一种体外肠道活体培养的3D打印培养槽、培养体系及检测系统和应用的制作方法

一种体外肠道活体培养的3d打印培养槽、培养体系及检测系统和应用
技术领域
1.本发明属于肠道体外活体培养技术领域，具体涉及一种体外肠道活体培养的3d打印培养槽、培养体系及检测系统和应用。


背景技术：

2.目前研究表明，肠道作为体内“免疫
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代谢
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微生态菌群”的重要交互枢纽，参与调控机体系统性能量代谢平衡。在肠道中，粘蛋白层(mucus layer)构成第一道屏障，隔离肠道中的菌群与肠道上皮，如果粘蛋白层屏障遭到破坏，会导致严重的炎症性肠炎，并进一步发展为肠癌。与此同时，粘蛋白层屏障破坏会直接导致肠道菌群的失衡，从而进一步导致机体其他器官受损并诱发疾病(如阿尔兹海默症，肝脏的胆汁酸淤积等)。尽管目前临床和科研上都认识到粘蛋白层对于肠道稳态的重要性，但目前技术上无法在体内直接对肠道粘蛋白层屏障进行动态监测，因此，建立肠道体外肠道培养及检测体系对于基础研究和临床上治疗肠道稳态失衡诱发的相关疾病至关重要。


技术实现要素：

3.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种体外肠道活体培养的3d打印培养槽、培养体系及检测系统和应用，可实现对肠道体内情况的高精度模拟，极大提高肠道动态实时监测能力和检测精准度，解决了目前肠道无法实现快速实时检测肠道病理、生理状态的难题。
4.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
5.本发明提供了一种体外肠道活体培养的3d打印培养槽，所述3d打印培养槽包括可拆卸连接的培养槽底座和上盖，所述培养槽底座内包括若干供肠道体外培养的培养内槽；在每个所述培养内槽的宽边的两端各含有2个营养供给管道；
6.在所述培养槽底座的宽边两端各含有1个气体交流管；
7.所述上盖包括与所述气体交流管相对应的空槽。
8.优选的，所述3d打印培养槽的材质包括光敏生物树脂。
9.优选的，所述营养供给管道的内径均为1mm，外径均为3mm，所述2个营养供给管道包括1个肠道内腔连接管道和1个培养内槽连接管道。
10.优选的，所述培养槽底座的总长度为140mm，宽为100mm，高为12mm，中间设置有6个培养内槽；
11.所述上盖的总长度为140mm，宽为104mm，高为17mm；
12.所述培养内槽的宽为20mm，高为10mm。
13.本发明还提供了上述3d打印培养槽在构建体外活体肠道培养体系和实时监测体系中的应用。
14.本发明还提供了一种体外活体肠道培养体系的构建方法，包括以下步骤：无菌取出活体肠道后，分别与上述3d打印培养槽的营养供给管道连接，供给营养液形成循环；
15.在所述3d打印培养槽的两侧分别连接两台高精度蠕动泵，分别控制肠道内腔的营养液和培养内槽的营养液的循环；所述肠道内腔的营养液的流速为100μl/h，所述培养内槽的营养液的流速为1ml/h；
16.在所述3d打印培养槽一端，通过气体交流管接入医用级95％o2/co2气体混合物。
17.优选的，所述营养液以rpmi 1640培养基为基础培养基，还包括以下体积百分含量的组分：20％胎牛血清、2％b
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27补充剂、2％n
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2补充剂、1％谷氨酰胺、1％hepes和1％氨基酸混合物。
18.本发明还提供了利用上述构建方法得到的体外活体肠道培养体系，对所述活体肠道体外培养时间达到72h。
19.本发明还提供了上述3d打印培养槽或上述体外活体肠道培养体系在制备肠道功能动态监测系统中的应用。
20.本发明还提供了一种肠道功能动态监测系统，所述系统包括上述3d打印培养槽或上述体外活体肠道培养体系、肠道透明化深度成像元件和结果展示元件。
21.有益效果：本发明提供了一种体外肠道活体培养的3d打印培养槽，并基于所述3d打印培养槽构建了体外活体肠道培养体系和肠道功能动态监测系统。本发明通过高精度蠕动泵控制培养液的流速，确保肠道能够在体外正常培养时间达到72h。本发明通过3d打印制作的培养槽，在培养过程中不破坏肠道原有的结构，最大程度模拟体内的肠道环境，并且可以通过改变培养槽的内槽数量，可以快速，低成本实现个性化需求。本发明所述3d打印培养槽可最大程度的保留肠道原有的结构和肠腔内含物，很好的在体外模拟体内的生理环境。同时，利用透明化结合深度成像技术，对肠道实现实时动态检测，极大提高了动态监测能力和精确度。利用本发明所述3d打印培养槽、体外活体肠道培养体系和肠道功能动态监测系统解决了目前肠道无法实现快速实时检测肠道病理、生理状态的难题。
