一种鉴别粘盖乳牛肝菌的核酸分子引物、方法及试剂盒与流程

1.本发明涉及分子生物学方法检测食用菌技术领域，尤其是涉及一种鉴别粘盖乳牛肝菌 (suillus bovinus)的核酸分子引物、方法及试剂盒。


背景技术：

2.乳牛肝菌属(suillus)隶属于真菌界(fungi)、担子菌门(basidiomycota)、伞菌纲 (agaricomycetes)、牛肝菌目(boletales)、乳牛肝菌科(suillaceae)，是一类外生菌根真菌，可与多种树木，特别是针叶树种形成共生关系。index fungorum(http://www.indexfungorum.org) 中乳牛肝菌物种记录有509条。乳牛肝菌属内除少数品种有毒或味苦而不能食用外，大部分品种均可食用。粘盖乳牛肝菌(suillus bovinus)主要分布于针叶林中，是一种非常名贵的食用菌，在云南、广东、广西等地区广泛用于烹饪，富含多种蛋白质、维生素和抗氧化活性物质，而碳水化合物和脂肪的含量非常低，是非常健康的绿色食用菌类。由于乳牛肝菌属内存在有毒及致幻的物种，因而进行物种的准确快速鉴别对于粘盖乳牛肝菌的安全利用和开发具有总要价值。目前尚未有粘盖乳牛肝菌相关的分子鉴定方法报道。
3.现今，基于核酸的快速检测技术已被广泛应用，特征性核苷酸序列具有一定的稳定性，不会受到外界因素的影响而改变，是该个体区别与其他个体的重要标志。peptidase family c50 (肽酶家族c50基因)是一类能够水解肽链的酶，该基因家族在粘盖乳牛肝菌基因组中出现显著的扩张，产生5种不同的家族基因。基于此，本发明设计特有引物，通过pcr方法，专一地扩增粘盖乳牛肝菌基因组(lofgren et al.2021； https://mycocosm.jgi.doe.gov/mycocosm/home/releases？flt＝suillus)中独有的肽酶家族c50基因 (gene id：12967)，该基因在其他22种已知乳牛肝菌属物种基因组中均不存在，通过电泳条带结果鉴定粘盖乳牛肝菌菌株和子实体。


