一种通过干扰UBA2表达抑制牛骨骼肌卫星细胞增殖和成肌分化的方法与流程

一种通过干扰uba2表达抑制牛骨骼肌卫星细胞增殖和成肌分化的方法
技术领域
1.本发明属于生物、细胞、组织工程技术领域，尤其是一种通过干扰uba2表达抑制牛骨骼肌卫星细胞增殖和成肌分化的方法。


背景技术：

2.骨骼肌卫星细胞(skeletal muscle satellite cell)是骨骼肌中一种附着于肌纤维表面的扁平、有突起的细胞，通常以静息状态存在于肌纤维肌膜与基底膜之间，在一定的条件下可以被激活，肌卫星细胞可增殖、分化、融合成为成熟的肌管或肌纤维，肌卫星细胞在动物出生后肌肉的生长发育和再生过程中发挥着十分重要的作用。肌卫星细胞的体外增殖和成肌分化过程很好地模拟了体内的肌肉发育过程，是研究细胞分化和肌肉发育的良好细胞模型。肌卫星细胞的激活、增殖和成肌分化过程受多种因素的调控，了解骨骼肌卫星细胞的增殖和成肌分化调控模式，可以增加人为控制肌细胞形成的可能性。
3.肌肉的分化和生长发育过程是内在遗传、表观遗传和外在的各种信号互作的结果，骨骼肌发育分化过程涉及多基因的表达、信号途径及网络式调控，过程极其复杂，其中泛素样修饰物活化酶的调控作用受到越来越多的重视。泛素样修饰物活化酶2(ubiquit in like modifier activating enzyme 2,uba2)也被称作sumo活化酶2(sumo
‑
activating enzyme 2,sae2)，是sumo系统中e1酶(由aos1和uba2构成异二聚体)的重要组分，能够直接影响人体内sumo化水平。牛uba2基因位于18号染色体，近年来多项研究报道了uba2基因或uba2蛋白异常与临床疾病的相关性。小泛素相关修饰物(small ubiquitin
‑
like modifiers，sumo)是一种泛素样分子，能够可逆地修饰翻译后的蛋白，具有调节靶蛋白稳定性、定位及与其他蛋白相互作用的功能。此外，sumo还参与dna修复、细胞增殖与凋亡的调节和基因组完整性的维护等多个生理过程。本发明人在前期研究中对mstn
‑
/
‑
牛和野生型牛进行了肌肉蛋白组学分析发现uba2在mstn
‑
/
‑
牛和野生型牛中存在显著性差异，提示uba2可能对肌肉发育分化具有一定的调控作用。uba2是sumo系统中e1酶(由aos1和uba2构成异二聚体)的重要组分，sumo化循环包括活化、结合、连接、修饰和解离等多个过程，包括sumo活化酶e1(也称aos1
‑
uba2或sae1
‑
sae2)，sumo结合酶e2(ubc9)，sumo连接酶e3和sumo蛋白酶(sumo
‑
specific protease,senps)等多个酶的参与。已有研究表明，在直肠癌中，下调uba2的表达能够抑制结直肠癌细胞的迁移和侵袭，也可以抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡。此外，抑制uba2表达可诱导早幼粒细胞白血病(promyelocytic leukemia，pml)核体破裂，促进细胞凋亡或衰老。目前有关uba2和sumo化修饰的报道多在各种肿瘤中，而在牛肌卫星细胞的增殖和成肌分化中uba2的相关研究未见报道。
4.通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。


技术实现要素：

5.本发明目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种通过干扰uba2表达抑制牛骨
骼肌卫星细胞增殖和成肌分化的方法。
6.本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
7.一种通过干扰uba2表达抑制牛骨骼肌卫星细胞增殖和成肌分化的方法，所述方法是通过干扰uba2表达来实现抑制牛骨骼肌卫星细胞的增殖和成肌分化，其中，所述uba2的基因组碱基序列为：seq no.1。
8.进一步地，具体步骤如下：
9.根据uba2碱基序列，设计合成出uba2的si
‑
rna，以si
‑
rna转染牛骨骼肌卫星细胞，调低uba2的表达水平，实现抑制牛骨骼肌卫星细胞的增殖和成肌分化。
10.进一步地，所述si
‑
rna的基因序列为：seq no.2、seq no.3或seq no.4。