附图说明
22.图1为3d打印培养槽的结构示意图；
23.图2为肠道功能动态监测系统的示意图；从左到右依次为体外活体肠道培养体系、肠道透明化深度成像处理和组织透明化技术、深度成像及三维重构结果的展示；
24.图3为体外活体肠道培养检测系统的有效性及准确性验证实验和结果。
具体实施方式
25.本发明提供了一种体外肠道活体培养的3d打印培养槽，所述3d打印培养槽包括可拆卸连接的培养槽底座和上盖，所述培养槽底座内包括若干供肠道体外培养的培养内槽；在每个所述培养内槽的宽边的两端各含有2个营养供给管道；
26.在所述培养槽底座的宽边两端各含有1个气体交流管；
27.所述上盖包括与所述气体交流管相对应的空槽。
28.本发明所述3d打印培养槽的结构如图1所示由两部分组成：培养槽底座(basebord)和上盖(cover)，且所述培养槽底座和上盖的材质优选均为光敏生物树脂。本发明所述光敏生物树脂的具体种类并没有特殊限定，优选包括甲基丙烯酰化明胶、甲基丙烯酰化透明质酸或甲基丙烯酰化丝素蛋白，本发明实施例中以购自苏州智能制造研究院的甲
基丙烯酰化明胶为光敏生物树脂进行所述3d打印培养槽的制备，具有操作简单，优异的生物相容性，以及良好的可打印性等优点本发明所述3d打印培养槽具有很好的生物相容性，在培养过程中不会出现对培养基的污染情况，并且该培养槽可以重复使用，极大的提高了肠道体外培养的稳定性，并降低使用成本。
29.本发明在每个培养内槽的宽边的两端各设置2个营养供给管道，所述营养供给管道的内径优选均为1mm，外径优选均为3mm。在本发明中，所述2个营养供给管道优选包括1个肠道内腔连接管道和1个培养内槽连接管道，为方便分辨，实物中特用颜色进行区分，如黄色的连接肠道内腔，用于向肠道内腔供给营养，绿色的直接通向培养内槽，用于向肠道外部供给营养。
30.本发明在培养槽底座的宽边两端各设置1个气体交流管，所述气体交流管的内径优选为1mm，外径优选为3mm，用于连接o2/co2混合气体，以此维持培养槽内部ph以及氧气的供给。本发明所述o2/co2混合气体优选为医用级95％o2/co2气体混合物。
31.本发明对所述3d打印培养槽的大小并没有特殊限定，可依据实验需求进行扩大或缩小，在本发明实施例中，选用包含6个培养内槽的所述培养槽底座的3d打印培养槽进行研究，所述3d打印培养槽的总长度优选为140mm，宽为100mm，高为12mm；所述上盖的总长度优选为140mm，宽为104mm，高为17mm，与之对应的，所述培养内槽的宽为20mm，高为10mm。本发明在所述上盖的两侧分别留有与培养槽底座两侧管道相对应的空槽，从而在盖上上盖的状态下，整个培养槽是相对封闭的，同时不影响培养底座与外部循环系统的管道连接。
32.本发明还提供了上述3d打印培养槽在构建体外活体肠道培养体系和实时监测体系中的应用。
33.利用3d打印技术设计的3d打印培养槽，适用于不同动物种类来源的肠道活体培养体系，具有较高生物相容性和安全性，可根据需求实现多肠道样本的同时培养检测，具有高通量，低成本，安全的优点；能够保证肠道体外培养高程度模拟体内环境，不破坏肠道本身结构，不破坏肠道原有菌群，具有高还原度，高稳定性的优点。
34.本发明还提供了一种体外活体肠道培养体系的构建方法，包括以下步骤：无菌取出活体肠道后，分别与上述3d打印培养槽的营养供给管道连接，供给营养液形成循环；
35.在所述3d打印培养槽的两侧分别连接两台高精度蠕动泵，分别控制肠道内腔的营养液和培养内槽的营养液的循环；所述肠道内腔的营养液的流速为100μl/h，所述培养内槽的营养液的流速为1ml/h；
36.在所述3d打印培养槽一端，通过气体交流管接入医用级95％o2/co2气体混合物。
37.本发明对所述活体肠道的来源并没有特别限定，优选包括小鼠、兔或人。本发明优选通过无菌手术的方式取出活体肠道后，放置于3d打印培养槽内，通过手术缝合线与培养槽内的肠道内腔连接管道固定；并在所述3d打印培养槽两侧分别连接两台高精度蠕动泵，分别控制肠道内腔营养液(internal culture medium，流速100μl/h)和培养槽营养液(external culture medium，流速1ml/h)的循环；同时在所述3d打印培养槽的一端，接入加湿过滤后的医用级95％o2/co2气体混合物。
38.本发明所述营养液优选以rpmi 1640培养基为基础培养基，还包括以下体积百分含量的组分：20％胎牛血清、2％b
