一株海洋放线菌及其应用的制作方法

1.本发明属于海洋放线菌资源开发与利用领域，具体涉及一株海洋放线菌及其应用。


背景技术：

2.恶性肿瘤是全世界一个主要的致死病种，据世界卫生组织报道，2012年全世界因恶性肿瘤死亡的人次达820万，预计恶性肿瘤病例将持续迅猛增长，将逐年递增至2025年1900万人，2035年达2400万人。肿瘤严重威胁人类生命健康，而现有大多化学药物在治疗疾病的同时，不仅仅杀伤肿瘤细胞，正常细胞也收到严重的伤害，从而使患者产生了严重的不良反应。因此，寻求一类高效、低毒的抗肿瘤药物迫在眉睫，将有助于提高用药安全性和有效性。
3.海洋环境具有高盐度、高压、低温和寡营养等不同于陆地环境的特点，孕育了富饶的生物资源。海洋生物在新陈代谢、生存方式、信息传递和适应机制等方面具有显著的特点。而作为海洋物种多样性关键组成部分的海洋微生物，在长期的生物进化过程中也产生了与陆生生物不同的基因多样性和代谢多样性，提高了海洋微生物产生结构新颖且活性良好的药物先导化合物的几率。其中，作为海洋微生物重要成员之一的海洋放线菌能产生种类多样且活性独特的次级代谢产物，一直被认为是海洋来源天然产物的重要生产者。海洋放线能够产生与陆地微生物不同的代谢途径和机体防御机制，这对发现新型药物先导化合物、研究药物作用新机理、新靶点等具有重要的意义。


