一种改良番茄对青枯病抗性的方法与流程

1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种改良番茄对青枯病抗性的方法。


背景技术：

2.番茄，茄科茄属，是一种重要的蔬菜和经济作物，在全世界范围内广泛种植。番茄果实营养丰富，口感鲜美，广受喜爱。然而，近年来，随着农业种植方式的改变，单一且高密度的种植模式，使得番茄病害爆发日益严重，严重影响产量和品质。
3.青枯病是其中一种高发病害，由茄科劳尔氏菌(ralstonia solanacearum)引发。青枯菌是一种土壤习居菌，可以在土壤中生活很长一段时间，在田间主要通过雨水和灌溉水传播，也可以通过人畜、农具、带菌土壤、昆虫和线虫等方式传播，从而引起重复侵染，导致青枯病的流行蔓延。青枯菌主要从植株根部或茎部的伤口侵入，在植株体内的维管束组织中繁殖并进行新陈代谢活动，造成导管堵塞，从而阻止植物体内的养分运输并最终导致植株萎蔫死亡。番茄一旦感染青枯病，可导致减产甚至绝收，危害极大。
4.钙依赖性蛋白激酶(calcium
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dependent protein kinase，cdpk)是一种钙离子依赖型蛋白激酶，属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，由一个蛋白激酶域、一个自我抑制结构域和一个类cam结构域组成(ludwig a a等，“cdpk
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mediated signaling pathways:specificityand cross
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talk.”journal of experimental botany,2004,55(395):181
‑
188)。
5.前人研究表明，cdpks参与到多种生物及非生物胁迫相关的信号通路中，且作用机制各不相同。例如，拟南芥cpk3和cpk13通过调控热激转录因子hsfb2a激活pdf1.2的转录，从而增强植物对食草昆虫的抗性(kanchiswamy c.n.等，“regulation of arabidopsis defense responses against spodopteralittoralis by cpk
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mediated calcium signaling.”bmc plant biology,2010,10:97)。在冷害和盐害/干旱的胁迫下，水稻cdpk7基因的表达量上升。增加cdpk7的含量能够提高水稻对冷害和盐害/干旱的抗性。在盐害/干旱的胁迫下，过表达植株抗性相关的基因表达量显著高于对照，而在冷害的胁迫下则没有这一现象出现，说明cdpk7对冷害和盐害/干旱的抗性机制通过两条独立的途径展开(saijo y等，“overexpression of a single ca
2
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dependent protein kinase confers both cold and salt/drought tolerance on rice plants.”the plant journal,2000,23:319
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327)。拟南芥cpk23则负调控抗逆性，拟南芥cpk23基因突变后拟南芥对干旱的抗性显著提高。过表达cpk23后拟南芥的气孔导度变大，从而影响其对干旱的抗性(ma sy,wu wh.“atcpk23 functions in arabidopsis responses to drought and salt stresses.”plant molecular biology,2007,65:511
‑
518)。
6.番茄cdpk18l作为cdpks家族中的一员，鲜有其在生物抗性中的研究。因此，研究番茄cdpk18l基因应对青枯病的抗性机制具有理论和实际应用价值。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种可调控番茄对抗青枯病害的基因，通过基因改造达到改良番茄对青枯病抗性的目的。
8.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
9.本发明首先对番茄钙离子依赖型蛋白激酶cdpk18l(基因编号：xm_004232444)进行序列分析，查找pam序列，将ngg前的20个bp的序列定义为sgrna，选择定位于基因蛋白编码区上且具有高度特异性的sgrna序列，进而利用基因编辑技术，对番茄cdpk18l基因进行编辑，获得功能缺陷型突变的纯合株系，该植株表现出对青枯病的抗性显著增强，表明cdpk18l基因的沉默在改良番茄对青枯病抗性方面具有一定应用价值。