11.进一步地，所述干扰uba2表达水平的方法包括：采用干扰uba2表达的质粒、病毒载体或基因敲除。
12.本发明取得的优点和积极效果为：
13.1、本发明方法利用改变uba2表达对牛肌卫星细胞的增殖和成肌分化过程进行调控，可以为肌肉发育分化的泛素样修饰物活化酶研究提供启示，并为肌肉发育分化及损伤修复的临床研究及诊治提供新的思路和参考。
14.2、利用本发明建立的通过改变uba2表达来抑制牛骨骼肌卫星细胞的增殖和成肌分化过程的方法，可以有效地调控肌肉发育分化过程，借助此方法可以为肌肉发育分化及损伤修复中uba2的利用提供一定的借鉴，并为肌肉发育分化及损伤修复的临床研究及诊治提供新的思路和参考。
15.3、鉴于目前uba2对牛骨骼肌卫星细胞是否具有一定的调节作用，以及具体的作用效果还不清楚，本发明设计并合成uba2的si
‑
rna，然后采用lip3000试剂转染牛骨骼肌卫星细胞，干扰牛骨骼肌卫星细胞中uba2的表达水平，通过改变牛骨骼肌卫星细胞中uba2的表达，从而抑制牛骨骼肌卫星细胞的增殖和成肌分化过程。借助此方法可以为肌肉发育分化及损伤修复中uba2的利用提供借鉴，并为肌肉发育分化及损伤修复的临床研究及诊治提供新的思路和方法。
16.4、本发明人在前期研究中对mstn
‑
/
‑
牛和野生型牛进行了肌肉蛋白组学分析发现泛素样修饰物活化酶uba2(ubiquitin like modifier activating enzyme 2，uba2)在mstn
‑
/
‑
牛和野生型牛中存在显著性差异，提示uba2可能对肌肉发育分化具有一定的调控作用。本发明选取uba2进行增殖和成肌分化调控研究，以期建立通过改变牛骨骼肌卫星细胞中uba2的表达，从而影响牛骨骼肌卫星细胞的增殖和成肌分化过程的方法，为肌肉发育分化的泛素样修饰物活化酶调控研究提供新的思路和方法。
附图说明
17.图1为本发明中uba2的si
‑
rna在牛骨骼肌卫星细胞中对uba2表达水平影响的定量qrt
‑
pcr检测结果图；qrt
‑
pcr检测牛骨骼肌卫星细胞中uba2的mrna表达水平；
18.图2为本发明中采用si
‑
rna干扰uba2表达对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响结果图；其中，a为edu检测荧光显微镜下荧光图；b为edu检测结果直观示意图；c为qrt
‑
pcr检测牛骨骼肌卫星细胞中增殖标志基因pax7、myod的mrna表达水平结果图；d为光镜下牛骨骼肌卫星细胞增殖24h的细胞图；
19.图3为本发明中采用si
‑
rna干扰uba2表达对牛骨骼肌卫星细胞分化的影响结果图；其中，a为qrt
‑
pcr检测牛骨骼肌卫星细胞中分化标志基因myhc分别在48h和72h的mrna表达水平结果图；b为western blot检测干扰后myhc分别在48h和72h的蛋白表达水平图；c为western blot检测直观示意图；d为光镜下牛骨骼肌卫星细胞分化48h和72h的肌管图。
具体实施方式
20.下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
21.本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
22.一种通过干扰uba2表达抑制牛骨骼肌卫星细胞增殖和成肌分化的方法，所述方法是通过干扰uba2表达来实现抑制牛骨骼肌卫星细胞的增殖和成肌分化，其中，所述uba2的基因组碱基序列为：seq no.1。
23.较优地，具体步骤如下：
24.根据uba2碱基序列，设计合成出uba2的si
‑
rna，以si
‑
rna转染牛骨骼肌卫星细胞，调低uba2的表达水平，实现抑制牛骨骼肌卫星细胞的增殖和成肌分化。
25.较优地，所述si
‑
rna的基因序列为：seq no.2、seq no.3或seq no.4。
26.较优地，所述干扰uba2表达水平的方法包括：采用干扰uba2表达的质粒、病毒载体或基因敲除。
27.具体地，相关制备及检测如下：
28.本发明的一种设计思路可以是：
29.设计并合成uba2的si
‑
rna，然后采用lip 3000试剂转染牛骨骼肌卫星细胞，干扰牛骨骼肌卫星细胞中uba2的表达水平，通过改变牛骨骼肌卫星细胞中uba2的表达，从而抑制牛骨骼肌卫星细胞的增殖和成肌分化过程。
