马铃薯黑痣病菌快速检测体系的建立及其应用的制作方法

cytology of rhizoctonia solani.in:parmeter j r.(ed)rhizoctonia solani:biology andpathology.berkeley,ca,university of california press,pp 32～51.)。相关研究发现，很少轮作或不轮作的土地，丝核菌的存活数量会加大(曹春梅,李文刚,张建平,张庆平,郭景山.2009.马铃薯黑痣病的研究现状.中国马铃薯,23(03):171-173.)，并且土壤中菌核量直接影响马铃薯黑痣病的发病率和发生程度。因此，针对黑痣病菌建立种薯、带菌土壤快速检测体系具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种马铃薯黑痣病菌快速检测体系的建立及其应用。
5.第一方面，本发明要求保护用于检测立枯丝核菌ag-3融合群的引物对。
6.本发明所要求保护的用于检测立枯丝核菌ag-3融合群的引物对，可为如下任一：
7.(a1)由seq id no.1所示的单链dna和seq id no.2所示的单链dna组成的引物对；
8.(a2)由将seq id no.1和seq id no.2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条单链dna分子组成的，且与(a1)中所述引物对功能相同的引物对。
9.第二方面，本发明要求保护用于检测立枯丝核菌ag-3融合群的试剂。
10.本发明所要求保护的用于检测立枯丝核菌ag-3融合群的试剂，可包括前文所述的引物对、sybr green i实时荧光定量pcr扩增缓冲液和dd h2o。
11.其中，所述sybr green i实时荧光定量pcr扩增缓冲液，可包括dntps、mg
2
、sybr green i、taq dna聚合酶。
12.更进一步地，所述试剂中还可含有参比染料。
13.在本发明的具体实施方式中，所述参比染料具体为rox参比染料(rox reference dye)。
14.第三方面，本发明要求保护用于检测立枯丝核菌ag-3融合群的试剂盒。
15.本发明所要求保护的用于检测立枯丝核菌ag-3融合群的试剂盒，可含有下述(b1)和(b2)：
16.(b1)立枯丝核菌ag-3融合群阳性质粒；
17.(b2)前文所述引物对或前文所述的试剂。
18.其中，所述立枯丝核菌ag-3融合群阳性质粒可为含有seq id no.3所示dna片段的质粒。
19.在本发明的具体实施方式中，所述立枯丝核菌ag-3融合群阳性质粒具体为将seq id no.3所示dna片段与pgm-t载体相连后得到的重组质粒。
20.第四方面，本发明要求保护一种检测待测样本中是否含有立枯丝核菌ag-3融合群的方法。
21.本发明所要求保护一种检测待测样本中是否含有立枯丝核菌ag-3融合群的方法，可为如下(c1)或(c2)：
22.(c1)包括如下步骤：从待测样本中提取总dna，作为模板，以前文所述的引物对进行pcr扩增，得到扩增产物；然后按照如下确定所述待测样本中是否含有立枯丝核菌ag-3融合群：如果所述扩增产物中含有191bp的dna片段，则所述待测样本中含有或候选含有立枯
丝核菌ag-3融合群；如果所述扩增产物中不含有191bp的dna片段，则所述待测样本中不含有或候选不含有立枯丝核菌ag-3融合群；
23.(c2)包括如下步骤：从待测样本中提取总dna，作为模板，以前文所述的引物对进行荧光定量pcr扩增；然后根据扩增曲线按照如下确定所述待测样本中是否含有立枯丝核菌ag-3融合群：如果所得扩增曲线为s型或j型曲线，则所述待测样本中含有或候选含有立枯丝核菌ag-3融合群；如果所得扩增曲线为一条直线，则所述待测样本中不含有或候选不含有立枯丝核菌ag-3融合群。
24.在所述(c1)中，所述191bp的dna片段具体为seq id no.3所示dna片段。
25.进一步地，所述待测样本可为植物样本或环境样本。所述植物样本如来自于马铃薯的组织样本。所述环境样本如土壤。
26.第五方面，本发明要求保护一种检测待测土壤中立枯丝核菌ag-3融合群的菌核含量的方法。
27.本发明所要求保护的检测待测土壤中立枯丝核菌ag-3融合群的菌核密度的方法，可包括如下步骤：
