段。人源抗病毒基因工程抗体，尤其是人源全抗体的研究成功，给各种病毒性传染病的特异性预防和治疗开辟了新思路，并在抗病毒感染生物医药领域中逐渐开发出一类新的抗病毒药。
6.鉴于sars
‑
cov
‑
2病毒的传染性和致病性，开发针对sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白的特异性抗体对于疾病的临床治疗和诊断试剂的研发和应用均具有重要的意义。


技术实现要素：

7.本发明的目的是提供一种人源抗新型冠状病毒sars
‑
cov
‑
2中和性抗体sk1及其应用。
8.本发明利用噬菌体展示技术，通过采集多个sars
‑
cov
‑
2病人恢复期外周血淋巴细胞，利用基因工程方法构建了人源抗sars
‑
cov
‑
2病毒基因工程抗体文库，并筛选获得特异性抗sars
‑
cov
‑
2病毒的基因工程抗体fab片段。该抗体是由存在于抗体轻链和重链可变区中的高变区(cdrs)的特异性序列决定的，并能够在原核细胞中获得有效表达的特异性结合sars
‑
cov
‑
2病毒的功能性抗体。该抗体能够特异性识别sars
‑
cov
‑
2病毒颗粒抗原，与sars
‑
cov
‑
2具有明显的酶联免疫(elisa)反应和抗sars
‑
cov
‑
2病毒感染的中和活性功能。
9.具体地，本发明提供以下技术方案：
10.本发明提供人源抗sars
‑
cov
‑
2病毒中和性抗体sk1，所述抗体sk1的轻链高变区cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列如seq id no.1
‑
3所示，重链高变区cdr1、cdr2和cdr3的氨
基酸序列如seq id no.4
‑
6所示。
11.抗体sk1的轻链高变区cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列和重链高变区cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列具体如表1所示。
12.表1 抗体cdr的氨基酸序列
[0013][0014]
抗体sk1特异性的轻链和重链可变区基因来源于对人源抗sars
‑
cov
‑
2病毒抗体基因库的特异性富积筛选，该抗体库的建立来源于中国sars
‑
cov
‑
2病毒病人外周血淋巴细胞基因。其轻链和重链可变区相应的三个cdr区序列组合及其cdr区之间的框架区序列构成了该抗体可变区序列特征，sk1属于抗体轻链家族vk1。抗体蛋白功能由存在于抗体基因轻链和重链可变区的决定簇互补区cdr1、cdr2和cdr3中特异性序列所决定，6个相应的cdr区氨基酸序列构成了抗体的特异性抗原结合区域，决定了本发明抗体的抗原结合特征以及抗sars
‑
cov
‑
2病毒功能特征。
[0015]
优选地，本发明所述的抗体sk1的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.7所示，其重链可变区的氨基酸序列如seq id no.8所示。
[0016]
本发明还提供编码所述人源抗sars
‑
cov
‑
2病毒中和性抗体sk1的核酸。
[0017]
考虑到密码子的简并性，例如可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，对编码上述fab片段抗体的基因序列进行改造，获得编码具有相同功能的抗体的基因。本领域技术人员可以根据表达抗体宿主的密码子偏爱性，人工合成改造基因，以提高抗体的表达效率。
[0018]
作为本发明的一种实施方式，编码抗体sk1的轻链可变区和重链可变区的核酸的核苷酸序列分别如seq id no.9和seq id no.10所示。
[0019]
本发明还提供一种生物材料，其包含编码所述人源抗sars
‑
cov
‑
2病毒中和性抗体sk1的核酸。
[0020]
优选地，所述生物材料为选自表达盒、载体、宿主细胞或细胞系中的一种。
[0021]
其中，所述载体包括但不限于克隆载体、表达载体，可为质粒载体、病毒载体、转座子等载体。
[0022]
所述宿主细胞或细胞系可以为来源于微生物或动物的细胞或细胞系。
[0023]
本发明还提供由所述人源抗sars
