一种采用尿囊素降低明胶中内毒素的方法与流程

1.本发明涉及医药用明胶技术领域。更具体地，涉及一种采用尿囊素降低明胶中内毒素的方法。


背景技术：

2.明胶是一种由动物的皮和骨中的胶原，经过酸、碱和酶部分水解并经纯化后得到的产物。明胶的传统应用非常广泛，按照应用领域可分为食品添加剂明胶、药用明胶和工业明胶。中国药典2015版明确规定了药用明胶，胶囊用明胶的指标要求，但对于明胶中内毒素中的含量没有规定。
3.作为一种良好的蛋白源，明胶生产过程中的胶液浓度，温度和ph十分适宜革兰氏阴性菌的生长与繁殖。细菌内毒素(bet)的化学结构为脂多糖(lps)，位于革兰氏阴性菌的外膜，它不断被细菌释放到环境中。当革兰氏阴性细菌死亡并溶解时，所有的脂多糖被释放到环境中。当细菌内毒素被注射到哺乳动物(包括人类)体内时，达到一定的阈值，会激活人体防御系统，产生体温升高、呕吐不适、皮肤血管收缩、血压升高、肌肉酸痛，严重者会导致休克和死亡。
4.随着明胶在医学领域的广泛应用，明胶代血浆、明胶止血海绵、明胶缝合线、明胶支架等直接进入血液循环的明胶产品不断投入应用。但文献中少见低内毒素明胶的生产工艺报导。骨明胶生产所用的原料骨中包含一定量的细菌，在生产过程中，高温、化学试剂及灭菌等方法导致细菌死亡，并产生大量内毒素。常规的明胶生产工艺没有内毒素的控制与消除工序。绝大多数明胶的内毒素在1000eu/g以上，部分明胶超过 10000eu/g。细菌内毒素通过口服的形式进入人体时，经过胃肠的消化，对健康人体不会产生毒性。因此当明胶以胶囊或片剂辅料的形式口服经胃肠给药时不必考虑内毒素水平。但当明胶作为注射剂或者与血液、髓鞘直接接触时，内毒素是最为重要的质控指标，必须根据各国药典等相关文件规定低于相应的阈值。内毒素影响细胞在组织工程支架表面的粘附、生长与分化，因此，严格控制植入性医疗器械内毒素指标是确保器械安全的关键。
5.明胶属于大分子蛋白质。通常，对于蛋白质中内毒素的去除方法主要包括非特异性去除法与选择性分离法。非特异性去除法包括干热法，化学法，活性炭吸附法，超滤法和离子交换法，由于明胶在高温、酸性和碱性条件下会发生变性，导致明胶发生交联或者降解，因此干热法和化学法不适用。明胶分子量分布区间与内毒素几乎重叠，因此无法通过超滤法从明胶中分离出内毒素。明胶中包含大量的阴离子基团，如果采用离子交换法，相当一部分明胶会被树脂吸附导致明胶回收率大大降低。选择性去除方法主要指的是亲和色谱法，利用的是物质的生物学特性来达到物质分离的目的，是一种理论上较为理想的内毒素去除方法，该方法的难点在于开发合适的配基，并将其固载与亲和色谱基质上以合成出亲和介质，目前尚不具备规模化制备的能力。有文献利用triton-x114分离琥珀酰明胶中内毒素，但残留的triton-x114具有毒性，很难将其完全去除。
6.因此需要提供一种能够有效降低明胶中内毒素的方法，以扩大明胶的应用范围。


技术实现要素：

7.本发明的一个目的在于提供一种采用尿囊素降低明胶中内毒素的方法，该方法以尿囊素作为内毒素吸附剂，可使明胶中内毒素含量降至200eu/g以下，且该方法可规模化应用。
8.本发明的另一个目的在于提供一种低内毒素明胶在制备可吸收止血海绵、可再生医药、医用辅食等中的应用。
9.为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
10.第一方面，本发明提供一种采用尿囊素降低明胶中内毒素的方法，包括以下步骤：
11.在容器中，将待处理明胶溶于温度保持在45-55℃的水中，调节明胶溶液ph为 4.5-6.0；加入氯化钠，在45-55℃下搅拌10-30min；加入尿囊素，得预处理溶液；在45-55℃下搅拌孵育15-60min，过滤，浓缩，灭菌，干燥，粉碎，得低内毒素明胶颗粒。