28.(d1)将系列已知质量的立枯丝核菌ag-3融合群的菌核与土壤混合，得到系列立枯丝核菌ag-3融合群的菌核密度已知的土壤样本，以从各土壤样本中提取的总dna分别作为模板，以前文所述的引物对进行荧光定量pcr扩增，绘制荧光定量pcr标准曲线(横坐标为土壤中立枯丝核菌ag-3融合群的菌核密度的对数，纵坐标为ct值)；
29.(d2)从待测土壤样本中提取总dna，作为模板，以前文所述的引物对进行荧光定量pcr扩增(与步骤(d1)同条件)；然后根据步骤(d1)所绘制的荧光定量pcr标准曲线得出所述待测土壤样本中立枯丝核菌ag-3融合群的菌核密度。
30.其中，步骤(d2)中，具体是按照如下方法得出所述待测土壤样本中立枯丝核菌ag-3融合群的菌核密度的：将所述待测土壤样本的ct值代入步骤(d1)所绘制的荧光定量pcr标准曲线，从而获得所述待测土壤样本中立枯丝核菌ag-3融合群的菌核密度。
31.在本发明的具体实施方式中，所述荧光定量pcr具体为sybr green i实时荧光定量pcr。
32.在第四方面和第五方面中，所述pcr扩增和所述荧光定量pcr扩增的退火温度均具体可为55℃或60℃。
33.第六方面，本发明要求保护如下任一应用：
34.(e1)前文所述的引物对在制备前文所述试剂或前文所述试剂盒中的应用。
35.(e2)前文所述的引物对或前文所述的试剂或前文所述的试剂盒在检测立枯丝核菌ag-3融合群中的应用，或者在制备用于检测立枯丝核菌ag-3融合群的产品中的应用。
36.(e3)前文所述的引物对或前文所述的试剂或前文所述的试剂盒或前文所述的方法在对马铃薯黑痣病进行早期预测预报中的应用。
37.其中，所述检测立枯丝核菌ag-3融合群可为定性检测，也可为定量检测。
38.本发明基于立枯丝核菌ag-3 tef的保守区，设计可应用于普通pcr和实时荧光定量pcr的用于检测立枯丝核菌ag-3融合群的特异性引物，建立简单快速、灵敏度高、准确可靠的检测体系，以期对种薯带菌及土壤带菌起到早期监测的预警作用，为防治马铃薯黑痣病提供技术依据。
附图说明
39.图1为引物tef3/tef7特异性检测(普通pcr)。m：marker；1：ag-3；2：马铃薯黑痣菌(表1)；3：粉痂菌；4：灰葡萄孢菌；5：刺盘孢菌；6：镰刀菌；7：大丽轮枝菌；8：核盘菌；9：茄匍柄霉菌；10：疫霉菌；11：多主棒孢菌；12：链格孢菌；13：ag-5；14：ag-6；15：ag2-1；16：ag1-ib；17：ag-a；18：ag-4；19：ag2-2 iv；20：ag-bi；n：ddh2o。
40.图2为引物tef3/tef7特异性检测(实时荧光定量pcr，熔解曲线)。
41.图3为引物tef3/tef7特异性检测(实时荧光定量pcr，扩增曲线)。
42.图4为实时荧光定量pcr标准曲线。质粒浓度从左向右分别为1.95
×
107fg/μl—1.95
×
10fg/μl。
43.图5为普通pcr引物灵敏性检测。m：dna marker；1-10：质粒浓度从左向右分别为1.95
×
107fg/μl—1.95
×
10-2
fg/μl；n：ddh2o。
44.图6为荧光定量pcr引物灵敏度检测扩增曲线。
45.图7为引物tef3/tef7普通pcr检测疑似黑痣病薯。m：dna marker；1-18：疑似黑痣病薯dna；n：ddh2o。
46.图8为引物tef3/tef7 rt-qpcr检测疑似黑痣病。
47.图9为ct值与土壤中菌核密度对数转化值的关系曲线。
具体实施方式
48.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
49.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
50.实施例1、马铃薯黑痣病菌快速检测体系的建立及其应用
51.一、材料
52.供试菌株和材料：引物特异性检测所用非靶标菌株共11株，马铃薯黑痣病菌为靶标菌株(表1)，由中国农业科学院蔬菜花卉研究所提供。立枯丝核菌融合群标准菌株ag-3、ag-5、ag-6、ag2-1、ag2-2 iv、ag-bi、ag1-ib、ag-4、ag-a(记载于如下各文献中，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用，不得他用。李晓妮,徐娜娜,于金凤.2014.中国北方马铃薯黑痣病立枯丝核菌的融合群鉴定.菌物学报,033(003),584-593.舒灿伟,曹琦琦,赵美,江绍锋,周而勋.2017.立枯丝核菌不同融合群g蛋白β亚基基因克隆与分子进化分析.华北农学报(05),11-16.黄江华,杨媚,周而勋,戚佩坤.2008.13种植物丝核菌对水稻、甜玉米、黄瓜和甘蓝的交互致病性.华中农业大学学报(02),38-43.井岩,李晓妮,于金凤.2012.中国北方棉花主产区立枯丝核菌的融合群鉴定.菌物学报,31(4),540-547.黄江华,杨媚,周而勋,戚佩坤.2002.广州地区10种作物立枯丝核菌菌丝融合群测定[j].仲恺农业技术学院学报,2002,15(1):14-18.)。疑似马铃薯黑痣病薯采自中国河北沽源(表2)。