‑
cov
‑
2病毒中和性抗体sk1经改造得到的单链抗体scfv、fab抗体、全抗体免疫球蛋白igg或标记复合物。
[0024]
将本发明提供的上述fab抗体的轻链可变区和重链可变区进行重组，获得分子量更小的单链抗体(scfv)，该抗体同样能够特异性识别sars
‑
cov
‑
2病毒表面抗原，具有细胞内免疫的作用。单链抗体穿透力强，易于进入局部组织发挥作用。
[0025]
具体地，可将上述编码fab抗体的基因、scfv基因克隆到表达载体中，进而转化宿主，通过诱导表达获得fab抗体以及单链抗体。
[0026]
此外，可将上述fab抗体的轻链编码基因和重链编码基因克隆到全抗表达载体中，
并导入宿主细胞中，获得表达抗sars
‑
cov
‑
2病毒的全抗免疫球蛋白。
[0027]
以上所述的标记复合物可为将人源抗sars
‑
cov
‑
2病毒中和性抗体sk1经生物化学标记得到。
[0028]
优选地，所述生物化学标记为选自酶标记、生物素标记、荧光染料标记、化学发光染料标记、放射性标记中的一种或多种。
[0029]
本发明利用elisa、sds
‑
page等方法对获得的sk1抗体进行功能鉴定，结果表明人源抗体sk1针对sars
‑
cov
‑
2病毒能够特异性结合，利用中和实验对sk1抗体进行功能鉴定，结果表明sk1具有较好的sars
‑
cov
‑
2病毒中和活性。
[0030]
基于sk1抗体的功能和活性，本发明提供所述人源抗sars
‑
cov
‑
2病毒中和性抗体sk1、其编码核酸或含有其编码核酸的生物材料或由其改造得到的单链抗体scfv、fab抗体或全抗体免疫球蛋白igg或标记复合物在制备用于诊断、预防或治疗由sars
‑
cov
‑
2病毒引起的新冠肺炎的药物中的应用。
[0031]
本发明还提供所述人源抗sars
‑
cov
‑
2病毒中和性抗体sk1、其编码核酸或含有其编码核酸的生物材料或由其改造得到的单链抗体scfv、fab抗体或全抗体免疫球蛋白igg或标记复合物在制备用于sars
‑
cov
‑
2病毒抗原检测的试剂或试剂盒中的应用。
[0032]
本发明提供含有所述人源抗sars
‑
cov
‑
2病毒中和性抗体sk1或由其改造得到的单链抗体scfv、fab抗体或全抗体免疫球蛋白igg或标记复合物的检测试剂或检测试剂盒。
[0033]
本发明还提供含有所述人源抗sars
‑
cov
‑
2病毒中和性抗体sk1或由其改造得到的单链抗体scfv、fab抗体或全抗体免疫球蛋白igg或标记复合物的药物。
[0034]
本发明的有益效果在于：本发明利用噬菌体展示技术成功获得了特异性针对sars
‑
cov
‑
2病毒的人源中和性抗体sk1。该抗体可与新型冠状病毒sars
‑
cov
‑
2表面s蛋白发生显著的酶联免疫反应，且具有新型冠状病毒sars
‑
cov
‑
2病毒的中和活性。
[0035]
利用上述获得的人源中和性抗sars
‑
cov
‑
2病毒基因工程抗体可变区基因、fab抗体基因以及该抗体基因特征下的全抗体基因，可以在原核细胞、酵母细胞、真核细胞及任何重组系统中表达和生产该抗体或以此为基础的改造后的含有该抗体基因的任何其他基因，获得具有中和sars
‑
cov
‑
2病毒感染的抗体产物，制成临床上用于诊断、预防和治疗新冠肺炎的特异性抗体药物或试剂，具有在临床中用于诊断、预防和治疗由新型冠状病毒sars
‑
cov
‑
2引起的新冠肺炎的潜力。
附图说明
[0036]
图1为本发明实施例2中sars
‑
cov
‑
2病毒sk1抗体构建全抗体igg后的sds
‑
page电泳图；其中，1为sars
‑
cov
‑
2病毒sk1全抗体igg，m为蛋白marker。
[0037]
图2为本发明实施例3中抗sars
‑
cov
‑
2病毒人源sk1全抗体igg的中和实验结果。
具体实施方式
[0038]
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0039]
实施例1人源抗sars
‑
cov
‑
2病毒抗体库的构建及fab抗体的筛选
[0040]
1、噬菌体抗体库的构建
[0041]
用淋巴细胞分离液(sigma，美国)从sars
‑
cov
‑
2病人恢复期抗凝血液中分离淋巴