12.明胶属于蛋白质，在高温、强酸碱条件下会发生变性或者水解；明胶中包含大量的—cooh、—oh、—nh2等基团，十分容易与内毒素以氢键的方式结合。但与普通的蛋白质相比，明胶具有独特的溶胶凝胶转化性质，通常浓度为10％明胶溶胶的凝胶点在25-30℃之间，对于高冻力明胶，重量浓度为0.5％以上时在室温下主要以凝冻状态存在；明胶的分子量在5kda到几千kda之间，几乎覆盖了内毒素的分子量分布区间，因此从明胶中分离内毒素是十分困难的。
13.待处理明胶中的内毒素含量通常在1000eu/g以上，甚至能够超过10000eu/g，无法与血液、髓鞘直接接触，限制了明胶的应用。本发明提供了降低明胶中内毒素的方法，即采用尿囊素作为内毒素的吸附剂。尿毒素(2,5-二氧基-4-咪唑烷基脲)可通过氢键和电荷作用吸附内毒素，且吸附效果优良，同时尿毒素无毒，具有促进细胞生长、促进伤口愈合等生理功能，常作为生物材料添加剂使用。
14.需要说明的是，由于内毒素的分子量及活性随介质变化而变化，因此本发明中，明胶中内毒素浓度被定义为每克明胶中内毒素单位(eu)。内毒素浓度的测定是以大肠杆菌0113：h10k作为参比，通过鲎试剂显色法测试明胶中内毒素含量。
15.可选地，所述待处理明胶为酸法明胶或碱法明胶；当所述待处理明胶为酸法明胶时，调节明胶溶液ph为5.5-6.0；当所述待处理明胶为碱法明胶时，调节明胶溶液 ph为4.5-4.6。
16.本发明提供的采用尿囊素降低明胶中内毒素的方法，通过调节不同类型明胶溶液的ph，以及加入氯化钠的量和方式，增强内毒素与尿囊素的相互作用，提高分离效率。本发明结合明胶的溶胶凝胶转化特性及热降解特性，将温度控制在45～55℃，即能够使胶液处于液体状态，又能够避免高温下明胶的进一步水解；尿囊素的溶解度为 0.5g/l，过量的尿囊素将以晶体状态存在于明胶溶液中，通过氢键和静电相互作用吸附带负电荷的内毒素。明胶的等电点是影响吸附效率和明胶得率的重要因素，为了防止明胶与尿囊素的异向电荷吸引，需要根据等电点的差异调节明胶溶液的ph，使明胶分子带正电荷，由于酸法明胶的等电点为6～9，因此ph调节在5.5-6.0之间。碱法明胶的等电点为4.8-5.0，调节碱法明胶溶液的等电点为4.5-4.6之间。加入氯化钠主要是通过减少明胶的极性，减小对内毒素的吸附时明胶与尿囊素的竞争。可选地，所述明胶溶液的浓度为2-10wt％。适宜的明胶溶液浓度有利于提高分离效率，并减少膜过滤补充用水的内毒素残留。明胶浓度过低时，明胶溶液中的尿
囊素溶解量增大，不但使尿囊素用量增加，而且增大了后处理膜过滤时去除尿囊素的负担；明胶浓度过高时，溶液粘度增加，增大了尿囊素与内毒素的结合难度。
17.可选地，所述待处理明胶的内毒素含量为200-20000eu/g。各国药品监察机构对与血液接触的生物制品中的bet含量有十分严格的规定。中国药典2015版、美国药典usp<85>和欧洲药典ph.eur.2.6.14规定，非经肠道给药制剂的内毒素含量必须少于5eu/kg/h，放射性药品注射剂的内毒素限制为2.5eu/kg/h，鞘内注射液的内毒素阈值限制为0.2eu/kg/h。待处理明胶中的内毒素含量限制了其应用，经本发明提供的方法处理后的明胶中内毒素含量可降至200eu/g以下。
18.可选地，所述预处理溶液中氯化钠的浓度为5-50mmol/l；优选地，所述预处理溶液中尿囊素的浓度为1-100g/l。采用氯化钠降低明胶溶液的极性，最佳的浓度为 25mmol/l，此时尿囊素对于内毒素的吸附效率是最高的，再增加nacl浓度不会提高吸附效率，而且会增加后处理膜过滤的负担，氯化钠浓度低于5mmol/l时，浓度过低，对明胶极性改变小，难以提高尿囊素对于内毒素的吸附效率。