[0053]
pda培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15～25g，蒸馏水1000ml。
[0054]
表1 引物特异性检测供试菌株
[0055][0056][0057]
表2 疑似马铃薯黑痣病薯信息
[0058]
病薯编号采集地病薯编号采集地mls1809082801中国河北沽源mls1809082810中国河北沽源mls1809082802中国河北沽源mls1809082811中国河北沽源mls1809082803中国河北沽源mls1809082812中国河北沽源mls1809082804中国河北沽源mls1809082813中国河北沽源mls1809082805中国河北沽源mls1809082814中国河北沽源mls1809082806中国河北沽源mls1809082815中国河北沽源mls1809082807中国河北沽源mls1809082816中国河北沽源mls1809082808中国河北沽源mls1809082817中国河北沽源mls1809082809中国河北沽源mls1809082818中国河北沽源
[0059]
二、方法
[0060]
1、菌株培养与dna的提取
[0061]
从供试菌株斜面上挑取琼脂块，转接至pda平板中，25℃下培养3d。待菌丝长满pda平板，刮取菌丝至1ml离心管，使用真菌基因组dna提取试剂盒(天根，北京)进行菌丝dna提取，置于-20℃下冰箱存用。
[0062]
刮取马铃薯黑痣病斑组织至1ml离心管，利用真菌基因组dna提取试剂盒(天根，北京)进行病斑组织dna提取，置于-20℃冰箱中备用。
[0063]
2、引物设计
[0064]
从ncbi网站下载立枯丝核菌ag-3融合群及立枯丝核菌其他融合群的tef基因序列(表3)，使mega6.0软件进行序列同源性比对，分析序列差异，选取立枯丝核菌ag-3融合群tef基因保守区域，设计了立枯丝核菌ag-3融合群特异性引物tef3和tef7。
[0065]
tef3：5
’-
cgatactgataatatgatg-3’(seq id no.1)；
[0066]
tef7：5
’-
agcgtaaacctcaatgtggg-3’(seq id no.2)。
[0067]
扩增产物大小为191bp(seq id no.3)。引物由北京博迈德基因公司合成。
[0068]
表3 马铃薯黑痣病菌及立枯丝核菌其他融合群的基因序列信息
[0069][0070][0071]
3、引物特异性检测
[0072]
(1)普通pcr特异性检测
[0073]
利用引物tef3/tef7扩增马铃薯黑痣病菌(表1中的黑痣菌mls18110601，用采集自内蒙古的马铃薯病薯分离获得的立枯丝核菌ag3菌株)、ag-3和18个非靶标菌株(见表1中马铃薯黑痣病菌外的其他10种菌，以及立枯丝核菌融合群标准菌株ag-5、ag-6、ag2-1、ag1-ib、ag-a、ag-4、ag2-2 iiib和ag-bi)基因组dna。pcr反应体系(50μl)为：引物tef3/tef7(0.1μmol
·
μl-1
)0.5μl，2
×
taq pcr master mix(博迈德，北京)25μl，模板dna(10ng
·
μl-1
)0.5μl，ddh2o 23.5μl。pcr扩增条件为94℃预变性5min；94℃变性45s，55℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃补充延伸10min。使用1％琼脂糖凝胶电泳(110v，40min)检测pcr扩增产物。
[0074]
如果扩增出191bp的目的dna片段(seq id no.3)，则待测样本为立枯丝核菌ag-3融合群；如果没有扩增出191bp的目的dna片段(seq id no.3)，则待测样本不是立枯丝核菌ag-3融合群。