细胞，用rneasy mini kit(qiagen，德国)提取总细胞rna，以oligo
‑
dt为引物，提取的rna为模板，采用invitrogen公司的第一链合成试剂盒(superscripttmⅲfirst
‑
strand synthesis system for rt
‑
pcr.cat no.18080
‑
051)逆转录生成cdna。用一组扩增人源抗体igg1重链fd及轻链kappa和lambda的引物对人源轻链和重链fab基因进行pcr扩增。使用的引物序列如下：
[0042]
(1)重链fd区引物
[0043]
5'端：
[0044]
vh1a：5'
‑
cag gtg cag ctc gag cag tct ggg
‑
3'；
[0045]
vh1f：5'
‑
cag gtg cag ctg ctc gag tct ggg
‑
3'；
[0046]
vh2f：5'
‑
cag gtg cag cta ctc gag tcg gg
‑
3'；
[0047]
vh3a：5'
‑
gag gtg cag ctc gag gag tct ggg
‑
3'；
[0048]
vh3f：5'
‑
gag gtg cag ctg ctc gag tct ggg
‑
3'；
[0049]
vh4f：5'
‑
cag gtg cag ctg ctc gag tcg gg
‑
3'；
[0050]
vh6f：5'
‑
cag gtg cag cta cta gag tgg gg
‑
3'；
[0051]
vh6a：5'
‑
cag gta cag ctc gag cag tca gg
‑
3'；
[0052]
3'端：
[0053]
cg1z：5'
‑
gca tgt act agt ttt gtc aca aga ttt ggg
‑
3'。
[0054]
(2)轻链引物
[0055]
κ链可变区5'
‑
端：
[0056]
vk1a：5'
‑
gac atc gag ctc acc cag tct cca
‑
3'；
[0057]
vk2a：5'
‑
gat att gag ctc act cag tct cca
‑
3'；
[0058]
vk3a：5'
‑
gaa att gag ctc acg cag tct cca
‑
3'；
[0059]
κ链可变区3
‑
端：
[0060]
ck1d：5'
‑
gcg ccg tct aga att aac act ctc ccc tgt tga agc tct ttg tga cgg gcg aac tca
‑
3'。
[0061]
λ链可变区5
‑
端：
[0062]
vl1：5'
‑
aat ttt gag ctc act cag ccc cac
‑
3'；
[0063]
vl2：5'
‑
tct gcc gag ctc cag cct gcc tcc gtg
‑
3'；
[0064]
vl3：5'
‑
tct gtg gag ctc cag ccg ccc tca gtg
‑
3'；
[0065]
vl4：5'
‑
tct gaa gag ctc cag gac cct gtt gtg tct gtg
‑
3'；
[0066]
vl5：5'
‑
cag tct gag ctc acg cag ccg ccc
‑
3'；
[0067]
vl6：5'
‑
cag act gag ctc act cag gag ccc
‑
3'；
[0068]
λ链可变区3
‑
端
[0069]
cl2：5'
‑
cgc cgt cta gaa tta tga aca ttc tgt agg
‑
3'。
[0070]
pcr条件为:94℃、1min，54℃、1min，72℃、2min，共35个循环。建库方法基本按文献(barbas,c.fⅲ.,kang,a.s.,and larner,r.a.assembly of combinatorial antibody libraries on phage surface:the geneⅲsite.proc.natl.acad.sci.usa.1991；88(18):7978
‑
7982)进行。具体如下：
[0071]
首先将所有不同的重链和轻链pcr产物分别按各自组群混合。取经xbai和saci酶