19.尿囊素在明胶水溶液中的溶解度为0.5g/l，过量的尿囊素以晶体形式分布在溶液中，并通过搅拌的作用吸附溶液中的内毒素，尿囊素用量过少时，大部分尿囊素溶解，晶体尿囊素量过于少，难以满足对溶液中大量内毒素的吸附。尿囊素用量过大，会导致尿囊素利用率降低，不仅会造成尿囊素的浪费，而且增大了粗分离的负担。
20.可选地，采用尿囊素降低明胶中内毒素方法中采用的水皆为二级纯水，其内毒素含量低于0.05eu/ml。
21.可选地，采用尿囊素降低明胶中内毒素方法中使用的容器经干热法或化学法除去内毒素。
22.为避免容器以及水对明胶中内毒素含量的影响，在降低明胶中内毒素过程中，需要严格限定容器和水内的内毒素含量。其中容器可经干热法或化学法除去内毒素，干热法为将容器在250℃保持30min或者200℃保持60min，化学法为将与胶液接触的容器或设备用0.2m naoh溶液浸泡30～60min，或者用0.2m hcl溶液浸泡30～60min，也可选用相应浓度的koh或者h2so4。
23.可选地，所述过滤过程包括粗滤过程和精滤过程；粗滤过程以棉饼或滤纸为过滤介质，精滤过程以管式膜为过滤介质。
24.可选地，所述管式膜的截留分子量为5000g/mol，其材质为聚醚砜。
25.粗滤过程可以去除不溶的尿囊素晶体，精滤过程则可以截留分离低分子量的氯化钠和尿囊素，实现杂质与明胶的高效分离。
26.为了能够最大限度的减少尿囊素和氯化钠残留，采用膜过滤的方式将分子量为 158g/mol的尿囊素和58g/mol的氯化钠从分子量分布区间为5kg/mol到数千kg/mol 的明胶中分离，并采用3个以上原始体积对浓缩液进行稀释，确保杂质的残留不影响明胶的应用。
27.可选地，所述灭菌方式为闪蒸灭菌，具体为在148℃下保持6-8s。
28.可选地，所述干燥方式为冷冻干燥或者热风干燥。放量制备可以选择小型长网干燥。
29.本发明另一方面提供由上述方法得到的低内毒素明胶的应用。经过本发明中采用尿囊素处理的明胶中内毒素含量低于200eu/g，低于各国药典规定的阈值，可用于制备可吸
收止血海绵、可再生医药、医用辅食等。
30.本发明的有益效果如下：
31.本发明提供的采用尿囊素降低明胶中内毒素的方法，以现有内毒素含量高的明胶为原料，以尿囊素作为内毒素吸附剂，利用氢键与电荷的作用吸附明胶中内毒素，通过调节不同类型明胶吸附前的ph值以及加入氯化钠的方式等工艺，增强内毒素与尿囊素的相互作用，实现了高效去除明胶中内毒素的效果。经该方法处理的明胶中内毒素含量低于200eu/g，且经处理过的明胶性质无显著变化，冻力，粘度，粘降，凝冻点和灰分指标在处理前后改变程度在5％以内，可广泛应用在制备可吸收止血海绵、可再生医药、医用辅食等领域；且该方法工艺过程简单温和，能够实现准工业化水平的放量制备。
具体实施方式
32.为使本发明的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施方式作进一步地详细描述。
33.实施例
34.实施例1
35.降低碱法明胶中内毒素的过程(实验室工艺)：
36.1)所有与明胶溶液接触的不锈钢容器和玻璃仪器用干热法250℃保持30min以去除内毒素；塑料和硅胶管等材料用化学法除内毒素，用0.2m naoh溶液浸泡30min，用二级纯水冲洗至ph为中性；
37.2)将内毒素含量为5000eu/g量级的待处理碱法骨明胶50g溶于950ml二级纯水中，加热并保持在45℃，调节溶液的ph为4.5；
38.3)向上述明胶溶液中加入1.46g nacl，保持45℃，搅拌15min；
39.4)向步骤3)明胶溶液中加入尿囊素20g，在45℃温度下，搅拌孵育30min；
40.5)孵育后的明胶溶液经定性滤纸粗过滤，去除不溶的尿囊素晶体，得到粗滤液；
41.6)将粗滤液通过超滤膜过滤，超滤膜的截留分子量大于等于5000g/mol，胶液浓度浓缩至30％时，加入向浓缩液中补充注射用水1l，浓缩至胶液浓度达到30％时，再加入1l注射用水。至第四次加水后，胶液浓度为30％时，停止浓缩。