30.一种通过干扰uba2表达抑制牛骨骼肌卫星细胞增殖和成肌分化的方法，包括以下步骤：
31.第一步、牛骨骼肌卫星细胞分离培养、体外成肌诱导分化模型的建立及uba2干扰rna(si
‑
rna)设计合成和干扰效果检测。
32.采用胰酶和胶原酶联合消化的方法分离牛骨骼肌卫星细胞，建立牛骨骼肌卫星细胞体外成肌诱导分化模型。根据uba2碱基序列，设计合成3条si
‑
rna，分别转染牛骨骼肌卫星细胞，采用定量pcr方法检测uba2的表达水平，检测si
‑
rna对uba2的干扰效果。
33.具体步骤是：
34.(1)牛骨骼肌卫星细胞分离培养、体外成肌诱导分化模型的建立。
35.采用胰酶和胶原酶联合消化的方法分离牛骨骼肌卫星细胞。无菌条件下采集牛胎儿后肢肌肉，剪成合适大小，置于pbs缓冲液中清洗数次，在培养皿中用眼科剪充分剪碎，用预热的pbs缓冲液冲洗一次后在离心机中以1000r/min的转速离心5min，弃去上清液，加入5ml的0.2％胶原酶ii在37℃水浴中消化1h，期间每隔10min涡旋振荡10s，然后加入0.25％胰酶消化30min，期间每隔10min涡旋振荡10s，最后加入适量3
‑
4ml含血清的培养基(20％fbs 80％dmem)终止消化，将上述混合液依次过100目、200目和400目细胞筛，将滤液收集到
50ml离心管中，在离心机中以1000r/min的转速离心10min，用培养基重悬，接种到合适的培养皿中，37℃、5％co2培养箱中培养。在含有20％胎牛血清的dmem生长培养基中进行培养，待细胞生长至80％融合时，加入含有2％马血清的dmem分化培养基进行体外成肌诱导分化，观察肌卫星细胞分化情况及肌管形成状态，建立牛骨骼肌卫星细胞体外成肌诱导分化模型。
36.(2)uba2的基因组碱基序列(2671bp)：seq no.1
37.ggctcgtggtcgtcccgccatggcactgtcgagggggctaccccgggaactggctgaggccgtggccgggggccgggtcctggtggtgggggcgggaggcatcggctgcgagctcctcaaaaacctcgtgctcacc
38.ggcttctcccacatcgacctgattgatctggata
39.ctattgatgtcagcaacctcaacaggcagtttttgtttcaaaagaaacatgttggaagatcaaaggcccaggttgccaaagagagtgtcctgcagttttacccgaaagctaatatcgtagcctaccatgacagcattatgaaccctgactataatgtggaattttttcgacaatttatattggttatgaatgctttagataacagagctgcccgcaaccatgttaatagaatgtgtctagcagctgatgtccctcttattgagagtggaactgctggttatcttgggcaagtaaccactatcaaaaagggtgtgaccgagtgttacgaatgccatcccaaaccaacccagagaactttt
40.cctggctgtacaattcgtaacacaccttcagaacctattcattgcattgtc
41.tgggcgaaatatttgttcaaccagttgtttggagaagaagatgctgatcaagaagtatctcctgacagagctgaccctgaagcttcctgggaaccaatggaagccgaagccagagccagagcatctaatgaagatggtgacattaaacgtgtttccaccaaggagtgggctaaatcaactggatatgatccagttaaactttttaccaagctttttaaagatgatatcagatatctgttgacgatggacaaactatggcggaaaaggaaacctccagttccattggattgggctgaagtgcaaagtcaaggagaagaaaccagtgcatcagatcaacaaaacgaaccccagttaggtctgaaagaccagcaggttctagatgtcaagagctatgcatgtcttttttcaaagagcattgagactttgagagttcatttagcagaaaagggggatggagctgagctcatatgggacaaggatgacccatctgcaatggattttgtcacctctgctgcaaatctcaggatgcatattttcagtatgaatatgaaaagcagattcgatatcaaatcaatggcagggaacattattcctgctatcgctactactaatgcagtgattgctgggttg