10.本发明提供了核苷酸序列如seq id no.1所示的cdpk18l基因在提高番茄抗青枯病中的应用。
11.cdpk18l基因的蛋白编码区的核苷酸序列如seq id no.1所示，长度为1713bp，全基因dna序列如seq id no.6所示。
12.cdpk18l基因编码的蛋白为钙离子依赖型蛋白激酶，由570个氨基酸组成，其序列如seq id no.2所示，属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，由一个蛋白激酶域、一个自我抑制结构域和一个类cam结构域组成，当与钙离子结合时，该蛋白被激活。
13.所述应用包括：利用基因编辑技术沉默番茄cdpk18l基因编码蛋白的表达，进而获得抗青枯病性能增强的番茄突变体。
14.进一步的，利用crispr/cas9技术对番茄cdpk18l基因进行沉默。crispr/cas9基因编辑技术能够精准敲除基因组中的任何基因，从而精确的改变农作物性状，快速获得理想种质，大大缩短育种时间。同时，相比于转基因育种，利用crispr/cas9基因编辑技术进行育种可以不引入外源基因。在利用crispr/cas9技术进行基因组编辑之后，植株可以通过自交筛选出目标基因发生编辑且不含cas9的株系，可在很多情况下避免使用颇具争议性引入外源基因的转基因技术。
15.本发明还提供了两个抗青枯病性能增强的番茄突变体，所述番茄突变体的编码基因的序列为如seq id no.1所示核苷酸序列中第70和71位碱基缺失；另一个突变体的编码基因序列为如seq id no.1所示核苷酸序列中第70位的碱基缺失。
16.本发明通过测定番茄体内游离态氨基酸含量发现，cdpk18l基因突变体植株内的游离态氨基酸含量明显上升。推测cdpk18l基因通过影响植物体内游离态氨基酸的含量，调控番茄青枯病的抗性。所述调控是指cdpk18l通过影响植物体内游离态氨基酸含量，改变植物体内的氮代谢过程，削弱植物对青枯病的抗性。
17.本发明还提供了一种改良番茄对青枯病抗性的育种方法，包括：
18.(1)在核苷酸序列如seq id no.1所示的cdpk18l蛋白编码区选取含有pam结构的靶标片段，以靶标片段pam结构前20个碱基为依据，进行引物设计，构建cripr/cas9载体；
19.(2)将cripr/cas9载体转化受体番茄材料中，培育，获得不含外源cas9蛋白且稳定遗传的纯合突变体株系。
20.所述pam结构为ngg，n代表任意碱基。
21.进一步的，所述靶标片段pam结构前20个碱基序列为如seq id no.3所示，定义为sgrna。
22.步骤(1)中，构建所述cripr/cas9载体的引物的核苷酸序列如seq id no.4和seq id no.5所示。将上述引物退火成双链，构建cripr/cas9载体。
23.步骤(2)中，利用农杆菌介导技术将cripr/cas9载体转化至番茄子叶中。
24.具体的，所述受体番茄为番茄condine red。
25.本发明具有以下有益效果：
26.本发明利用crispr/cas9基因编辑技术获得番茄cdpk18l基因编辑突变体，该突变体能够显著增强对番茄青枯病的抗性，可用于抗青枯病番茄品种的选育。
附图说明
27.图1为实施例2中获得的t1代突变体植株的基因编辑位点；
28.与未经过基因编辑的普通番茄相比，基因编辑突变体在sgrna的位置发生碱基缺失，以下将未经过基因编辑的普通番茄称为对照，cdpk18l#1相较对照缺失两个碱基，cdpk18l#2相较对照缺失一个碱基。
29.图2为实施例3中对照和cdpk18l基因突变型番茄接种青枯菌后的病情指数柱形图；
30.其中，发病越严重，病情指数越高；对照植株病情指数显著高于突变体植株；小写字母a、b代表不同植株之间在5％水平上的差异显著。
31.图3为实施例3中对照和cdpk18l基因突变型番茄接种青枯菌后的发病植株图；
32.其中，叶片萎蔫程度越高，表示发病越严重。
33.图4为实施例4中cdpk18l基因突变型和对照番茄体内的游离态氨基酸含量变化。
具体实施方式
34.下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。若未特别指明，实施例中所用的技术手段均为本领域技术人所熟知，所用原料、试剂盒均为市售商品。
35.下述实施例中采用的番茄品种为番茄常规品种cr(condine red)，将未经基因编辑的普通番茄作为对照。
36.实施例1含特异sgrna的crispr/cas9载体的构建
37.在ncbi网站https://www.ncbi.nlm.nih.gov/上找到cdpk18l(xm_004232444)的dna序列，其序列如seq id no.6所示，输入http://crispr.hzau.edu.cn/cgi
‑
bin/crispr2/crispr网站，找出onscore得分高，且gc含量>40％，位于蛋白编码区的一段pam结构前的20bp碱基序列cacggcggcggtatttgtgg(seq id no.3)。