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27补充剂、2％n
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2补充剂、1％谷氨酰胺、1％hepes和1％氨基酸混合物。本发明所述氨基酸混合物优选购自sigma，货号为：r7131。
39.本发明还提供了利用上述构建方法得到的体外活体肠道培养体系，对所述活体肠道体外培养时间可达72h。利用本发明所述体外活体肠道培养体系，可最大程度的保留肠道原有的结构和肠腔内含物，能够保证肠道体外培养高程度模拟体内环境，不破坏肠道本身结构，不破坏肠道原有菌群，具有高还原度，高稳定性的优点，能够很好的在体外模拟体内的生理环境。
40.本发明还提供了上述3d打印培养槽或上述体外活体肠道培养体系在制备肠道功能动态监测系统中的应用。
41.本发明所述动态监测优选包括与肠道生理活性相关的动态监测，更优选包括肠道粘蛋白层的动态监测、肠道菌群或肠道培养上清中代谢物的检测、不同来源的肠道体外培养及检测以及食物或化妆品等的特定菌株对肠道的影响检测。
42.本发明还提供了一种肠道功能动态监测系统，所述系统包括上述3d打印培养槽或上述体外活体肠道培养体系、肠道透明化深度成像元件和结果展示元件。
43.本发明所述肠道动能动态监测系统优选如图2所示，从左到右依次为体外活体肠道培养体系、肠道透明化深度成像处理和组织透明化技术、深度成像及三维重构结果的展示。本发明所述3d打印培养槽或上述体外活体肠道培养体系优选与上述相同，在此不再赘述。
44.本发明所述肠道透明化深度成像元件优选包括肠道透明化深度成像处理的装置，将培养后的肠道组织去除两端固定操作过的部分，纵向剪开后平铺开，并放入一个提前制作好的载玻片上。本发明所述载玻片优选由3部分组成：底部的载玻片，中间为一个定制的中空不锈钢垫片(stainless steel square holder，中间的空洞大小为10mm长，8mm宽，深度为300μm，用于放置平铺的肠道组织)以及最上面的盖玻片(coverslip，大小为长25mm，宽25mm，用于封闭中间不锈钢垫圈中的组织和液体)。
45.本发明所述结果展示元件优选包括通过组织透明化技术(tissue ultrafast optical clearing)、深度成像(3d scanning imaging)和三维重构(3d reconstruction)显示结果的硬件或软件，从而实现对肠道各项参数的可视化检测。
46.在本发明实施例中，通过透明化深度成像技术(fast
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optical clearing method)，对不同生理病理状态下的肠道进行粘蛋白层的动态监测。通过体外培养的肠道，纵向打开后，压平在滤纸上，立即固定在carnoy缓冲液中1min；组织滤纸一起包括在24孔板，持续固定4h，然后改为无水乙醇，脱水4h。再进行免疫荧光染色，用凝集素(uea
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1)标记粘蛋白。样品在focm试剂中[30％(wt/vol)尿素，20％(wt/vol)d
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山梨糖醇，5％(wt/vol)甘油溶解于dmso中]中孵育3分钟。将组织移到固定器中，用尼康a1r共聚焦显微镜进行三维成像，使用imaris软件进行表面分析。从而实现对肠道粘蛋白层的动态变化的检测。
[0047]
下面结合实施例对本发明提供的一种体外肠道活体培养的3d打印培养槽、培养体系及检测系统和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0048]
实施例1
[0049]
精准测量及计算离体肠道培养所需培养腔室的大小和孔径，利用autocad设计3d模型(图1)，利用光敏生物树脂在基于投影技术的3d生物打印机进行打印直接构建肠道培养的培养槽(culture chamber)：该培养槽分为两部分：培养槽底座(basebord)和上盖(cover)。培养底座总长140mm，宽100mm，高12mm，中间有6个培养内槽，每个培养内槽宽
20mm，高10mm，每个培养槽可以供给一个肠道体外培养。每个培养内槽两端各有2个管道(内径1mm，外径3mm)，其中黄色的连接肠道内腔，用于给以肠道内腔营养，绿色的直接通向培养内槽，用于给以肠道外部营养。培养底座两端各有一个管道(内径1mm，外径3mm)，用于连接o2/co2混合气体，以此维持培养槽内部ph以及氧气的供给。上盖总长140mm，宽104mm，高17mm，并且在两侧分别留有与培养底座两侧管道相对应的空槽，从而在盖上上盖的状态下，整个培养槽是相对封闭的，同时不影响培养底座与外部循环系统的管道连接。