42.atagtattggaaggattgaagattttatcaggaaaaatagaccagtgtagaacaatttttttgaataaacaaccaaacccaagaaagaagcttcttgtgccttgtgcactggatgctcccaatcctaactgttacgtatgtgccagcaagccagaggtgactgtgcggctgaatgttcataaagtgacggttctcaccttacaagataagattgtgaaagaaaaatttgctatggtagcaccagatgtccaaattgaagatggaaaaggaacaatcctaatatcttcagaagagggagagacagaagctaataatcacaagaaattgtcagaatttggaattagaaatgggagccgacttcaagcagatgacttccttcaggactacactttattgatcaacatccttcatagtgaagacctaggaaaggatgttgaatttgaagttgttggtgatgccccagaaaaagtggggcccaagcaagctgaagatgctgccaaaagcataaccaatggcagcgacgatggagctcagccttccacatccacagcacaagagcaagatgatgtgctcatagttgattcggatgaagaaggtccctcaaataatgctgatatcagtgaagaagaaagaagtcgcaagaggaagctagatgagaaagagagtgtcagtgcgaaaaggtcacgcatagagcaggcagaggagcttgatgaggttatagcattagattgaacagaaatgcctctgaacggaacctcttactccattaaggccttctgggcagaaccaggttatttgttacgtcctttgttccaaagggaaaatattgacaccagtgacttgaagatgattctgctccctttgaaagcattcattttgctagaactattagaaacattgcagtatgctgtattgaaagtaggaatatagttttaaaaccctttgaacaaagtatgtgcataaccagtccatgagatgaaacaacaccgtgcatgttgcctttttaatgtaaatacccttcggtatcatttaacagttttaaaatattgtggtttagtaaagttgatacctggttataaatattatgcctttatttttggttagaagaagaattatttttagcctagatcta
accattttcatactcttaactgactgaaacagattcaaagaagtatcgagtgctatgcattgaaacttgtttttaaatgttaactggcactatgtatattaatgtaaaacagttgttaatttactcaagttttcagcttgtactgcctggtatgtctgtgtaagaagccaatttttgtgtattgttacagtttcaggttatttatatttgatgttttgtaaaactcaaatacaactatactgtacttatggaccaaataaatgacatctgcatacttgttaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa aaaaaaaaaaa
43.(3)uba2干扰rna(si
‑
rna)设计合成及干扰效果检测
44.具体步骤是：
45.3.1uba2干扰rna(si
‑
rna)设计合成。
46.根据uba2碱基序列，采用si
‑
rna设计软件设计出3条si
‑
rna(si
‑
uba2
‑
1、si
‑
uba2
‑
2、si
‑
uba2
‑
3)，(si
‑
uba2