38.设计crispr引物，如下所示：
39.crispr前引物(seq id no.4):gattgcacggcggcggtatttgtgg；
40.crispr后引物(seq id no.5):aaacccacaaataccgccgccgtgc；
41.取上述crispr前引物和后引物各5μl，混匀后用pcr仪退火成双链。中间载体pmd18
‑
t经bbsi单酶切，普通dna纯化试剂盒纯化后，将双链与载体用t4连接酶连接，16℃连接过夜。42℃热击转化涂板，抗性为氨苄青霉素。
42.挑单克隆菌落，用crispr前引物(seq id no.4)：gattgcacggcggcggtatttgtgg和
载体后引物(seq id no.7)：ctacttatcgtcatcgtctttg，进行pcr验证。
43.将条带大小正确的菌液送至测序公司测序，测序结果显示载体包含sgrna序列，提质粒，经hind iii与kpn i双酶切后，连接至终载体pcambia1301上。再次测序结果显示终载体包含sgrna，将所得最终质粒电击入gv3101农杆菌感受态，28℃培养两天后挑斑进行pcr验证，获得可用于构建其crispr/cas9基因编辑材料的农杆菌菌株。
44.实施例2 cdpk18l基因突变体材料制备与鉴定
45.在播种培养基播种已消毒的番茄种子，7天后切子叶。农杆菌侵染法将实施例1制备的最终质粒转化入子叶中，利用植物细胞全能性，获得t0代基因编辑番茄。
46.t0代基因编辑番茄苗检测。利用ctab法提取t0代植株的基因组dna并以其为模板，在包含sgrna的dna序列前后约200bp处设计如下引物，进行pcr扩增测序验证：
47.验证前引物(seq id no.8):gagggcttatggttttcttc
48.验证后引物(seq id no.9):caattctcttgacagccaca
49.所得pcr产物送测序公司测序。测序结果与该段基因原序列利用dnaman软件进行比对，选取sgrna序列发生碱基缺失、且测序显示单峰的植株，进行自交繁种，获得t0代的种子。
50.上述t0代种子种植于生长室中，获得t1代植株。利用上述同样方法检测t1代植株的sgrna序列碱基编辑情况。同时，利用crispr前引物(seq id no.4)和载体后引物(seq id no.7)对t1代植株的dna进行pcr扩增，检测是否含有cas9序列。选取sgrna发生变异，且不含cas9蛋白的t1代植株，确定为基因编辑植株的两个株系，分别命名为cdpk18l#1和cdpk18l#2，其基因编辑位点如图1所示。cdpk18l#1相较对照植株缺失两个碱基，cdpk18l#2相较对照植株缺失一个碱基。上述两个株系t1代种子播种后，获得不含外源基因cas9，且sgrna发生变异的稳定遗传的t2代植株。
51.以下实施例均以上述两个纯合株系t2代植株作为材料进行实验。
52.实施例3 cdpk18l基因编辑突变体的抗病性研究
53.青枯菌菌种接种在固体扩繁培养基上，放于28℃恒温培养箱中培养2天后得以活化，作为原板。用移植环从原板中蘸取带粘性且具有流动性的乳白色菌液于新的固体扩繁培养基上，28℃恒温培养箱中培养1天。用无菌水将菌液重悬，并将od
600
调至1.0。将50ml菌液灌入每株番茄根部，并置于25℃，95％空气相对湿度、12小时光照12小时黑暗，光强200μmol m
‑2s
‑1的环境下培养10天后，观察植株发病情况。植株的发病症状分为0、1、2、3、4五个等级，分级标准为：0级，叶片正常没有萎蔫；1级，1％
‑
25％的叶片发生萎蔫；2级，26％
‑
50％的叶片发生萎蔫；3级，51％
‑
75％的叶片发生萎蔫；4级，76％
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100％的叶片发生萎蔫。
54.由图2和图3可知，cdpk18l突变体能够显著提高其对青枯病的抗性。
55.实施例4 cdpk18l突变体和对照番茄体内游离态氨基酸含量测定
56.取一个月苗龄的番茄叶片60mg加入200μl h2o匀浆，加入800μl甲醇乙腈溶液(1:1,v/v)，
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20℃放置1h沉淀蛋白，过滤后14000g离心20min，取上清冷冻干燥，
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80℃保存样品。样品采用agilent 1290infinity lc超高效液相色谱系统进行分离。利用5500qtrap质谱仪(ab sciex)在正离子模式下进行质谱分析，采用mrm模式检测待测离子对。采用multiquant软件提取色谱峰面积及保留时间。利用氨基酸及衍生物的标准品校正保留时间，进行代谢物鉴定。
57.由图4可知，cdpk18l突变体内的游离态氨基酸含量相较对照植株明显升高，体内的氮代谢发生改变。