42.7)将浓缩胶液闪蒸灭菌，得到灭菌后浓缩胶液；
43.8)将灭菌后浓缩胶液冷冻干燥，得到低内毒素明胶；
44.处理前后的明胶产品见表1。该产品可以作为可吸收止血辅料及可再生医药的原辅料、胃肠道疾病恢复期病人的医用辅食原料。
45.表1 实施例1处理前后明胶的关键技术指标
46.[0047][0048]
实施例2
[0049]
降低碱法明胶中内毒素的过程(工业化工艺)
[0050]
1)所有与明胶溶液接触的不锈钢容器和玻璃仪器用干热法250℃保持30min以去除内毒素；塑料或硅胶管等材料用化学法除内毒素，用0.2m naoh溶液浸泡30min，用二级纯水冲洗至ph为中性；
[0051]
2)将内毒素含量为5000eu/g量级的待处理碱法骨明胶50kg溶于950l二级纯水中，加热并保持在50℃，调节明胶溶液的ph为4.5；
[0052]
3)向上述明胶溶液中加入1.46kg nacl，保持45～55℃，搅拌15min；
[0053]
4)向步骤3明胶溶液中加入尿囊素25kg，在45℃温度下，搅拌孵育30min；
[0054]
5)孵育后的明胶溶液经棉饼粗过滤，去除不溶的尿囊素晶体，得到粗滤液；
[0055]
6)将粗滤液通过超滤膜过滤，超滤膜的截留分子量5000g/mol，胶液浓度浓缩至30％时，加入向浓缩液中补充注射用水1吨，浓缩至胶液浓度达到30％时，再加入1吨注射用水，重复稀释与浓缩，至第五次加水后，待浓缩液浓度达到30％时停止浓缩；
[0056]
7)将浓缩胶液闪蒸灭菌，得到灭菌后浓缩胶液；
[0057]
8)将灭菌后浓缩胶液通过热风干燥，得到低内毒素明胶；
[0058]
处理前后的明胶产品见表2。处理前后的明胶产品见表1。该产品可以作为可吸收止血辅料及可再生医药的原辅料、胃肠道疾病恢复期病人的医用辅食原料。
[0059]
表2.实施例2中处理前后明胶的关键技术指标
[0060][0061][0062]
实施例3
[0063]
降低酸法明胶中内毒素的过程(实验室工艺)：
[0064]
1)所有与明胶溶液接触的不锈钢容器和玻璃仪器用干热法250℃保持30min以去
除内毒素；塑料和硅胶管等材料用化学法除内毒素，用0.2m naoh溶液浸泡30min，用二级纯水冲洗至ph为中性；
[0065]
2)将内毒素含量为20000eu/g量级的待处理酸法骨明胶50g溶于2.5l二级纯水中，加热并保持在45℃，调节溶液的ph为5.8；
[0066]
3)向上述明胶溶液中加入1.46g nacl，保持50℃，搅拌15min；
[0067]
4)向步骤3明胶溶液中加入尿囊素50g，在50℃温度下，搅拌孵育30min；
[0068]
5)孵育后的明胶溶液经定性滤纸粗过滤，去除不溶的尿囊素晶体，得到粗滤液；
[0069]
6)将粗滤液通过超滤膜过滤，超滤膜的截留分子量大于等于5000g/mol，胶液浓度浓缩至30％时，加入向浓缩液中补充注射用水1l，至胶液浓度达到30％时，再加入 1l注射用水。至第五次加水后，胶液浓度为30％时，停止浓缩。
[0070]
7)将浓缩胶液闪蒸灭菌，得到灭菌后浓缩胶液；
[0071]
8)将灭菌后浓缩胶液冷冻干燥，得到低内毒素明胶；
[0072]
处理前后的明胶产品见表3。该产品可以作为可吸收止血辅料及可再生医药的原辅料、胃肠道疾病恢复期病人的医用辅食原料。
[0073]
表3.实施例3中处理前后明胶的关键技术指标
[0074]
明胶指标处理前处理后内毒素(eu/g)1.84
×
104175冻力(bloom g)210205粘度(mpa
·
s)4.784.69粘度下降(％)2.82.5凝胶点(℃)(10％浓度)27.226.9灰分(％)0.70.5水分(％)10.84.7
[0075]
对比例1
[0076]