[0050]
营养液温度由恒温加热平台控制，使其在30min内稳定在37℃。使用高精度蠕动泵(内循环培养液：100μl/h；外部培养基：1ml/h)。为了保持培养环境的ph值和更好的培养环境，将医用级95％o2/co2气体混合物加湿过滤后进入培养室中。营养液包含rpmi 1640培养基，添加20％胚胎牛血清，22％b
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27补充剂、2％n
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2补充剂，1％谷氨酰胺，1％hepes和1％氨基酸混合物。通过高精度蠕动泵控制营养液的流速，确保肠道能够在体外正常培养时间达到72h。
[0051]
通过透明化深度成像技术(fast
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optical clearing method)，对不同生理病理状态下的肠道进行粘蛋白层的动态监测。通过体外培养的肠道，纵向打开后，压平在滤纸上，立即固定在carnoy缓冲液中1min；组织滤纸一起包括在24孔板，持续固定4h，然后改为无水乙醇，脱水4h。再进行免疫荧光染色，用凝集素(uea
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1)标记粘蛋白。样品在focm试剂中[30％(wt/vol)尿素，20％(wt/vol)d
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山梨糖醇，5％(wt/vol)甘油溶解于dmso中]中孵育3分钟。将组织移到固定器中，用尼康a1r共聚焦显微镜进行三维成像，使用imaris软件进行表面分析。从而实现对肠道粘蛋白层的动态检测。
[0052]
利用两种公认的能影响肠道粘蛋白层厚度的实验处理(抗生素处理(antibiotic treated，abx)以及基因x敲除小鼠(该基因是公认的在小鼠体内对于肠道粘蛋白层的形成具有重要作用))对本发明所构建的体外活体肠道培养检测系统的有效性及准确性进行验证。同时还利用了目前已知的多种可能可以刺激肠道分泌粘蛋白的刺激物，革兰氏阴性菌细胞壁的脂多糖(lps)，革兰氏阳性菌来源的脂磷壁酸(lta)，肠道菌群的代谢物牛磺酸(taurine)，肠道典型共生菌——脆弱拟杆菌(bacteroidesfragilis)，肠道益生菌——两歧双歧杆菌(bifidobacterium bifidum)。
[0053]
图3中a为实验设计模式图，利用对照小鼠和基因x敲除的小鼠，分别给以两种小鼠pbs和抗生素处理(抗生素处理2周可以基本去除小鼠肠道中的菌群，从而导致肠道粘蛋白层厚度明显下降)，然后分别将上述小鼠的结肠手术取出后，利用本发明设计制作的体外培养检测系统，检测以上刺激物以及基因敲除对肠道粘蛋白层厚度的影响。
[0054]
本发明的粘蛋白层厚度的动态检测结果如图3中b和c所示，对照小鼠在没有抗生素处理时具有完整的粘蛋白层，在抗生素处理后粘蛋白层被明显破坏，同时厚度明显下降。抗生素处理后，在经肠道内腔的营养液中加入lps，牛磺酸，以及培养后的脆弱拟杆菌都能明显的提高肠道粘蛋白层的厚度。与此同时，基因x敲除小鼠的本底的粘蛋白层就是不完整的，在各种刺激下也未出现明显变化。以上实验表明，本发明设计的体外活体肠道培养检测系统具有优秀的肠道粘蛋白层动态检测能力，并且能够很好的实现不同基因背景来源的肠道培养检测，同时还能模拟包括但不限于肠道菌群代谢物，特定肠道菌株定植，细菌自体来源的物质等对于肠道粘蛋白层的影响。同时能够直观并准确的还原肠道粘蛋白层的真实状态。
[0055]
图3中d检测了该实验过程中的培养液中乳酸脱氢酶(ldh)的含量，该指标被公认作为细胞死亡的检测标志物。图3中e检测了培养过程中培养液中的il
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1b和il
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18，该两个指标是公认作为肠道炎症的细胞因子。上述实验结果表明本发明所培养的肠道在长时间培养和刺激过程在具有良好的稳定性及生物安全性。
[0056]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。