[0075]
(2)实时荧光定量pcr特异性检测
[0076]
利用tef3/tef7引物扩增马铃薯黑痣病菌(表1中的黑痣菌mls18110601，用采集自内蒙古的马铃薯病薯分离获得的立枯丝核菌ag3菌株)、ag-3和18个非靶标菌株(见表1中马铃薯黑痣病菌外的其他10种菌，以及立枯丝核菌融合群标准菌株ag-5、ag-6、ag2-1、ag1-ib、ag-a、ag-4、ag2-2 iiib和ag-bi)基因组dna，进行实时荧光定量pcr。反应体系(20μl)为：引物(0.1μmol
·
μl-1
)0.5μl，2
×
superrealpremix plus(内含dntp mixture，mg
2
，sybr greenⅰ和taq dna聚合酶)(天根，北京)10μl，50
×
rox reference dye(天根，北京)0.4μl，模板dna(10ng
·
μl-1
)0.5μl，ddh2o 8.1μl。实时荧光定量pcr反应条件为95℃预变性15min，95℃变性10s，60℃退火32s，40个循环。
[0077]
如果实时荧光定量pcr所得扩增曲线为s型或j型曲线，则待测样本为立枯丝核菌ag-3融合群；如果实时荧光定量pcr所得扩增曲线为一条直线，则待测样本不是立枯丝核菌
ag-3融合群。
[0078]
4、标准质粒的制备
[0079]
采用普通离心柱型琼脂糖凝胶dna回收试剂盒(天根，北京)对pcr扩增产物进行回收纯化。将凝胶回收的191bp的dna片段(seq id no.3)与pgm-t克隆载体(天根，北京)连接，导入大肠杆菌trans1-t1(天根，北京)感受态进行热激转化。分别取300μl、200μl、100μl菌液在含有100g
·
ml-1
氨苄青霉素的lb固体平板培养基上涂板，晾干后，置于37℃恒温培养室培养24h，随机挑取10个白色的单菌落，使用含100g
·
ml-1
的氨苄青霉素lb液体培养基摇菌，将其置于37℃恒温摇床振荡培养。经普通pcr验证为阳性克隆后，送至北京博迈德生物公司测序。
[0080]
最终所得标准质粒为将seq id no.3所示191bp的dna片段与pgm-t载体相连后得到的重组质粒。
[0081]
5、标准曲线的建立
[0082]
将马铃薯黑痣菌的标准质粒(步骤4构建)以10倍梯度稀释，共7个浓度，建立实时荧光定量pcr标准曲线。实时荧光定量pcr反应体系(20μl)为：引物tef3/tef7(0.1μmol
·
μl-1
)0.5μl，2
×
superrealpremix plus(内含dntp mixture，mg
2
，sybr greenⅰ和taq dna聚合酶)(天根，北京)10μl，50
×
rox reference dye(天根，北京)0.4μl，模板dna(10ng
·
μl-1
)0.5μl，ddh2o 8.1μl。实时荧光定量pcr反应条件为95℃预变性15min，95℃变性10s，60℃退火32s，40个循环。以质粒dna拷贝数的对数值为横坐标，循环数ct值为纵坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程。
[0083]
6、引物灵敏性检测
[0084]
使用thermo scientific nanodrop 2000c紫外分光光度计，测定马铃薯黑痣菌的标准质粒(步骤4构建)dna的浓度为1.95
×
108fg/μl-1
，再以10倍梯度稀释10个浓度(1.95
×
107fg
·
μl-1-1.95
×
10-2
fg
·
μl-1
)，分别进行普通pcr和实时荧光定量pcr扩增(具体方法见前文)，检测其灵敏性。
[0085]
7、实时荧光定量pcr体系重复性评价
[0086]
采用nanodrop 2000(thermo scientific，usa)测定马铃薯黑痣菌的标准质粒(步骤4构建)dna浓度，利用计算公式算出拷贝数浓度，拷贝数浓度(copies/μl)＝(6.02
×
10
23
copies/mol)
×
(浓度g/μl)/(mw g/mol)，平均分子量(mw g/mol)＝碱基数(bp)
×
(650daltons/bp)。以10倍梯度稀释质粒，5个浓度为0.91
×
10
1-0.91
×
105copies/μl，每个浓度重复3次，在相同的扩增条件下进行qpcr(具体方法见前文)，计算变异系数，评价重复性。