‑
1(seq no.2：gcattatgaaccctgacta)、si
‑
uba2
‑
2(seq no.3：caaccaaacccaagaaaga)、si
‑
uba2
‑
3(seq no.4：ggtgacattaaacgtgttt)，由生物公司合成。
47.3.2si
‑
rna干扰uba2表达的效果检测。
48.将uba2的上述3条si
‑
rna分别采用lip 3000试剂转染牛骨骼肌卫星细胞，将牛骨骼肌卫星细胞分别接种于60mm细胞培养皿中，用生长培养基进行培养，当细胞生长密度为70％～80％时准备转染，并在转染前一天将培养基更换成无抗生素的生长培养基。根据试剂说明书推荐浓度，采用si
‑
rna及阴性对照终浓度50nm进行转染。在进行转染时，先将培养基更换成无血清的opti
‑
mem培养基，将si
‑
rna或对应阴性对照混合于50μl opti
‑
mem培养基中，同时将0.75μl lip 3000转染试剂混合于50μl opti
‑
mem培养基，分别静置5min，将含si
‑
rna或对应阴性对照的50μl opti
‑
mem培养基加入到含罗氏转染试剂的opti
‑
mem培养基中，轻柔混匀后混合液静置15min，将混合液均匀滴加到60mm细胞培养皿中，滴加混合液体积以达到si
‑
rna或对应阴性对照的终浓度为准。转染24h后，采用细胞rna快速提取试剂盒提取转染细胞的总rna，采用实时荧光定量pcr方法检测uba2的表达，总rna提取、rna的反转录及定量pcr操作如下。
49.采用细胞rna快速提取试剂盒提取增殖及分化细胞的总rna。提取步骤：向24孔细胞培养板中加入350μl细胞裂解液，反复吹打至细胞充分裂解。显微镜下观察细胞完全裂解后，将上述裂解液收集至1.5ml的无rna酶管中。将裂解混合物全部加到dna清除柱上。立刻13000rpm的转速离心60s。用微量移液器精确估计滤过液体积，加入等体积的70％乙醇，立即吹打混匀，不要离心。立即将混合物加入一个吸附柱ra中，13000rpm离心30s，弃掉废液。加700μl去蛋白液rw1，室温放置1分钟，12000rpm离心30s，弃掉废液。加入500μl漂洗液rw，12000rpm离心30s，弃掉废液。加入500μl漂洗液rw，重复一遍。将吸附柱ra放回空收集中，13000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。取出吸附柱ra，放入一个无酶离心管中，根据预期rna产量在吸附膜的中间部位加30
‑
50μl无酶水，室温放置1分钟，12000rpm离心1分钟。
50.rna反转录体系及条件：
[0051][0052]
配制成20μl的混合液。
[0053]
涡旋振荡混匀，短暂离心，将管壁上的溶液收集到pcr管底。
[0054]
将配好的混合液放置于pcr仪上，并设定程序：先于42℃条件下孵育15min，然后在85℃条件下孵育5min。上述程序结束后，短暂离心，将反转录后的cdna混合液取出在冰上冷却。
[0055]
①
定量pcr检测体系：
[0056]
反应液的配置：在冰上配置反应液，每个样品中的检测指标都要进行复孔实验，并进行单孔ntc实验，采用白色8连管进行定量pcr检测。
[0057]
8连管中每个单管中反应液配置如下：
[0058][0059]
共20μl反应体积
[0060]
qrt
‑
pcr的反应条件：
[0061]
充分混匀反应液后，离心，使反应液到反应管底部，置于实时荧光定量pcr仪上。具体反应设计程序如下：
[0062]
预变性：95℃条件下60s
[0063]
变性：95℃条件下10s
[0064]
退火：61℃条件下20s
[0065]
延伸：72℃条件下15s
[0066]
重复变性至退火步骤35次。
[0067]
反应结束后，绘制溶解曲线，本实验中检测荧光温度范围为：65℃
‑
95℃，升温速率为0.5℃/次循环，恒温时间为10s/次循环。
[0068]
所有反应结束后，于37℃条件下保温30s，防止反应结束后取出反应管时被烫。
[0069]
所述定量pcr检测方法检测增殖uba2基因表达量时，采用的基因引物为：
[0070]
f
‑
ccaccaaggagtgggctaaa，其核苷酸序列如seq no.5所示；
[0071]
r
‑
