一种牛源抗金黄色葡萄球菌LukD毒力因子的单链抗体及其制备和应用的制作方法

技术特征：
1.一种牛源抗金黄色葡萄球菌lukd毒力因子的单链抗体，其特征在于，其至少具有如seq id no.1所示氨基酸序列的轻链可变区、如seq id no.2所示氨基酸序列的重链可变区和位于轻链可变区与重链可变区之间的中间连接肽。2.根据权利要求1所述的一种牛源抗金黄色葡萄球菌lukd毒力因子的单链抗体，其特征在于，所述中间连接肽的氨基酸序列如seq id no.3所示。3.根据权利要求1所述的一种牛源抗金黄色葡萄球菌lukd毒力因子的单链抗体，其特征在于，所述牛源抗金黄色葡萄球菌lukd毒力因子的单链抗体具有如seq id no.4所示的氨基酸序列。4.一种核酸片段，其特征在于，所述核酸片段编码权利要求1或2或3所述牛源抗金黄色葡萄球菌lukd毒力因子的单链抗体。5.用于扩增获得如权利要求1或2或3所述牛源抗金黄色葡萄球菌lukd毒力因子的单链抗体的引物组，其特征在于，与pcantab5e载体连接时，用于单链抗体筛选，包括用于扩增单链抗体轻链可变区的引物，和用于扩增单链抗体重链可变区的引物，其中引物vh f和vh r用于扩增重链可变区；引物vl f和vl r用于扩增轻链可变区，其中，vlf、vh r分别含有sfi i和not i酶切位点；vh f、vl r含互补的linker序列，其中，引物vh f的序列为：5
′‑
ggcggtggtggatccggtggcggcggatctcaggtgcagctgcg
‑3′
引物vh r的序列为：5
′‑
ttgcggccgcactagtggaggagacggtgaccag
‑3′
引物vl f的序列为：5
′‑
gtggcccagccggccatggcccaggctgtgctgactcag
‑3′
引物vl r的序列为：5'
‑
agatccgccgccaccggatccaccaccgcccgagccaccgccacctaggacggtcagtgtggt
‑3′
。6.根据权利要求5所述的引物组，其特征在于，vh和vl基因的扩增方法为：以cdna为模版，vh f、vh r为引物扩增vh基因；vl f、vl r为引物扩增vl基因；重链可变区vh和轻链可变区vl基因的扩增的pcr反应体系为25μl：2
×
pcr mix 12.5μl，模版cdna 2μl，上下游引物(25μm)各1μl，ddh2o 8.5μl；扩增程序如下：95℃预变性3min；94℃变性40s，64℃退火40s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min。7.一种含有编码如权利要求1或2或3所述牛源抗金黄色葡萄球菌lukd毒力因子的单链抗体基因的载体，其特征在于，所述载体为噬菌粒载体。8.一种由权利要求7所述载体转化的宿主细胞。9.一种制备如权利要求1或2或3所述牛源抗金黄色葡萄球菌lukd毒力因子的单链抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采用rt
‑
pcr直接从患奶牛乳腺炎的外周血单个核细胞rna中扩增出牛抗体编码基因的重链可变区基因和轻链可变区基因；(2)利用soe
‑
pcr法将中间连接肽linker与重链可变区vh基因和轻链可变区vl基因相连构建牛源性单链抗体基因，其重组连接顺序是vl
‑
linker
‑
vh；(3)将步骤(2)的牛源性单链抗体基因克隆到噬菌粒载体pcantab5e中，构建重组质粒；
(4)将步骤(3)的重组质粒转化入大肠杆菌，培养并用辅助噬菌体扩增建立初级单链抗体文库；(5)用金黄色葡萄球菌双组分杀白细胞素luked的f组分lukd作为包被抗原，富集淘选3
‑
5轮，得到克隆；(6)采用phage elisa，用金黄色葡萄球菌双组分杀白细胞素luked的f组分lukd作为包被抗原，筛选阳性克隆；(7)将步骤(6)筛选得到的阳性克隆酶切，此时的酶切位点是ecori和xhoi，所用引物为：vl
‑
ecori
‑
f：ccggaattcatggcccaggctgtgctgactcag，vh
‑
xhoi
‑
r：ccgctcgagactagtggaggagacggtgac，这个过程是先连接在pcantab5e载体，再连接在pgex
‑
4t
‑
1，14
‑
16℃连接过夜；连接产物转化dh5α感受态细胞后，挑取第一单克隆，对第一单克隆的菌落pcr扩增和提取第一质粒；第一单克隆的菌落pcr扩增产物和第一质粒分别经双酶切验证，对于经验证连接正确的第一单克隆进行测序，得到测序正确的第一单克隆；(8)将步骤(7)得到的测序正确的第一单克隆的重组质粒进行提取，获得第一重组质粒，将第一重组质粒转化到bl21感受态细胞后，挑取第二单克隆，对第二单克隆的菌落pcr扩增和提取第二质粒；第二单克隆的菌落pcr扩增产物和第二质粒分别经双酶切验证，对于经验证正确的第二单克隆进行测序，得到测序正确的第二单克隆；测序正确的第二单克隆中提取的质粒为构建成的单链抗体原核表达质粒pgex
‑
4t
‑1‑
scfv，将第二单克隆菌落pgex
‑
4t
‑1‑
scfv
‑
bl21传代纯化，保存备用；(9)将步骤(8)构建成单链抗体原核表达质粒的菌株pgex
‑
4t
‑1‑
scfv
‑
bl21进行培养，当细菌od值为0.4
‑
0.6时，加入蛋白质诱导剂iptg，进行诱导表达16
‑
20h，之后对单链抗体蛋白进行纯化。10.一种如权利要求1或2或3所述牛源抗金黄色葡萄球菌lukd毒力因子的单链抗体的应用，其特征在于，所述牛源抗金黄色葡萄球菌lukd毒力因子的单链抗体在制备治疗抗金黄色葡萄球菌引起的奶牛乳腺炎的药物中的应用。

技术总结
本发明涉及一种牛源抗金黄色葡萄球菌LukD毒力因子的单链抗体及其制备和应用，具体包括牛源抗金黄色葡萄球菌LukD毒力因子的单链抗体、筛选该单链抗体的载体和宿主细胞、该单链抗体的制备方法以及该单链抗体的用途。原核表达单链抗体，至少具有如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的轻链可变区、如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的重链可变区和位于轻链可变区与重链可变区之间的中间连接肽。与现有技术相比，本发明牛源抗金黄色葡萄球菌LukD毒力因子的单链抗体能够特异性的结合金葡菌LukD蛋白，抑制LukED对牛乳腺上皮细胞的膜裂解作用，从而减弱金葡菌对牛乳腺上皮细胞的粘附和损伤，具有一定的抑制金葡菌对乳腺损伤的功能。具有一定的抑制金葡菌对乳腺损伤的功能。具有一定的抑制金葡菌对乳腺损伤的功能。


技术研发人员：朱建国 张蕾 王凤青 程曼玲
受保护的技术使用者：上海交通大学
技术研发日：2021.07.07
技术公布日：2021/10/11