[0087]
8、马铃薯黑痣病薯检测
[0088]
刮取18份疑似马铃薯黑痣病薯(表2)的病斑至1ml离心管，提取病斑组织的总dna，以ddh2o为阴性对照，利用tef3/tef7特异性引物进行普通pcr和实时荧光定量pcr检测(具体方法见前文)。
[0089]
9、土壤中菌核量与ct值之间的关系
[0090]
根据文献报道(ritchie f,bain r,mcquilken m.2013.survival of sclerotia ofrhizoctonia solani ag3 pt and effect of soil-borne inoculum density on disease development on potato.journal of phytopathology,161(3):180-189.)的方
法收集菌核，称取质量为0、5、10、50、100和500mg的立枯丝核菌ag-3融合群的菌核分别加入1kg无菌土中，充分混匀后，每个处理称取100g，重复3次。利用水筛qpcr法(申永铭,郭成瑾,王喜刚,沈瑞清,陈爱昌,胡小平.2017.土壤中立枯丝核菌ag-3菌核的荧光定量pcr快速检测.菌物学报,36(10):1383-1391.)分析(其中qpcr的具体方法见前文)。
[0091]
将所有的土壤样品dna进行qpcr检测，以土壤中菌核密度(g
·
g-1
土)的对数(x)和对应的ct值(y)建立曲线关系。
[0092]
将每个样品重复3次测得的ct值算出标准差，判断其检测值是否紧密的分散在真实值周围，以此检测准确性(申永铭,郭成瑾,王喜刚,沈瑞清,陈爱昌,胡小平.2017.土壤中立枯丝核菌ag-3菌核的荧光定量pcr快速检测.菌物学报,36(10):1383-1391.)。
[0093]
三、结果与分析
[0094]
1、引物pcr特异性检测
[0095]
(1)普通pcr特异性检测
[0096]
利用tef3/tef7引物对马铃薯黑痣菌、ag-3和18个非靶标菌株基因组dna进行普通pcr扩增，以ag-3基因组dna为阳性对照，ddh2o为阴性对照，结果表明：仅有ag-3、马铃薯黑痣菌(表1)基因组dna扩增出单一明亮的目的片段(seq id no.3所示的191bp目的片段)，非靶标菌株dna均未扩增出目标条带(seq id no.3所示的191bp目的片段)，说明该引物特异性良好，可以应用于马铃薯黑痣病原菌的检测(图1)。
[0097]
(2)实时荧光定量pcr特异性检测
[0098]
以ddh2o为阴性对照，利用tef3/tef7引物扩增马铃薯黑痣病菌、ag-3和18个非靶标菌株基因组dna，进行实时荧光定量pcr特异性检测。结果表明：实时荧光定量pcr的熔解曲线马铃薯黑痣病菌和ag-3样本呈单峰，无非特异性扩增，扩增曲线马铃薯黑痣病菌和ag-3样本呈s型或j型曲线，而其他样本呈一条直线。说明该引物特异性良好(图2、图3)。
[0099]
2、标准曲线的建立
[0100]
使用引物tef3/tef7对马铃薯黑痣病菌基因组dna进行pcr扩增后，对扩增产物进行回收纯化，连接t载体并进行感受态热激转化，获得阳性重组菌落，提取阳性质粒dna，以10倍梯度稀释阳性重组质粒，质粒dna拷贝数的对数值为横坐标，循环数ct值为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程为y＝-3.8707x 33.733，相关系数r2＝0.9931，该体系线性关系良好(图4)。
[0101]
3、引物灵敏性检测
[0102]
将初始浓度为1.95
×
107fg
·
μl-1-1.95
×
10-2
fg
·
μl-1
的质粒dna分别进行普通pcr和实时荧光定量pcr扩增。结果表明：质粒dna浓度低于1.95
×
104fg
·
μl-1
时，无扩增条带，即普通pcr检测浓度最低限度为1.95
×
104fg
·
μl-1
(图5)。当质粒dna浓度为19.5fg
·
μl-1
时，实时荧光定量pcr检测仍有扩增，即qpcr检测下限为19.5fg
·
μl-1
(图6)，因此qpcr灵敏性是普通pcr的1000倍。
[0103]
4、实时荧光定量pcr体系重复性评价
[0104]
以10倍梯度稀释质粒，共5个浓度，分别为0.91
×
101–
0.91
×