切消化，并经电泳纯化后的pcomb3h载体dna1.5
‑
2μg与轻链混合物500
‑
700ng，加入2μl高浓度连接酶(neb2000u/μl)，加入连接缓冲液，16℃过夜连接。次日加入100μl纯化水，加入3m naac 16μl，加2.5
‑
3倍无水乙醇沉淀dna，离心沉淀，用20μl纯水重悬沉淀后加入到感受态菌xl1
‑
blue中，电压2.5kv，电击1分钟。电转后立即加入2ml soc培养液，然后立即转入细菌培养箱中，37℃振荡培养1小时。将菌液全部涂于含氨苄青霉素的lb平皿上，37℃培养过夜。次日向平皿中加入10
‑
15ml培养液，刮取菌斑，分装于离心管，12000rpm离心后弃上清，全部用qiagen大提质粒试剂盒提取质粒pcomb3h
‑
l，混合后冻存于
‑
20℃待用。将克隆入l链的pcomb3h
‑
l和fd链纯化pcr产物，分别用xhoi和spei进行双酶切反应，37℃酶切3
‑
4h。电泳回收相应的条带，将质粒和fd酶切后回收产物定量。取酶切消化后回收纯化的载体dna 2μg，重链pcr产物600ng左右，加入2μl高浓度连接酶，加入相应的连接缓冲液，16℃连接过夜。次日加100μl纯化水，加3m naac 16μl，加2.5
‑
3倍无水乙醇沉淀dna，离心沉淀，用20μl纯水重悬沉淀并加入到感受态菌xl1
‑
blue中，电压2.5kv，电击1分钟。电转后立即加入2ml soc培养液，然后立即转入细菌培养箱中，37℃200rpm振荡培养1h。将菌液转入一个三角瓶中，加入含20μg/ml氨苄青霉素的10ml sb
‑
a 培养液，37℃、200rpm振荡培养1小时。加入100ml sb培养液(含100μg/ml的amp和20μg/ml的tet)，震荡培养1小时。加入10
12
pfu辅助噬菌体vcsm13，37℃静置感染20min，然后37℃培养2h加入终浓度为70μg/ml的kan，37℃培养过夜。待od
600
约为1时，将菌液4℃、4000rpm离心15min，转移上清至无菌三角瓶中，加入4％(w/v)peg8000和3％(w/v)nacl，完全溶解后冰浴30min以上沉淀噬菌体。4℃、9000rpm离心20
‑
30min，弃上清将沉淀用2ml pbs重悬，瞬时离心，上清即为fab噬菌体抗体库。
[0072]
2、噬菌体抗体库的富集筛选及fab段抗体的诱导表达
[0073]
以sars
‑
cov
‑
2刺突蛋白rbd区重组蛋白(北京义翘神州科技有限公司，货号：40592
‑
v08h；下称rbd蛋白)为筛选抗原。使用时用0.1m nahco3(ph8.6)溶液稀释，包被免疫管，用含4％脱脂奶的pbs液，于37℃封闭2h后，加入上述噬菌体抗体库，每管1ml，37℃孵育2h，用含5％tween
‑
20的tbs液反复洗20遍，最后每管用1ml ph2.2的甘氨酸
‑
盐酸洗脱液洗脱，并用ph9.6的tris液中和。洗脱后的噬菌体继续感染2ml新鲜的od
600
为1.0左右的xl1
‑
blu菌，经辅助噬菌体vcsm13(stratagene，美国)感染后进行下一轮筛选。如此反复筛选3～4次。具体富集筛选方法及fab片段的诱导表达基本按文献(barbas,c.fⅲ.,kang,a.s.,and larner,r.a.assembly of combinatorial antibody libraries on phage surface:the geneⅲsite.proc.natl.acad.sci.usa.1991；88(18):7978
‑
7982)进行。
[0074]
fab阳性克隆的表达：随机挑选经3次富集筛选后的单菌落于96深孔板中，每孔800μl培养基，37℃培养过夜。次日以1:20的比例转接至含有800μl sb培养基(含amp 100μg/ml)的96孔板中，37℃培养至od
600
＝0.2
‑
0.3时，加入终浓度为1mm的iptg，30℃诱导表达8
‑
10hr。4℃4000rpm离心15min，上清用于检测。
[0075]
3、人源抗sars
‑
cov
‑
2病毒fab抗体的elisa检测
[0076]
(1)检测fab的表达
[0077]