技术实现要素：

4.本发明提供了一种海洋放线菌。
5.本发明还提供了该海洋放线菌的筛选方法和应用。
6.本发明的目的是通过如下技术方案实现的：本发明提供了一株海洋放线菌，所述海洋放线菌为变异链霉菌（streptomyces variabilis）hn42，于2020年1月25日于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号: cgmcc no. 21736。
7.本发明还提供了一种海洋放线菌的筛选方法，包括以下步骤：（1）将土壤样品室温下放置14~21 d进行风干，将土壤样品用无菌生理盐水进行系列稀释，浓度分别为10
‑1~10
‑3，不同浓度稀释液分别取100 μl涂布于高氏一号培养基中；（2）将采用高氏一号培养基对筛选出的放线菌进行分离纯化，纯化出的放线菌
‑
80℃保存。
8.进一步的，所述高氏一号培养基中加入重铬酸钾及萘啶酮酸，终浓度分别为75 μg/ml及25 μg/ml，28℃培养14~28 d。
9.本发明还提供了一种利用上述海洋放线菌提取抗肿瘤活性物质的方法，包括以下步骤：
a 将海洋放线菌hn42接种于液体豆饼粉培养基，摇床培养，得到种子液；b 将步骤（1）中的种子液接种于豆饼粉固体培养基中，培养7天，将培养基切成碎块用提取液进行提取；c 将步骤（2）收集的提取物采用乙酸乙酯相与ddh2o萃取至水相无色，得到乙酸乙酯相，萃取后将乙酸乙酯相旋蒸后溶95%甲醇用石油醚进行萃取，萃取后甲醇相旋蒸得到抗肿瘤活性物质。
10.进一步的，步骤（a）中，所述海洋放线菌hn42在液体豆饼粉培养基中的接种量为8%；所述液体豆饼粉培养基配方为：可溶性淀粉4g，豆饼粉25g，葡萄糖5g，酵母膏5g，mgso4·
7h2o 0.5g，k2hpo4·
3 h2o 0.5g，caco31g，天然海水1l，ph7.2
‑
7.4；所述摇床培养为28℃、180 r/min摇床培养2天。
11.进一步的，步骤（b）中，所述种子液的接种量为8%；所述豆饼粉固体培养基配方为：可溶性淀粉4g，豆饼粉25g，葡萄糖5g，酵母膏5g，mgso4·
7h2o 0.5g，k2hpo4·
3h2o 0.5g，caco31g，琼脂20g,天然海水1l，ph7.2
‑
7.4；所述培养为28℃培养7天。
12.进一步的，步骤（c）中，所述乙酸乙酯相为乙酸乙酯：甲醇：冰乙酸=80：15：5。
13.本发明还提供了一种上述海洋放线菌在提取抗肿瘤活性物质中的应用。
14.菌种保藏信息保藏时间：2020年1月25日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：cgmcc no. 21736，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101分类命名：变异链霉菌 streptomyces variabilis本发明的有益效果为：（1）本发明提供的筛选出的海洋变异链霉菌hn42抗肿瘤活性好，菌株海洋变异链霉菌hn42对于宫颈癌hela细胞具有明显的抑制作用，抑菌效果显著，具有广阔的应用前景。
15.（2）本发明筛选出的菌株海洋变异链霉菌hn42具有旺盛的生长能力，可大批发酵应用于多个领域。
附图说明
16.图1为菌株hn42系统发育分析图。
17.图2为菌株hn42的菌落形态。
18.图3为变异链霉菌hn42抗肿瘤活性物质对hela细胞存活率影响图。
具体实施方式
19.下面通过具体的实施方式对本发明的技术方案作进一步的解释和说明。
20.本发明筛选的海洋变异链霉菌hn42取样地点位于中国海口东寨港红树林。
21.实施例1土壤样品室温下放置21 d进行风干，随后用4种不同的培养基对样品进行海洋放线菌的筛选，筛选培养基配方见表1。土壤样品用无菌生理盐水进行系列稀释，浓度分别为
10
‑1~10
‑3。不同浓度稀释液分别取100 μl涂布于不同的筛选培养基（所有筛选培养基分别加入重铬酸钾及萘啶酮酸，终浓度分别75 μg/ml及25 μg/ml，28℃培养28 d。挑取单菌落做进一步的纯化，分离单菌落所用的培养基为高氏一号培养基。连续进行3次划线以纯化出单一菌落，得到菌株hn42。
22.表1 海洋放线菌筛选培养基配方实施例2海洋放线菌hn42的16s rdna鉴定：16s rdna序列扩增及测序：采用阳性细菌基因组试剂盒提取基因组dna。
23.引物序列上游：5
’‑
agagtttgatcctggctcag
‑3’
，下游：5
’‑
aaggaggtgatccagccgca
‑3’
。
24.表2 pcr体系表3 pcr反应条件
pcr反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳检测，以检验是否提取出目的基因组dna。琼脂糖凝胶配方为:琼脂糖0.25 mg、1
×
tae 25ml 、gelred 2.5ul。电泳条件为:120 v、20min。确定目标条带无拖尾现象后送公司进行测序。菌株序列ncbi上进行核苷酸序列blast比对后，发现与变异链霉菌（streptomyces variabilis）相似性达到99%。菌株hn42系统发育分析如图1所示。
25.实施例3海洋变异链霉菌hn42发酵及抗肿瘤活性物质的制备：采用培养基组成为：可溶性淀粉4g，豆饼粉25g，葡萄糖5g，酵母膏5g，mgso4
·
7h2o 0.5g，k2hpo4
·
3 h2o 0.5g，caco31g，天然海水1l，ph7.2
‑
7.4。变异链霉菌液按照8%的接种量接种于豆饼粉固体培养基中，28℃培养7天，菌株hn42的菌落形态如图2所示；将培养基切成2.2cm
×
2cm的琼脂块，放入锥形瓶中，并倒入1000ml的提取液（乙酸乙酯：甲醇：冰乙酸=80：15：5），将收集的乙酸乙酯相ⅰ与ddh2o萃取至水相无色，得到乙酸乙酯相ⅱ，萃取后将乙酸乙酯相ⅱ旋蒸，溶于95%甲醇后与等体积石油醚进行萃取，至石油醚相无色后萃取结束，甲醇相经旋转蒸发得到最终抗肿瘤活性物质。
26.实施例4收集对数生长期的hela细胞，调节细胞悬液浓度（5
×
104/ml），加入96孔板中，每孔100μl，每板设置空白组、对照组和实验组。将96孔板在37℃，5% co2，饱和湿度的环境中培养24h后，向实验组的孔中加入5 μl的样品作用24 h，然后再向各孔中加入15 μl mtt溶液，继续培养4
‑
5 h。吸出上清液，向每孔中加入100 μl dmso，避光充分震荡5 min。最后根据酶标仪测定的各孔溶液在570 nm处的吸光度，按照以下公式对细胞相对存活率进行计算：公式中asample代表实验组在570 nm处的吸光度，ablank和acontrol分别代表空白组和对照组在570 nm处的吸光度。
27.由图3可知，海洋变异链霉菌hn42抗肿瘤活性物质对hela的ic
50
为5.88 μg/ml。