105copies/μl，每个浓度重复3次，ct值的平均值分别为34.32、32.16、29.31、26.94、24.82，变异系数分别为1.05％、0.72％、1.88％、1.08％和1.69％，均小于2％，说明该检测体系具有良好的重复性(表4)。
[0105]
表4 实时荧光定量pcr体系重复性评价
[0106]
质粒标准品浓度(copies/μl)平均ct值标准差(n＝3)变异系数(％)0.91
×
10524.820.421.690.91
×
10426.940.291.080.91
×
10329.310.551.880.91
×
10232.160.230.720.91
×
10134.320.361.05
[0107]
5、马铃薯黑痣病薯检测
[0108]
利用tef3/tef7特异性引物，对18份马铃薯黑痣病病薯dna进行扩增，将扩增产物分别进行普通pcr和rt-qpcr检测，并以ddh2o为阴性对照。检测结果表明：阴性对照均无扩增，并且两种检测方法的检出率均为100％(图7、图8)。
[0109]
6、土壤中菌核量与ct值之间的关系
[0110]
采用水筛qpcr法检测人工模拟不同带菌核量的土壤，以土壤中菌核密度(g
·
g-1
土)的对数(x)和对应的ct值(y)建立带菌土壤和ct值的曲线关系，结果显示其曲线关系为y＝-3.9819x 12.687，r2＝0.986，呈良好的线性关系，通过土壤dna大量提取法构建了土壤中立枯丝核菌ag3菌核的qpcr检测体系，当人工模拟带菌核量小于5
×
10-7
g
·
g-1
土时，ct值大于35，证明人工模拟带菌量的检测下限为5
×
10-6
g
·
g-1
土(图9)。
[0111]
四、讨论
[0112]
马铃薯黑痣病(rhizoctonia solanik
ü
hn)又称立枯丝核菌病，在世界各地均有发生，每年造成大量的经济损失，为各马铃薯主要生产国种薯检测和控制性病害之一。马铃薯黑痣病是通过带病种薯和土壤传播的病害，病菌可在土壤中存活2～3年。随着中国马铃薯种植面积的进一步扩大，马铃薯黑痣病的发生逐年加重。在内蒙古、黑龙江一些地区，重病田病株率可达80％以上，收获后薯块带菌率最高可达100％。因此，建立灵敏、可靠的病原菌快速检测技术是非疫区病害预警监测与有效防控的技术保证。
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目前，中国对于马铃薯黑痣病的检测和诊断，已报道的检测土壤中立枯丝核菌的方法有：选择性培养基计数法、诱饵法、酶联免疫分析等方法，而选择性培养基计数法、诱饵法、酶联免疫分析等方法因操作复杂、结果不准确、成本高，未能普及应用。本研究通过比对立枯丝核菌各融合群tef的基因序列，在立枯丝核菌融合群ag-3tef的保守区中设计了引物tef3/tef7，扩增大小为191bp，对马铃薯黑痣菌dna检测下限为19.5fg
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μl-1
，实时荧光定量pcr灵敏度比普通pcr灵敏度高1000倍。
[0114]
本发明通过人工模拟不同带菌核量的土壤，结合水筛法提取土壤dna，进行实时荧光定量pcr检测，建立土壤中不同的菌核含量和ct值的曲线关系。通过检测，发现人工模拟带菌量的检测下限为5
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g
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g-1
土，而前期国外研究报道中，lees(lees a k,cullen d w,sullivan l,nicolson m j.2002.development of a pcr assay for the detection and identification of rhizoctonia solani ag-3in potato and soil.plant pathology,51(3):293-302.)建立的qpcr体系的检测下限为5
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g-1
土，其灵敏度远低于本发明中qpcr检测体系。因此，本发明建立的马铃薯黑痣菌的快速检测体系更灵敏，可针对不同样品量的检测需求，采用对应的pcr检测方法。