技术实现要素：

4.基于此，本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种鉴别粘盖乳牛肝菌的核酸分子引物。
5.本发明采用的技术方案是：
6.一种鉴别粘盖乳牛肝菌的特异引物c50f和c50r，其dna序列为：
7.c50f：5
’‑
ctgtcgcagatatagatgtaga
‑3’
(如seq id no.2所示)
8.c50r：5
’‑
cttgaggagccagagtgt
‑3’
(如seq id no.3所示)。
9.本发明的另一目的在于提供一种鉴别粘盖乳牛肝菌的方法。
10.一种鉴别粘盖乳牛肝菌的方法，采用上述的核酸分子引物，包括以下步骤：
11.s1：提取粘盖牛肝菌待测样品dna；
12.s2：以样品dna为pcr扩增的模板，用核酸分子引物作为扩增引物进行pcr扩增，所述特异引物为：
13.c50f：5
’‑
ctgtcgcagatatagatgtaga
‑3’
14.c50r：5
’‑
cttgaggagccagagtgt
‑3’
；
15.s3：对步骤s2的pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
16.进一步，步骤s2中的pcr扩增反应体系包括以下体积百分比的组分：
[0017][0018]
进一步，步骤s2中的pcr扩增反应体系的总体积为50μl。
[0019]
进一步，步骤s2中的pcr扩增条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，50℃退火30s， 72℃延伸60s，35个循环；最后72℃延伸10min，产物保存4℃保存备用。
[0020]
进一步，步骤s3中，若样品的电泳结果中出现245bp片段，则鉴定样品为粘盖乳牛肝菌。
[0021]
本发明的再一目的在于提供一种鉴别粘盖乳牛肝菌的pcr检测试剂盒。
[0022]
一种鉴别粘盖乳牛肝菌的pcr检测试剂盒，包括如上所述的核酸分子引物。
[0023]
进一步，pcr扩增反应体系包括以下体积百分比的组分：
[0024][0025][0026]
进一步，pcr扩增反应体系的总体积为50μl。
[0027]
本发明的还提供如上所述的pcr检测试剂盒在鉴定粘盖乳牛肝菌的应用。
[0028]
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供的的专用核酸分子引物可对粘盖乳牛肝菌子实体和菌株进行快速的分子鉴定，具有很好的专一性，同时用料较少，仅20mg即可，方法简单，2小时即可完成检验，
[0029]
为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。
附图说明
[0030]
图1为粘盖乳牛肝菌子实体的外观图。
[0031]
图2本发明实施例1中粘盖乳牛肝菌其中一个平板培养8周后的菌落组织形态图。
[0032]
图3本发明实施例2中鉴定粘盖乳牛肝菌的电泳结果图，其中，m为2kb的dna分子量标准(marker)，从上到下分别是2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。1为培养菌丝pcr扩增序列电泳条带，2为子实体pcr扩增序列电泳条带。
[0033]
图4本发明所述的粘盖乳牛肝菌的核苷酸序列片段，其中阴影部分序列标记pcr扩增的目的片段。
具体实施方式
[0034]
以下实施例便于理解本发明，但并不限定本发明。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0035]
实施例1：粘盖乳牛肝菌菌株获取和基因组dna提取
[0036]
1、自云南新平彝族自治县磨盘山国家级森林公园(101.96
°
e，23.95
°
n)采集生长健壮、未开伞的粘盖乳牛肝菌子实体(参见图1)，放入冰盒内当日带回实验室，超净工作台内立即进行分离，获得培养用组织块，组织块5
×
5mm。
[0037]
2、将切取的组织块，接种入平板培养基内，所述培养基成分为：马铃薯葡萄糖琼脂(pda) 干粉(40g/l)、麦芽浸粉(10g/l)、维生素b1(50mg/l)、复合维生素b片(1片/l，每片含维生素b1 3mg、维生素b2 1.5mg、维生素b6 0.2mg、烟酰胺10mg、泛酸钙1mg)、肉豆蔻酸钾盐(0.5
‑
1mmol/l)。
[0038]
3、接种10个平板重复，放置在温度26℃恒温培养箱中培养2
‑
3天左右，可看到所有培养皿中组织块边缘产生白色细密的菌丝产生，2周菌丝直径可达1.5cm，8周菌丝可长满培养皿(直径5.5cm)。菌落表面呈现放射状，颜色随着生长逐渐褐变，最终成黄棕色，表面产生白色气生菌丝(参见图2)。
[0039]
4、刮取20mg菌丝放入1.5ml离心管1。
[0040]
5、同时取干净的粘盖乳牛肝菌子实体样本20mg放入无菌的研钵中，将液氮倒入并快速研磨，将研磨后的样品粉末放入1.5ml离心管2中。
[0041]
6、使用北京德曼特尔生物科技有限公司生产的快速无毒植物dna提取试剂盒(fh plantdna kit)进行dna的提取。首先分别向离心管1和离心管2中分别加入pl1缓冲液100μl，室温放置2分钟。然后加入pl2缓冲液600μl，室温放置2分钟并上下混匀数次，室温10000 rpm离心30秒。用200μl移液枪将上清液分别转入dna吸附柱1和2中，室温10000rpm 离心1分钟，弃掉废液。向吸附柱中加入pl2缓冲液300μl，室温10000rpm离心1分钟，弃掉废液。继续向吸附柱中加入漂洗液wb 600μl，室温室温10000rpm离心1分钟，弃掉废液。最后将吸附柱开盖2分钟，挥发残余酒精，继而加入65℃预热洗脱缓冲液eb 30μl，静置2分钟后，12000rpm离心2分钟，洗脱dna并保存于新的离心管1和2中。最终获得粘盖乳牛肝菌子实体和菌丝的dna。
[0042]
实施例2：粘盖乳牛肝菌特异性引物的pcr扩增
[0043]
根据粘盖乳牛肝菌peptidase family c50基因家族基因(gene id 12967)设计特
异性核酸分子引物c50f和c50r，c50f：5
’‑
ctgtcgcagatatagatgtaga
‑3’
(seq id no.2) 和c50r：5
’‑
cttgaggagccagagtgt
‑3’
(seq id no.3)，该引物由上海生物工程有限公司合成。pcr扩增反应体系为50μl总体积：dna模板1μl，taq dna聚合酶(5u/μl) 1μl，上游引物c50f(10μmol/l)1μl，下游引物c50r(10μmol/l)1μl，10
×
buffer 5 μl，2mmol/l dntp 5μl，25mmol/l mgcl
2 3μl，补足ddh2o至50μl。dna模板为实例1最终分别获得的子实体和菌丝dna。反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s、 50℃退火30s、72℃延伸60s，35个循环；最后72℃延伸10min，产物保存4℃保存备用。电泳检测pcr结果电泳图如图3所示。从图上可以看出，粘盖乳牛肝菌子实体和菌丝都能扩增出特有的肽酶家族c50基因目的片段，这表明本发明的核酸分子探针特异性好，专一性强，可以快速用于鉴别粘盖乳牛肝菌。将粘盖乳牛肝菌的特异性扩增片段送去测序，其序列如seq id no.1的第435～679位碱基所示，其长度为245bp(参见图4)。
[0044]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。