tggaggtttccttttccgcc，其核苷酸序列如seq no.6所示；
[0072]
定量pcr检测方法检测试验中的其他基因的表达量时，采用的内参基因均为gapdh，引物为：
[0073]
f
‑
tgttgtggatctgacctgcc，其核苷酸序列如seq no.13所示；
[0074]
r
‑
aagtcgcaggagacaacctg，其核苷酸序列如seq no.14所示；
[0075]
所用引物序列见表1，检测结果见图1，实验结果表明3条si
‑
rna对uba2的表达具有明显的干扰作用，显著调低了uba2的表达水平(**，与对照nc相比p<0.01)，si
‑
uba2
‑
2效果最好可以用于uba2的表达调控研究。
[0076]
表1 uba2实时定量pcr引物序列
[0077][0078][0079]
第二步、干扰uba2表达对牛肌卫星细胞增殖的影响：
[0080]
采用si
‑
rna
‑
2转染牛骨骼肌卫星细胞干扰uba2的表达，将细胞进行增殖培养通过细胞增殖的状态和相关试验判断干扰uba2表达对牛肌卫星细胞增殖的影响；具体步骤是：
[0081]
将uba2的si
‑
uba2
‑
2采用lip3000试剂转染牛骨骼肌卫星细胞，具体操作与第一步中si
‑
rna的转染方法相同。
[0082]
采用实时荧光定量pcr方法检测牛骨骼肌卫星细胞增殖标志基因pax7、myod的mrna水平的表达量；rna的提取和反转录及定量pcr操作按照试剂盒说明书进行，具体操作与第一步中相同。
[0083]
定量pcr检测方法检测增殖标志基因pax7表达量时，采用的基因引物为：
[0084]
f
‑
agccagagtttcaacgggag，其核苷酸序列如seq no.7所示；
[0085]
r
‑
gtcgccaacagacaacacac，其核苷酸序列如seq no.8所示；
[0086]
定量pcr检测方法检测增殖标志基因myod表达量时，采用的基因引物为：
[0087]
f
‑
gacggctctctctgcaactt，其核苷酸序列如seq no.9所示；
[0088]
r
‑
cggcgcggatccaggt，其核苷酸序列如seq no.10所示；
[0089]
所用引物序列见表1，gapdh作为内参。
[0090]
采用edu细胞增殖实验检测干扰uba2表达对牛肌卫星细胞增殖的影响；edu细胞增殖实验操作如下：
[0091]
将牛骨骼肌卫星细胞传代后接种于96孔板，按试验分组处理后，增殖培养24h，加入100μl 50μmol/l edu培养基，37℃孵育2h，pbs清洗细胞2次，加入50μl的细胞固定液固定30min，加入50μl 2mg/ml甘氨酸，脱色5min后用pbs清洗细胞2次，然后加入100μl染色反应液，避光室温孵育30min，弃反应液，加入100μl甲醛清洗5min，用pbs清洗2次。加入100μl的dapi反应液，避光，室温孵育30min，pbs清洗2次，最后一次pbs保留。荧光显微镜下检测edu阳性细胞数，每个生物学重复采集3个视野，根据edu阳性细胞数/dapi标记的细胞数计算增殖率。
[0092]
增殖培养24h后，在光镜下观察细胞增殖状态，拍照保存取细胞光镜图(结果见图2)，通过光镜图可以看出，与对照组(si
‑
rna
‑
nc)相比，转染了si
‑
uba2
‑
2的肌卫星细胞数量减少。上述试验检测结果见图2，(*，与对照nc相比p<0.05)，与对照组(si
‑
rna
‑
nc)相比，转染了si
‑
uba2
‑
2的肌卫星细胞，增殖标志基因pax7、myod的表达量显著降低。根据edu阳性细胞数/dapi标记的细胞数计算增殖率结果显示，与对照组(si
‑
rna
‑
nc)相比，转染了si
‑
uba2
‑
2的肌卫星细胞的阳性细胞率显著降低。。
[0093]
第三步、干扰uba2表达对牛肌卫星细胞分化的影响：
[0094]
采用si
‑
rna
‑
2转染牛骨骼肌卫星细胞干扰uba2的表达，将细胞进行增殖培养后，随后对细胞进行诱导分化。通过细胞分化的状态和相关试验判断干扰uba2表达对牛肌卫星细胞分化的影响；具体步骤是：将增殖培养基更换为分化培养基继续成肌诱导培养，在光镜下观察细胞分化状态，分别在相应时期拍照保存细胞光镜图(结果见图3)。收分化时期(分化48h和72h)的rna和蛋白，总rna提取、rna的反转录及定量pcr操作与第一步中方法相同，所用引物序列见表1，gapdh作为内参。