用0.1m nahco3(ph9.6)溶液将抗人fab抗体(1:2000稀释后使用，sigma，美国)包被于酶标板上，4℃过夜；4％脱脂奶封闭，37℃1h，加入表达的fab抗体，37℃1h；加入酶标抗人fab二抗(1:2000稀释后使用，sigma，美国)，37℃1h；显色液显色，2m h2so4终止反应，酶标仪检测吸光度a值。
sarcoma with an in vitro
‑
evolved antibody.the faseb journal.(october 18,2002)10.1096/fj.02
‑
0281fje.)，得到载体pigg
‑
l。再用引物(上游引物5'
‑
gaggagctcactccgaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtac
‑
3'，下游引物5'
‑
gaggggcccttggtggaggctgaggagacggt
‑
3')扩增fab抗体的重链段，利用saci/apai酶切克隆入载体pigg
‑
l，构建成全抗体表达载体。
[0093]
2、转染：采用购自美国invitrogen公司的转染试剂盒，操作方法略述如下：将5μg重组质粒dna与转染试剂混合后，转染生长密度为70％的293t细胞，37℃、5％co2培养。
[0094]
3、全抗体igg纯化：培养3d后收集上清，采用购自amersham公司的protein
‑
a亲和层析柱直接纯化表达上清(harlow e,lane d.antibodies:a laboratory manual[m].new york:cold spring harbor laboratory press,1988)。采用elisa和sds
‑
page对获得的纯化igg抗体的功能特性进行鉴定。
[0095]
构建得到的全抗体igg的sds
‑
page电泳结果见图1。
[0096]
实施例3抗rbd抗体sk1的sars
‑
cov
‑
2假型病毒中和活性测定
[0097]
待测抗体：实施例2制备的sk1。
[0098]
sars
‑
cov
‑
2假型病毒一种以逆转录病毒的复制核心元件与sars
‑
cov
‑
2病毒的包膜刺突糖蛋白(即s蛋白)组装形成的新型病毒颗粒。假型病毒感染细胞的能力取决于其外面包裹的糖蛋白的种类与特性，是用于研究sars
‑
cov
‑
2的中和抗体抑制效率、受体利用和入侵感染机制的理想工具。
[0099]
1、sars
‑
cov
‑
2假型病毒的包装制备
[0100]
将293t细胞(来源自中国医学科学院基础医学研究所)接种于10厘米培养皿中，利用含10％胎牛血清(购自gibco公司)的dmem培养基(购自赛默飞世尔公司)培养至80％细胞汇合度，共转染15微克sars
‑
cov
‑
2s基因表达质粒(北京义翘神州科技公司，货号：vg40589
‑
ut)与15微克pnl4.3
‑
luc
‑
r
‑
e
‑
质粒(biovectorntcc)，转染后36小时更换含2％胎牛血清的dmem培养基，继续培养12小时并收获含有sars
‑
cov
‑
2假型病毒的培养上清，分装并冻存于
‑
80摄氏度长期保存。
[0101]
2、假型病毒入侵抑制试验
[0102]
将步骤1制备的sars
‑
cov
‑
2假型病毒分别与不同稀释度的sk1抗体混合后，加入预先接种的含calu
‑
3细胞(购自中国医学科学院基础医学研究所)的96孔板中，继续孵育48小时。sars
‑
cov
‑
2假型病毒含有荧光素酶报告基因，假型病毒具有感染目标靶细胞的能力，通过检测报告基因等方法可以测定假型病毒的感染能力与水平。使用promega公司的luciferase荧光素酶报告基因检测试剂盒(货号：e4550)，按产品说明书裂解细胞并对细胞裂解液中的报告基因活性进行检测，将荧光素酶原始读值数据转换为百分比数据进行做图并计算ic50。
[0103]
结果如图2所示。
[0104]
结果显示，本发明所获得的人源中和抗体sk1具有优良的抑制sars
‑
cov
‑
2假型病毒感染的能力，抗病毒效果为：ic50＝0.0022μg/ml。
[0105]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。