降低碱法明胶中内毒素的过程：
[0077]
1)所有与明胶溶液接触的不锈钢容器和玻璃仪器用干热法250℃保持30min以去除内毒素；塑料和硅胶管等材料用化学法除内毒素，用0.2m naoh溶液浸泡30min，用二级纯水冲洗至ph为中性；
[0078]
2)将内毒素含量为5000eu/g量级的待处理碱法骨明胶50g溶于350ml二级纯水中，加热并保持在65℃，调节溶液的ph为4.5；
[0079]
3)向上述明胶溶液中加入1.46g nacl，保持65℃，搅拌15min；
[0080]
4)向步骤3)明胶溶液中加入尿囊素20g，在65℃温度下，搅拌孵育30min；
[0081]
5)孵育后的明胶溶液经定性滤纸粗过滤，去除不溶的尿囊素晶体，得到粗滤液；
[0082]
6)将粗滤液通过超滤膜过滤，超滤膜的截留分子量大于等于5000g/mol，胶液浓度浓缩至30％时，加入向浓缩液中补充注射用水1l，浓缩至胶液浓度达到30％时，再加入1l注射用水。至第四次加水后，胶液浓度为30％时，停止浓缩。
[0083]
7)将浓缩胶液闪蒸灭菌，得到灭菌后浓缩胶液；
[0084]
8)将灭菌后浓缩胶液冷冻干燥，得到低内毒素明胶；
[0085]
处理前后的明胶产品见表4。处理过程中明胶溶液浓度为12.5％，处理后明胶中内
毒素为580eu/g，远高于实施例1，且由于处理温度高，明胶的冻力和粘度有明显下降。
[0086]
表4 对比例1中处理前后明胶的关键技术指标
[0087]
明胶指标处理前处理后内毒素(eu/g)5230580冻力(bloom g)230195粘度(mpa
·
s)4.684.32粘度下降(％)2.53.9凝胶点(℃)(10％浓度)27.526.2灰分(％)0.80.4水分(％)11.25.4
[0088]
对比例2
[0089]
降低碱法明胶中内毒素的过程：
[0090]
1)所有与明胶溶液接触的不锈钢容器和玻璃仪器用干热法250℃保持30min以去除内毒素；塑料和硅胶管等材料用化学法除内毒素，用0.2m naoh溶液浸泡30min，用二级纯水冲洗至ph为中性；
[0091]
2)将内毒素含量为5000eu/g量级的待处理碱法骨明胶50g溶于950ml二级纯水中，加热并保持在45℃，调节溶液的ph为4.5；
[0092]
3)向上述明胶溶液中加入1.46g nacl，保持45℃，搅拌15min；
[0093]
4)向步骤3)明胶溶液中加入尿囊素0.7g，在45℃温度下，搅拌孵育30min；
[0094]
5)孵育后的明胶溶液经定性滤纸粗过滤，去除不溶的尿囊素晶体，得到粗滤液；
[0095]
6)将粗滤液通过超滤膜过滤，超滤膜的截留分子量大于等于5000g/mol，胶液浓度浓缩至30％时，加入向浓缩液中补充注射用水1l，浓缩至胶液浓度达到30％时，再加入1l注射用水。至第四次加水后，胶液浓度为30％时，停止浓缩。
[0096]
7)将浓缩胶液闪蒸灭菌，得到灭菌后浓缩胶液；
[0097]
8)将灭菌后浓缩胶液冷冻干燥，得到低内毒素明胶；
[0098]
处理前后的明胶产品见表4。处理过程中，尿囊素加入量低于1g/l，处理后明胶中内毒素为4120eu/g，远高于实施例1。
[0099]
表5 对比例2处理前后明胶的关键技术指标
[0100]
明胶指标处理前处理后内毒素(eu/g)52304120冻力(bloom g)230227粘度(mpa
·
s)4.684.60粘度下降(％)2.52.凝胶点(℃)(10％浓度)27.527.3灰分(％)0.80.4水分(％)11.25.5
[0101]
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发
明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。