[0095]
定量pcr检测方法检测分化标志基因myhc表达量时，采用的基因引物为：
[0096]
f
‑
ctggaatccggaggcagaa，其核苷酸序列如seq no.11所示；
[0097]
r
‑
ttttcgaaggtagggagcgg，其核苷酸序列如seq no.12所示；
[0098]
牛骨骼肌卫星细胞分化期蛋白myhc表达水平检测。
[0099]
提取增殖及分化时期的牛骨骼肌卫星细胞的蛋白，bca法测蛋白浓度，然后配制上层胶和下层胶，下层胶4ml加入玻璃板夹缝，加乙醇至板顶端，10min后倒去乙醇，用滤纸轻轻沾去少量残留乙醇。(注意不要漏胶)。上层胶2ml加入到分离胶上层，插上梳子。在等待的时间进行蛋白样品的变性，蛋白上样量要求20
‑
30μg，4
×
pro buffer用pbs稀释成1
×
pro，100℃煮沸。取下做好的胶板，置于电泳架上(注意矮玻璃板要与架子的绿色海绵对齐防止漏气)，安装好放入电泳槽中，电泳槽加满电泳液，用10μl枪加样，记录加样顺序。在大槽中，加电泳液过半。(电泳结束电泳液要回收，电泳液配制：直接将5
×
电泳液稀释至1
×
，即取5
×
电泳液200ml，定容至1000ml。)80v电泳30
‑
40min，120v电泳1h，使条带跑至下端绿色处。80v电泳30
‑
40min，120v电泳1h。电泳的等待时间做电转的准备工作：电转液、电转槽和盖、冰袋2个、冰块和盆。将电转液加入电转槽中，每个电转槽中放入一个冰袋，然后放在装有冰水混合物的盆子里。白瓷盘(放电转液少许)，玻璃棒，镊子，绿色刮板，含有甲醇的培养皿。剪切滤纸，滤纸要略大于目的凝胶，pvdf膜在转膜之前要浸泡在甲醇里，上下滤纸不能接
触，否则转膜失败，所以pvdf膜要略大于滤纸。在白瓷盘中的一边放好三明治：上白板
‑
海绵
‑
滤纸
‑
胶
‑
膜(赶气泡)
‑
滤纸(赶气泡)
‑
海绵
‑
下黑板。电泳结束，关开关，取下胶板。将胶板放于白瓷盘另一边，用绿色刮板的尖端轻轻推入，起开小玻璃板，去浓缩胶，根据marker的50kda和223kda条带，用绿色刮板切目的凝胶条带。将三明治放于电转槽，黑色板对黑面放(记好每个板子的标记)。转膜条件：300ma转膜2h。转膜时间要合适，防止转膜太过。将胶左上角剪去，观察(曝光)时，右角是缺口，因为转膜时条带在膜的下面。转膜快结束的前半小时制作封闭液和tbs清洗液：封闭液制备：称取10g奶粉加入200ml配置好的tbst，电磁搅拌。tbst:1.65ml吐温20％ 35mltbs 700ml水。转膜结束，取下三明治，将膜放入盛有封闭液的平皿中，至少封闭2h。孵育一抗。将膜封到杂交袋中，杂交袋标记好，封口，4℃过夜。pbs清洗5遍，孵育二抗。pbs清洗5遍，曝光观察。
[0100]
结合细胞肌管的形成状态在光镜下观察细胞分化状态(分别在相应时期拍照保存细胞光镜图(结果见图3))与相关试验判断干扰uba2表达对牛肌卫星细胞成肌分化的影响，通过光镜图可以看出，与对照组(si
‑
rna
‑
nc)相比，转染了si
‑
uba2
‑
2的肌卫星细胞的肌管数量和直径均呈减少趋势。采用定量检测分化标志基因myhc的mrna水平的表达量，相关检测结果见图3(**，与对照nc相比p<0.01)，采用western bloting检验分化标志基因myhc的蛋白水平的表达量，检测结果见图3(**，与对照nc相比p<0.01)，与对照组(si
‑
rna
‑
nc)相比，转染了si
‑
uba2
‑
2后的肌卫星细胞中的分化标志基因myhc在mrna和蛋白水平都极显著下降，表明下调uba2能够抑制肌卫星细胞的成肌分化，实验结果说明uba2可能正调控牛骨骼肌卫星细胞的增殖和成肌分化过程。上述研究结果提示，改变牛骨骼肌卫星细胞中肌肉发育分化相关uba2的表达，可以影响牛骨骼肌卫星细胞的增殖和成肌分化过程。
[0101]
当然，uba2表达水平改变的方法包括设计合成的干扰rna(si
‑
rna)，还包括干扰uba2表达的质粒、病毒载体及基因敲除等其它能够改变uba2表达水平的手段。
[0102]
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容。